楊雪嬌, 張 蔓, 江宇航, 唐啟河, 張棋麟,*, 林連兵, 陳均遠(yuǎn)

(1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 昆明 650500; 2. 云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心, 昆明 650500; 3. 中國(guó)科學(xué)院南京地質(zhì)古生物研究所, 南京 210008; 4. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210023)

嗅覺(jué)是昆蟲(chóng)食物選擇、求偶、交配及產(chǎn)卵等各種行為的基礎(chǔ)，對(duì)其種群生存、繁衍有重要作用(Fieldetal., 2001; Sato and Touhara, 2009; Zhangetal., 2015; Gadenneetal., 2016)。昆蟲(chóng)觸角上著生許多嗅覺(jué)感器且有各種嗅覺(jué)蛋白，不同的感器和嗅覺(jué)蛋白可識(shí)別不同的氣味物質(zhì)進(jìn)而調(diào)控昆蟲(chóng)的行為活動(dòng)(Brownetal., 2013; 鄭海霞等, 2018)。目前，昆蟲(chóng)觸角中研究最為廣泛的嗅覺(jué)相關(guān)蛋白主要包括：氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, OBP)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein, CSP)、嗅覺(jué)/氣味受體(olfactory odorant receptor, OR)、離子型受體(ionotropie receptor, IR)、味覺(jué)受體(gustatory receptor, GR)和昆蟲(chóng)感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)六大類(lèi)(Leal, 2013; Zhangetal., 2016; Wang Jetal., 2017)。當(dāng)前，基于昆蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組學(xué)挖掘嗅覺(jué)相關(guān)基因已經(jīng)被廣泛開(kāi)展。Zhang等(2016)從美國(guó)白蛾Hyphantriacunea觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定了124個(gè)嗅覺(jué)相關(guān)基因，主要包括OR, OBP和CSP基因等，并分析了OBP和CSP基因的表達(dá)模式。Jia等(2016)采用了相似的研究策略鑒定了桃蛀螟Conogethespunctiferalis雌雄成蟲(chóng)觸角中的嗅覺(jué)相關(guān)基因，并對(duì)呈性別差異表達(dá)的嗅覺(jué)相關(guān)基因進(jìn)行了鑒定。有研究從云南同域生境下云南松毛蟲(chóng)Dendrolimushoui和思茅松毛蟲(chóng)D.kikuchii觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定了一批嗅覺(jué)相關(guān)基因，進(jìn)行了屬內(nèi)和目間比較和基因表達(dá)水平分析，探討了基因功能的潛在相似性(Zhangetal., 2014)。然而，迄今為止未見(jiàn)從嗅覺(jué)相關(guān)基因的角度探討其在不同食性昆蟲(chóng)中的差異。昆蟲(chóng)觸角嗅覺(jué)相關(guān)基因是否是其食性分化的主要因素，昆蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)量及不同食性昆蟲(chóng)間基因數(shù)量差異對(duì)了解昆蟲(chóng)間食性分化能提供什么信息等，都是有待探討的問(wèn)題。

瓢蟲(chóng)是鞘翅目(Coleoptera)瓢蟲(chóng)科(Coccinellidae)昆蟲(chóng)的總稱(chēng)，涵蓋90個(gè)屬超過(guò)1 000個(gè)種(Escalonaetal., 2017)，其中七星瓢蟲(chóng)Coccinellaseptempunctata隸屬瓢蟲(chóng)亞科(Coccinellinae)，是以蚜蟲(chóng)為主食的捕食性昆蟲(chóng)(Van der Werfetal., 2000)。瓢蟲(chóng)科昆蟲(chóng)已經(jīng)被廣泛地用于科學(xué)研究，主要集中在食性可塑性的發(fā)育、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳、鞘翅顏色多樣化和捕食性(天敵)瓢蟲(chóng)對(duì)其他害蟲(chóng)的生物防治等(Escalonaetal., 2017; Matsubayashietal., 2017; Saitoetal., 2017; Tangetal., 2017)。值得注意的是，科內(nèi)高度的食性分化是瓢蟲(chóng)科的一大特征(Escalonaetal., 2017)，大部分瓢蟲(chóng)都是以捕食蚜蟲(chóng)(如棉蚜Aphisgossypii, 大豆蚜A.glycines, 蘿卜蚜Lipaphiserysimi等)、蚧殼蟲(chóng)、鱗翅目幼蟲(chóng)、葉螨類(lèi)和真菌孢子為主的捕食性瓢蟲(chóng)。另外，還有少部分種類(lèi)為植食性瓢蟲(chóng)，主要包括草食性的食植瓢蟲(chóng)亞科(Epilachninae)，以花粉和蔬菜等為食，多數(shù)為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，如茄二十八星瓢蟲(chóng)Henosepilachnaviginyioctopunctata等(龐虹, 2002; Zhangetal., 2018)。

