董甲慶，范麗，李凱旋，陳玉林

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科1、消化科2、檢驗(yàn)科3、營(yíng)養(yǎng)科4，陜西 西安 710038

目前臨床用于治療潰瘍的藥物應(yīng)用最廣泛的是雷尼替丁。該藥具有速效和長(zhǎng)效的特點(diǎn)，對(duì)胃及十二指腸潰瘍的療效很高，能有效抑制各類刺激引起的胃酸分泌及基礎(chǔ)胃酸分泌，是一種強(qiáng)效組胺H2受體拮抗劑，阻斷組胺與胃黏膜壁細(xì)胞上的H2受體結(jié)合，降低胃酶的活性，同時(shí)抑制胃蛋白酶的分泌，但對(duì)胃泌素及性激素的分泌不產(chǎn)生影響[1]。主要用于胃及十二指腸潰瘍、反流性食管炎、手術(shù)后潰瘍、胃泌素瘤及其它胃酸分泌性疾病的治療，也可用于預(yù)防應(yīng)激性潰瘍。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，雷尼替丁聯(lián)合其他藥物在治療幽門螺桿菌陽(yáng)性的十二指腸潰瘍、蕁麻疹和腦出血后應(yīng)激性潰瘍等方面效果明顯要優(yōu)于其他同類藥物。其作用迅速、藥效良好、價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)使得雷尼替丁在臨床上使用廣泛[2]。

雷尼替丁口服吸收效果不受食物和抗酸藥的影響，存在首過(guò)效應(yīng)，生物利用度為50%。單次口服雷尼替丁0.15 g后1～3 h達(dá)峰，峰濃度(Cmax)為400～500 ng/mL，表觀分布容積約為1.9 L/kg，作用可維持8～12 h，血漿蛋白結(jié)合率約為15%。在體內(nèi)分布廣泛，能透過(guò)血-腦屏障。其半衰期為2～3 h，腎功能不全時(shí)，半衰期會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng)。大部分以原型藥形式經(jīng)腎排泄，腎臟清除率為7.2 mL/(kg·min)，30%經(jīng)肝內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為S-氧化物、N-氧化物和去甲基雷尼替丁。

雷尼替丁臨床常見不良反應(yīng)有頭暈、頭痛、惡心、乏力、皮疹、便秘等；少數(shù)患者服藥后有肝功能輕度損傷現(xiàn)象，停藥后癥狀即消失。其對(duì)中樞神經(jīng)、性腺功能和腎功能不良反應(yīng)較輕微。

目前關(guān)于血漿中雷尼替丁的測(cè)定方法有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、微透析一毛細(xì)管電泳聯(lián)用技術(shù)等[3-9]。HPLC因其方法簡(jiǎn)單，相比于LC-MS其儀器要求低，方便操作，在定量分析方面足以滿足生物樣品分析要求，因此本研究擬采用標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低定量限、回收率、批間和批內(nèi)精密度、穩(wěn)定性等參數(shù)對(duì)HPLC法檢測(cè)血漿中雷尼替丁濃度的準(zhǔn)確性及可靠性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100)；紫外檢測(cè)器(G1314A VWD)；MILLIPORE超純水機(jī)(美國(guó)MILLIPORE公司)；5804R高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；XS105DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。鹽酸雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100163-201006)；甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100191-200606)；色譜純?yōu)榧状?，其他試劑均為分析純?/p>

1.2 色譜條件及樣品處理

1.2.1 分析方法及色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 m)；流動(dòng)相：甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液-三乙胺(12.5：87.5：0.06，V/V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；流速為1.2 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：30 L；內(nèi)標(biāo)：10μg/mL甲硝唑。

