劉俊峰, 李 茫, 王子龍, 何旭江, 曾志將,*
(1. 江西農(nóng)業(yè)大學蜜蜂研究所, 南昌 330045; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所, ???571101)
蜜蜂是研究行為的良好模式生物,其具有豐富的行為特征和可塑性。自從2006年蜜蜂基因組成功測序后(Honey Bee Genome Sequencing Consortium, 2006),蜜蜂就被作為連接基因與復雜行為的動物模型。蜜蜂交尾行為是其復雜行為之一。雄蜂唯一的生物學職責是與處女蜂王交配(曾志將, 2017)。在空中追逐處女蜂王的飛行雄蜂與正常有王蜂群內(nèi)的爬行雄蜂同樣受到蜂王上顎腺信息素(queen mandibular pheromone, QMP)影響,但是它們的行為表現(xiàn)不同。在戶外飛行的性成熟雄蜂能被處女蜂王或QMP混合物所吸引(Loperetal., 1993; Brockmannetal., 2006),而在蜂群內(nèi)的性成熟雄蜂卻回避處女蜂王(Ohtani and Fukuda, 1977; Graham, 2015)。目前,雄蜂識別QMP的生理調(diào)控機理尚不清晰。
雄蜂擁有高度特化和極其靈敏的嗅覺識別系統(tǒng)。雄蜂觸角的主要嗅覺感器——板形感器約有18 000個,數(shù)量約是工蜂的7倍(Sandozetal., 2007)。嗅覺板形感器中識別氣味的功能性外周蛋白主要由氣味結合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、氣味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)和氣味受體(odorant receptors, ORs)等組成(Vosshalletal., 1999; Hallemetal., 2004)。其中,ORs以數(shù)量多、特異性強的特征受到了學者們廣泛的關注與研究(Forêt and Maleszka, 2006; Robertson and Wanner, 2006; Li Zetal., 2012; Li Hetal., 2013; 趙慧婷等, 2015; 張中印等, 2016; 杜亞麗等, 2017; 楊樂等, 2017, 2018)。從東方蜜蜂Apiscerana和西方蜜蜂Apismellifera中已鑒定出的ORs分別為119和170個(Robertson and Wanner, 2006; Parketal., 2015),遠遠超過黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的62個ORs (Clyneetal., 1999; Vosshalletal., 1999)、岡比亞按蚊Anophelesgambiae的79個ORs(Hilletal., 2002)及家蠶Bombyxmori的48個ORs(Wanneretal., 2007a),這也表明蜜蜂的嗅覺更為發(fā)達。Wanner等(2007b)研究發(fā)現(xiàn)候選性信息素受體(sex pheromone receptors, PRs)基因Or10,Or11,Or18和Or170在西方蜜蜂雄蜂觸角中高度表達,并證實Or11為反式-9-氧代-2-癸烯酸[(E)-9-oxodec-2-enoic acid, 9-ODA]的專一性受體。但蜜蜂ORs分別發(fā)揮何種機能的研究鮮有報道。Liu等(2019)利用RT-PCR技術對東方蜜蜂AcOr11基因克隆基礎上,使用qRT-PCR技術鑒定其在飛行回巢與蜂箱內(nèi)爬行狀態(tài)下的表達特性,提示了雄蜂大腦中Or11基因表達可能與婚飛行為有關。雖然目前Or10,Or18和Or170基因暫未鑒定出其功能,但我們推測這3個氣味受體基因與性信息素受體基因Or11功能相似,并且可能在雄蜂識別QMP與婚飛過程中發(fā)揮作用。因此,以中華蜜蜂A.c.cerana(簡稱“中蜂”)和意大利蜜蜂A.m.ligustica(簡稱“意蜂”)性成熟的飛行與爬行雄蜂為研究材料,通過qRT-PCR技術檢測分析QMP與9-ODA對中蜂、意蜂雄蜂候選性信息素受體基因Or10,Or11,Or18和Or170的mRNA表達量的影響,以探索雄蜂對QMP的生理調(diào)控機制,從而為揭示雄蜂婚飛行為提供理論依據(jù)。
試驗蜂群是由江西農(nóng)業(yè)大學蜜蜂研究所按活框飼養(yǎng)技術進行飼養(yǎng)的中華蜜蜂、意大利蜜蜂。試驗選取蜂群遺傳性狀、群勢基本相近的4群中蜂和4群意蜂。試驗時間為2019年6-8月。
培育適齡性成熟雄蜂:將4張中蜂、意蜂空雄蜂巢脾各插入4群中蜂、意蜂蜂群內(nèi),控制蜂王產(chǎn)卵24 h后繼續(xù)留置原群培育孵化,待雄蜂出房前24 h置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱至羽化出房,使用4種不同顏色水性記號筆分別標記4蜂群各300頭雄蜂,并放回原蜂群發(fā)育成熟。
收集適齡性成熟雄蜂:為了符合雄蜂生物學習性,行為學試驗時間選在天氣晴朗下午13∶00-16∶00時雄蜂飛行高峰期間,收集性成熟雄蜂(14 d)。使用50 mL離心管分別在蜂箱巢門口抓取已標記顏色、飛行回巢的性成熟雄蜂(簡稱“飛行雄蜂”),以及在蜂箱內(nèi)壁上抓取已標記顏色、巢內(nèi)爬行的性成熟雄蜂(簡稱“爬行雄蜂”)。
主要試劑: 9-ODA, 9-HDA, HOB(Contech, 加拿大);TransZol up試劑盒、GelStain 熒光核酸染色試劑和6×DNA Loading Buffer(北京全式金公司);無水乙醇、異丙醇和氯仿(西隴化工,分析純);UltraPureTM瓊脂糖、TBE Buffer及DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen); PrimeScript RT Reagent Kit反轉錄試劑盒、DNA Marker DL2000和熒光定量試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTM(TaKaRa)。
本試驗使用信息素QMP與9-ODA分別刺激中蜂和意蜂性成熟雄蜂。將收集待測1.1節(jié)中的中蜂和意蜂性成熟雄蜂置于測試室適應環(huán)境5 min左右。測試室環(huán)境為紅光暗室,行為學測試時間:13∶00-16∶00時,測試室內(nèi)溫度25±1℃,相對濕度75%±5%。測試信息素QMP[9-ODA(7.04 μg/μL)+9-羥基-2-癸烯酸(9-hydroxydec-2-enoic acid, 9-HDA)(1.26 μg/μL)+對羥基苯甲酸甲酯(methylp-hydroxybenzoate, HOB, 0.03 μg/μL)]和9-ODA(7.04 μg/μL)氣流由Y型嗅覺儀(基管長30 cm,兩臂長35 cm,內(nèi)徑5 cm,兩臂夾角75°, 南昌大學玻璃儀器廠)樣品瓶流向雄蜂釋放管一端,雄蜂由飛行通道逆風飛入樣品瓶。在氣流進入樣品瓶之前,由空氣泵推動空氣先經(jīng)過活性碳過濾和蒸餾水加濕,空氣泵流速為300 mL/min。測試信息素QMP與9-ODA成分含量參考Plettner等(1997),即每頭性成熟西方蜜蜂處女蜂王含約70.4 μg 9-ODA, 12.6 μg 9-HDA, 0.3 μg HOB。
處理組在Y型嗅覺儀左右2個測試室中均放入滴有5 μL信息素乙醇溶液的濾紙;空白對照組在Y型嗅覺儀左右2個測試室中均放入滴有5 μL乙醇溶液的濾紙。每次試驗僅測試1頭中蜂雄蜂或意蜂雄蜂,將離心管置于Y型管基臂端釋放雄蜂,信息素刺激5 min后抓取雄蜂裝入EP管,迅速放入液氮中速凍,轉至-80℃冰箱保存,用于提取RNA。測定時每處理分4組,每組8頭重復。測試完一組試驗后清洗Y型管,先使用蒸餾水清洗,然后75%酒精擦拭,再使用蒸餾水沖洗,最后用電吹風吹干后進行下一組試驗。
將1.3節(jié)處理的雄蜂從液氮中取出,使用干凈鑷子及刀片剝離頭部1對完整觸角,裝入1.5 mL RNase-free EP管,每組各收集8頭雄蜂的8對觸角為1個待測樣品,迅速放入液氮中速凍,再轉至-80℃冰箱保存,用于提取RNA。
將剝離觸角后剩余的雄蜂頭部放于置于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)(含137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)中。使用干凈鑷子及刀片去除頭部外殼和復眼組織,迅速裝入1.5 mL RNase-free EP管,放入液氮中速凍,每組各收集8頭雄蜂的8對腦部組織為1個待測樣品,再轉至-80℃冰箱保存,用于提取RNA。