1.2.2 血漿樣品處理 吸取血漿樣品200μL，加入甲硝唑20μL，10μg/mL混勻，再加入10%高氯酸100 μL，渦旋振蕩1 min，然后14 000 r/min離心5 min，取上層清液150μL轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶進(jìn)樣，30 L分析。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 儲(chǔ)備液制備 精密稱取鹽酸雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)品11.16 mg(約相當(dāng)于雷尼替丁10.00 mg)，用甲醇/水(50/50)定容至10 mL，即得雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL)，置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。精密稱取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇/水(50/50)定容至10 mL，即得甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.5 mg/mL)，置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 專屬性實(shí)驗(yàn) 專屬性是指生物樣品中存在的其他成分在分析檢測(cè)過(guò)程中不干擾樣品的檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確、專一的檢測(cè)樣品。本試驗(yàn)收集了6個(gè)不同來(lái)源的血漿對(duì)雷尼替丁是否存在干擾進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本試驗(yàn)條件下，雷尼替丁和內(nèi)標(biāo)甲硝唑相互無(wú)干擾，6個(gè)不同來(lái)源的血漿中雜質(zhì)不干擾樣品峰，測(cè)定條件下雷尼替丁和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為9.363 min和10.79 min，說(shuō)明該方法專屬性較高。在此條件下所測(cè)得的結(jié)果能代表待測(cè)成分濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)定的血藥濃度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用DAS3.2.6軟件非房室模型法計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，繪制色譜曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 血漿中雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線反映的是所測(cè)定樣品濃度與儀器響應(yīng)值之間的關(guān)系，一般用回歸方程及相關(guān)系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線高低濃度范圍為定量范圍。本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：25 000 ng/mL、20 000 ng/mL、10 000 ng/mL、5 000 ng/mL、2 000 ng/mL、1 000 ng/mL、500 ng/mL，分別吸取工作液20μL，加空白人血漿180μL使其中雷尼替丁濃度為2 500 ng/mL、2 000 ng/mL、1 000 ng/mL、500 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)品。按“血漿樣品處理”項(xiàng)下處理后，在“分析方法及色譜條件”下，以血漿中雷尼替丁的濃度值為橫坐標(biāo)，待測(cè)化合物與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比(Area Ratio)為縱坐標(biāo)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線中各濃度點(diǎn)的樣本，記錄樣品峰面積，作直線回歸(加權(quán)系數(shù)為Quadratic(Amnt))，得到雷尼替丁回歸方程為：y=1.374 802 92x+0.007 277 1(r=0.998 80)，見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線中雷尼替丁與內(nèi)標(biāo)峰面積比值與濃度

2.2 最低定量限實(shí)驗(yàn) 定量下限表示測(cè)定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度，是指標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，即LLOQ。應(yīng)滿足測(cè)定3～5個(gè)消除半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度或能檢測(cè)出Cmax的1/10～1/20時(shí)的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)中取180μL空白人血漿，加入雷尼替丁(500 ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)工作液20μL，使雷尼替丁濃度為50 ng/mL，按“血漿樣品處理”進(jìn)行操作，記錄樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算兩者比值，依照標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算相應(yīng)的藥物濃度，以此為最低定量限(LLOQ)指標(biāo)。結(jié)果見表2及圖1。

表2 雷尼替丁的血漿最低定量限試驗(yàn)(n=5)

圖1最低定量限色譜圖

2.3 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 精密度是指在確定的分析條件下，相同介質(zhì)中濃度樣品的一系列測(cè)量值的分散程度。通常用質(zhì)控樣品的批間和批內(nèi)RSD來(lái)考察方法的精密度。準(zhǔn)確度是指在確定的分析條件下，測(cè)得的生物樣品濃度與真實(shí)濃度的接近程度(即質(zhì)控樣品的實(shí)測(cè)濃度與真是濃度的偏差)，重復(fù)測(cè)定已知濃度分析物樣品可獲得準(zhǔn)確度。首先精密吸取雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：1 000 ng/mL、5 000 ng/mL、20 000 ng/mL，分別精密吸取工作液20μL加入空白人血漿180μL，使其中雷尼替丁的濃度為100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)品。按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，記錄樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算兩者比值，代入同一條標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算相應(yīng)的藥物濃度，以此為批間和批內(nèi)變異指標(biāo)。測(cè)得血漿中批內(nèi)變異和3個(gè)分析批的批間變異，見表3、表4。