將采集得到的觸角及腦部待測樣品,分別按照TransZol up試劑盒的操作說明提取RNA,并用分光光度計測量、瓊脂糖凝膠電泳檢測每個樣品的RNA濃度及質量。每個RNA樣品取1 μg按照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄,將反轉錄的cDNA放置-20℃冰箱保存,用于qRT-PCR檢測。
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢及比對出中蜂氣味受體基因AcOr10(GenBank登錄號: MF693365),AcOr11(GenBank登錄號: MG793195),AcOr18(中蜂轉錄組中比對AmOr18序列),AcOr170(GenBank登錄號: KX264359)和意蜂氣味受體基因AmOr10 (GenBank登錄號: NM_001242961.1),AmOr11 (GenBank登錄號: NM_001242962.1),AmOr18 (GenBank登錄號: XM_003250678.2),AmOr170 (GenBank登錄號: NM_001242993.1)。分別以Ac-β-actin(GenBank登錄號: HM_640276.1)和Am-β-actin(GenBank登錄號: NM_001185146.1)作為中蜂、意蜂氣味受體基因表達量檢測的內(nèi)參基因,使用Primer Premier 5.0軟件設計qRT-PCR引物序列(引物由上海生工公司合成),引物序列如表1所示。
表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR
采用2-ΔΔCt方法統(tǒng)計中蜂、意蜂各基因的相對表達量,使用SPSS 17.0 軟件中one-way ANOVA與t檢驗方法比較分析,P<0.05表示差異顯著。通過GraphPad Prism 5.2軟件進行作圖。
結果表明,QMP和9-ODA處理組的飛行(圖1: A)與爬行(圖1: B)中蜂雄蜂觸角中4個氣味受體基因的mRNA表達量均顯著低于對照組的(P<0.05);9-ODA處理組中飛行中蜂雄蜂觸角中AcOr18和AcOr170的mRNA表達量顯著低于QMP處理組中的(P<0.05, 圖1: A);9-ODA處理組爬行中蜂雄蜂觸角中AcOr11與AcOr170的mRNA表達量顯著低于QMP處理組的(P<0.05, 圖1: B)。
圖1 QMP和9-ODA處理后飛行(A)和爬行(B)中蜂雄蜂觸角中AcOrs的表達量Fig. 1 Epression levels of AcOrs in the antennae of flying (A) and crawling (B) drones of Apis cerana cerana exposed to QMP and 9-ODA Blank: 空白對照(乙醇)Blank control (ethanol); QMP: 蜂王上顎腺信息素,1處女蜂王QMP當量包括反式-9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA, 70.4 μg)+9-羥基-2-癸烯酸(9-HDA, 12.6 μg)+對羥基苯甲酸甲酯(HOB, 0.3 μg) An equivalent of virgin queen mandibular pheromone including (E)-9-oxodec-2-enoic acid (9-ODA, 70.4 μg)+9-hydroxydec-2-enoic acid (9-HDA, 12.6 μg)+methylp-hydroxybenzoate (HOB, 0.3 μg). 下圖同The same for the followingFigures. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤;柱上星號表示組間基因表達量差異顯著(P<0.05, one-way ANOVA); 圖3, 5和7同。Data in theFigure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference in the gene expression level between groups (P<0.05, one-way ANOVA). The same forFigs. 3, 5 and 7.
由圖2結果可知,在QMP或9-ODA處理下,爬行中蜂雄蜂觸角中4個AcOrs基因的表達量均與飛行中蜂雄蜂觸角中的沒有顯著差異(P>0.05)。
圖2 QMP (A)和9-ODA (B)對飛行與爬行中蜂雄蜂觸角中AcOrs表達量的影響Fig. 2 Effects of QMP (A) and 9-ODA (B) on the expression levels of AcOrs in the antennae of flying and crawling drones of Apis cerana cerana 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤;柱上星號表示組間基因表達量差異顯著(P<0.05, t檢驗);圖4, 6和8同。Data in theFigure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference in the gene expression level between groups (P<0.05, t-test). The same forFigs. 4, 6 and 8.
結果表明,QMP和9-ODA處理組的飛行中蜂雄蜂大腦中AcOr11,AcOr18和AcOr170基因的表達量均顯著低于對照組的(P<0.05, 圖3: A);9-ODA處理組飛行中蜂雄蜂大腦中AcOr170的表達量顯著低于QMP處理組大腦中的(P<0.05, 圖3: A);而QMP和9-ODA處理組均與對照組飛行中蜂雄蜂大腦中的AcOr10基因表達量沒有顯著差異(P>0.05, 圖3: A)。
圖3 QMP和9-ODA處理后飛行(A)和爬行(B)中蜂雄蜂大腦中AcOrs的表達量Fig. 3 Expression levels of AcOrs in the brains of flying (A) and crawling (B) drones of Apis cerana cerana exposed to QMP and 9-ODA
由圖3(B)結果可知,QMP和9-ODA處理組爬行中蜂雄蜂大腦中AcOr11和AcOr170基因的表達量均顯著低于對照組的(P<0.05);QMP與9-ODA處理組中蜂雄蜂大腦中AcOr11和AcOr170的表達量沒有顯著差異(P>0.05);而QMP和9-ODA處理組與對照組的爬行中蜂雄蜂大腦中AcOr10及AcOr18基因表達量相比差異不顯著(P>0.05)。
由圖4可知,在QMP處理下,爬行中蜂雄蜂大腦中AcOr11和AcOr170基因的表達量均顯著低于飛行中蜂雄蜂大腦中的(P<0.05, 圖4: A),而爬行與飛行中蜂雄蜂大腦中AcOr10和AcOr18基因的表達量沒有顯著差異(P>0.05, 圖4: A);在9-ODA處理下,爬行中蜂雄蜂大腦中AcOr11基因的表達量均顯著低于飛行中蜂雄蜂大腦中的(P<0.05, 圖4: B),爬行中蜂雄蜂大腦中AcOr18基因的表達量均顯著高于飛行中蜂雄蜂大腦中的(P<0.05, 圖4: B),而爬行與飛行中蜂雄蜂大腦中AcOr10和AcOr170基因的表達量沒有顯著差異(P>0.05, 圖4: B)。
圖4 QMP (A)和9-ODA (B)對飛行與爬行中蜂雄蜂大腦中AcOrs表達量的影響Fig. 4 Effects of QMP (A) and 9-ODA (B) on the expression levels of AcOrs in the brains of flying and crawling drones of Apis cerana cerana
結果表明,QMP和9-ODA處理組飛行(圖5: A)與爬行(圖5: B)意蜂雄蜂觸角中AmOr10和AmOr11基因的表達量均顯著低于對照組的(P<0.05);而處理組與對照組相比,其飛行(圖5: A)與爬行(圖5: B)意蜂雄蜂觸角中AmOr18及AmOr170基因表達量均沒有顯著差異(P>0.05)。
圖5 QMP和9-ODA處理后飛行(A)和爬行(B)意蜂雄蜂觸角中AmOrs的表達量Fig. 5 Expression levels of AmOrs in the antennae of flying (A) and crawling (B) drones of Apis mellifera ligustica exposed to QMP and 9-ODA