2.4 回收率測(cè)定 分析物的提取回收率是以生物樣本基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值除以純標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的響應(yīng)值，檢測(cè)高中低三個(gè)濃度的提取回收率，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)精密和可重現(xiàn)。按要求測(cè)定低、中、高(100 ng/mL、500 ng/mL、2000 ng/mL)3個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣品各5份，按上述“血漿樣品處理”方法處理后，得到樣品峰面積A1，同時(shí)用流動(dòng)相稀釋配制成與血漿質(zhì)控樣品理論進(jìn)樣溶液相同濃度的溶液進(jìn)樣分析，得到樣品峰面積A2；以A1/A2的比值求算雷尼替丁的絕對(duì)回收率，見表5。

表3 雷尼替丁的血漿方法學(xué)批內(nèi)精密度試驗(yàn)(n=5)

表4 雷尼替丁的血漿方法學(xué)批間精密度試驗(yàn)(n=15)

表5 血漿中雷尼替丁絕對(duì)回收率

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 樣品穩(wěn)定性應(yīng)根據(jù)不同存放條件即在室溫、冰凍或凍融條件下進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)，以確定生物樣品的存放條件及時(shí)間。

2.5.1 血漿凍融穩(wěn)定性 取180μL空白人血漿，加入不同濃度的雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)液20μL，使其中雷尼替丁的濃度為100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)品，放置-40℃冰箱保存，待凍結(jié)后室溫解凍，如此重復(fù)3次后測(cè)定血漿中藥物濃度，見表6。

2.5.2 血漿樣品8 h放置穩(wěn)定性 取180μL空白人血漿，加入不同濃度的雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)液20μL，使其中雷尼替丁的濃度均為100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)品，室溫放置8 h后測(cè)定血漿中藥物濃度，見表7。

2.5.3 血漿樣品處理后24 h放置穩(wěn)定性考察 取180μL空白人血漿，加入不同濃度雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)工作液20μL，使其中雷尼替丁的濃度為100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)品，按“血漿樣品處理”進(jìn)行操作，將樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器(室溫)中放置24 h后進(jìn)行分析檢測(cè)，見表8。

表6 雷尼替丁的血漿樣品凍融穩(wěn)定性考察試驗(yàn)(n=5)

表7 血漿樣品室溫8 h放置雷尼替丁的穩(wěn)定性考察試驗(yàn)(n=5)

表8 雷尼替丁血漿處理樣品自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)24 h放置穩(wěn)定性考察試驗(yàn)(n=5)

3 討論

本文使用方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低定量限、回收率、批間和批內(nèi)精密度、穩(wěn)定性等指標(biāo)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定血漿中雷尼替丁濃度的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)6個(gè)不同來(lái)源的血漿中雜質(zhì)不干擾樣品峰，而測(cè)定條件下雷尼替丁和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為9.4 min和10.8 min，說(shuō)明該方法專屬性較高，在此條件下所測(cè)得的結(jié)果能代表待測(cè)成分濃度。使用雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白血漿制備不同濃度的血漿保準(zhǔn)品，得出血漿雷尼替丁濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.374 802 92x+0.007 277 1(r=0.998 80)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到雷尼替丁的血漿最低定量限為50 ng/mL。接著由高中低三個(gè)濃度質(zhì)控血漿樣樣品峰面積與用流動(dòng)相稀釋配制成與血漿質(zhì)控樣品峰面積的比值，計(jì)算得到雷尼替丁的絕對(duì)回收率為90.2%～94.1%。對(duì)高中低三個(gè)濃度批間和批內(nèi)精密度測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果，雷尼替丁的日間和日內(nèi)RSD均小于10%，可證明HPLC測(cè)定雷尼替丁濃度準(zhǔn)確可靠。血漿樣品的凍融穩(wěn)定性、8 h室溫放置穩(wěn)定性、血漿處理樣品24 h放置穩(wěn)定性試驗(yàn)均未見雷尼替丁樣品發(fā)生明顯降解，符合生物樣品的分析要求。

通過(guò)對(duì)HPLC測(cè)定血漿中雷尼替丁濃度的方法學(xué)驗(yàn)證，可以得出本文中所建立的方法學(xué)科學(xué)可靠，能夠準(zhǔn)確測(cè)定雷尼替丁濃度的結(jié)論。