由圖6可知,在QMP或9-ODA處理下,爬行意蜂雄蜂觸角中AmOr170基因的表達量均顯著高于飛行意蜂雄蜂觸角中的(P<0.05),而爬行與飛行意蜂雄蜂觸角中AmOr10,AmOr11和AmOr18基因的表達量沒有顯著差異(P>0.05)。
圖6 QMP (A)和9-ODA (B)對飛行與爬行意蜂雄蜂觸角中AmOrs表達量的影響Fig. 6 Effects of QMP (A) and 9-ODA (B) on the expression levels of AmOrs in the antennae of flying and crawling drones of Apis mellifera ligustica
由圖7(A)可知,QMP與9-ODA處理組飛行意蜂雄蜂大腦中AmOr11,AmOr18及AmOr170基因的表達量均顯著低于對照組的(P<0.05),而處理組與對照組相比,其飛行意蜂雄蜂大腦中AmOr10基因的表達量沒有顯著差異(P>0.05);QMP處理組意蜂雄蜂大腦中AmOr18的表達量顯著低于9-ODA處理組意蜂雄蜂大腦中的(P<0.05)。由圖7(B)可知,QMP與9-ODA處理組爬行意蜂雄蜂大腦中AmOr11及AmOr170基因的表達量均顯著低于對照組雄蜂大腦中的(P<0.05),而處理組與對照組相比,其爬行意蜂雄蜂大腦中AmOr10和AmOr18基因的表達量沒有顯著差異(P>0.05)。
圖7 QMP和9-ODA處理后飛行(A)和爬行(B)意蜂雄蜂大腦中AmOrs的表達量Fig. 7 Expression levels of AmOrs in the brains of flying (A) and crawling (B) drones of Apis mellifera ligustica exposed to QMP and 9-ODA
由圖8可知,在QMP處理下,爬行意蜂雄蜂大腦中AmOr10和AmOr18基因的表達量均顯著高于飛行意蜂雄蜂大腦中的(P<0.05, 圖8: A),而爬行與飛行意蜂雄蜂大腦中AmOr11和AmOr170基因的表達量沒有顯著差異(P>0.05, 圖8: A);在9-ODA處理下,爬行與飛行意蜂雄蜂大腦中4個AmOrs基因的表達量沒有顯著差異(P>0.05, 圖8: B)。
性信息素受體在昆蟲兩性交流中發(fā)揮重要作用,雄蟲能長距離地識別性成熟雌蟲釋放的性信息素,來尋找配偶并與之交配(Brockmannetal., 2006; Becheretal., 2010; Anderssonetal., 2014, 2016)。候選性信息素受體基因Or10,Or11,Or18和Or170在蜜蜂雄蜂觸角中高表達,其中Or11特異性識別9-ODA(Wanneretal., 2007b)。
本研究發(fā)現(xiàn)QMP和9-ODA均能抑制Or11基因在中蜂雄蜂與意蜂雄蜂觸角中的轉錄表達(圖1, 3, 5和7)。這與斜紋夜蛾Spodopteralitura受性信息素處理后與未處理相比,其氣味受體基因Or3,Or13和Or54表達下調(diào)結果(林欣大等, 2015)相似。蜜蜂氣味受體與學習記憶有著密切的關系。訓練工蜂對芳樟醇(linalool)和9-ODA進行喙伸反應(proboscis extension reflex, PER)嗅覺學習后,其對應的氣味受體基因Or151與Or11轉錄水平均下調(diào),且觸角電位(electroantennography, EAG)反應也隨之降低(Claudianosetal., 2014)。這一研究報道與本試驗結果一致。蜜蜂對食物氣味的聯(lián)想記憶能力非常突出(Menzel and Muller, 1996; Giurfa, 2007),微弱熟悉的氣味吹入蜂巢內(nèi)足以觸發(fā)蜜蜂相關的視覺和嗅覺刺激的跨模式回憶,引誘蜜蜂搜尋食物來源(Reinhardetal., 2004a, 2004b, 2006)。蜜蜂為了適應外界不斷變化的氣味環(huán)境,在成功學習了某種氣味后,會相應地減少該氣味受體表達,并上調(diào)其他氣味受體表達以確保能繼續(xù)靈敏地察覺、識別新的氣味;在食物源消失或不再加強氣味記憶時,蜜蜂氣味受體的表達水平也將波動(Menzel and Muller, 1996)。本研究發(fā)現(xiàn),中蜂雄蜂與意蜂雄蜂腦部組織中Or11基因的表達量也在9-ODA刺激后降低,這可能是Or11識別9-ODA后在蜜蜂大腦神經(jīng)傳導中繼續(xù)發(fā)揮重要作用。昆蟲觸角中氣味受體特異性結合在氣味受體神經(jīng)元(olfaction receptor neurons, ORNs)的細胞膜上,ORNs的功能取決于ORs的功能,相似的ORNs的軸突會聚集到昆蟲中腦部嗅覺神經(jīng)中樞——觸角葉(antennal lobe, AL)內(nèi)一個或幾個定型的嗅神經(jīng)球(glomeruli)上(Strausfeld, 2009),其中雄蜂AL中宏嗅神經(jīng)球(macroglomeruli 2, MG2)特異性應答9-ODA(Sandoz, 2006),最終MG2通過投射神經(jīng)元(projection neurons, PNs)將嗅覺信息傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)——蘑菇體(mushroom body, MB)產(chǎn)生指令后做出相應的行為反應(Hansson and Stensmyr, 2011)。Or11具體在雄蜂腦部哪些神經(jīng)組織中表達分布仍不清楚,需要進一步研究探索。
值得注意的是,在QMP或9-ODA刺激下,飛行中蜂雄蜂大腦中AcOr11基因的表達量顯著高于爬行中蜂雄蜂大腦中的(圖4),而飛行與爬行中蜂雄蜂觸角中AcOr11基因的表達沒有顯著差異(圖2)。這與性成熟時期中蜂雄蜂觸角與大腦中AcOr11基因表達特性的結果(Liuetal., 2019)相似。我們推測,中蜂雄蜂腦組織中的氣味受體AcOr11參與交配行為的調(diào)節(jié)。雄蜂在蜂群內(nèi)、外同樣能感知QMP,而其反應卻截然不同。性成熟雄蜂在蜂群內(nèi)不能與處女蜂王交配,雄蜂更多地集中在蜜粉脾、蜂箱內(nèi)壁及底部等遠離蜂王的位置(Ohtani and Fukuda, 1977),而戶外飛行中的雄蜂能被處女蜂王或人工合成的QMP與9-ODA引誘追逐(Brockmannetal., 2006)。黑腹果蠅D.melanogaster通過調(diào)整嗅覺神經(jīng)元性信息素受體的表達,以提高其對性信息素反應的靈敏性(Graham, 2015)。交配行為能抑制雄性小地老虎Agrotisipsilon對性信息素的嗅覺神經(jīng)生理反應(Gadenneetal., 2001)。
本研究還發(fā)現(xiàn),中蜂雄蜂觸角AcOr18和AcOr170基因受QMP或9-ODA刺激后表達顯著下調(diào)(圖1),而意蜂雄蜂觸角AmOr18和AmOr170基因的mRNA表達量不受QMP影響(圖5)。這可能是由于Or18與Or170在中蜂、意蜂雄蜂觸角中分布水平存在差異,致使該受體基因表達量也不同。蜜蜂感受蜂王信息素的嗅覺感器主要為板形感受器(趙慧婷等, 2019),其在意蜂雄蜂觸角上的分布數(shù)量約為中蜂雄蜂的2.5倍(宋飛飛, 2011)。因此,我們推測中蜂雄蜂通過板形感受器表達出更多氣味受體以應答性信息素,而意蜂雄蜂進化出更多的板形感受器來應對其對蜂王信息素的識別。此外QMP刺激后中蜂、意蜂在大腦中Or170表達特性與Or11一致,可能提示Or170也參與大腦組織對QMP識別過程。對Or170如何識別具體的蜂王性信息素成分或參與調(diào)控哪些氣味受體,還需要進一步研究。
本研究通過對中蜂、意蜂雄蜂候選性信息素受體基因表達特性的研究,為探究雄蜂嗅覺識別機制以及婚飛行為研究提供了理論基礎。本研究原計劃取在空中追逐處女蜂王的飛行的性成熟雄蜂,由于很難尋找到處女蜂王交配的雄蜂聚集區(qū),也嘗試過用遙控無人機在空中取飛行雄蜂樣品,都沒有成功。后來是在巢門中取標記飛行回巢的14日齡性成熟雄蜂,但這種性成熟雄蜂與空中追逐處女蜂王的飛行雄蜂的生理以及信息素受體基因表達差異,目前沒有報道,還有待于以后深入對比分析。