為了探索昆蟲(chóng)觸角嗅覺(jué)相關(guān)基因在昆蟲(chóng)食性分化中的地位及角色，本研究以捕食性七星瓢蟲(chóng)為研究對(duì)象，運(yùn)用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，采用生物信息學(xué)方法對(duì)其基因功能注釋?zhuān)⒙?lián)合我們以前測(cè)序的植食性茄二十八星瓢蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組鑒定并比較各類(lèi)型嗅覺(jué)相關(guān)基因占嗅覺(jué)相關(guān)基因總數(shù)的比例。研究結(jié)果將加深對(duì)瓢蟲(chóng)食性分化分子基礎(chǔ)的了解，也為瓢蟲(chóng)科天敵利用和害蟲(chóng)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)

七星瓢蟲(chóng)雌雄成蟲(chóng)采自廣西壯族自治區(qū)北海市(海拔10 m, 109°08′E, 21°25′N(xiāo))。為了避免局部環(huán)境的差異，七星瓢蟲(chóng)分別采集于不同的3個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)相距至少30 km以上。因七星瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)特征明顯，種類(lèi)鑒定簡(jiǎn)單易行，野外鑒定帶回實(shí)驗(yàn)室后，選取活動(dòng)能力較強(qiáng)的七星瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)200頭，切下觸角，經(jīng)液氮速凍，后保存于-80℃超低溫冰箱(Thermo Scientific, 美國(guó))待用。

1.2 總RNA提取

采用RNeasy Mini Kit(天根, 北京)試劑盒分別提取供試雌雄七星瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)各100頭觸角總RNA。經(jīng)NanoDrop? ND1000(Thermo Scientific, 美國(guó))核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，并采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100(安捷倫科技, 美國(guó))精確檢測(cè)RNA的完整性。等量混合合格的雌雄七星瓢蟲(chóng)觸角總RNA為一個(gè)混池，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

合格的七星瓢蟲(chóng)觸角總RNA使用DNase I(Qiagen, 德國(guó))消化殘余基因組DNA后，按照Preparing Samples for Sequencing of mRNA試劑盒說(shuō)明書(shū)(Illumina, 美國(guó))構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。具體步驟：用帶有Oligo(dT)的磁珠富集總RNA池中的mRNA；加入打斷試劑后于Thermomixer C(Eppendorf, 德國(guó))中適溫將mRNA打斷成短片段(200～400 bp)，以打斷后的mRNA短片段為模板合成cDNA第1鏈，隨后在DNA polymerase I體系下，以dNTPs 為原料合成cDNA第2條鏈，并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、cDNA的3′末端加上堿基A并連接接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer(安捷倫科技, 美國(guó))和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, 美國(guó))質(zhì)檢，合格后使用HiSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)(Illumina, 美國(guó))的PE150 bp雙向測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)組裝及完整性評(píng)估

利用Trimmomatic v0.39(Bolgeretal., 2014)軟件對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭序列以及低質(zhì)量reads，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(clean data)，具體步驟如下: (1)去除包含接頭的reads(接頭污染)；(2)去除未知堿基N含量大于5%的reads；(3)去除低質(zhì)量的reads(質(zhì)量值低于15的堿基占該reads總堿基數(shù)的比例大于30%的reads為低質(zhì)量的reads)。利用Trinity軟件對(duì)clean data進(jìn)行序列拼接與組裝。然后，去除長(zhǎng)度小于150 bp的序列，并通過(guò)CD-HIT軟件包(http:∥www.bioinformatics.org/cd-hit/)中的CD-HIT-EST子程序?qū)nigenes以95%的相似性進(jìn)行聚類(lèi)，并選取最長(zhǎng)的序列為每一個(gè)聚類(lèi)簇的代表，以去除unigenes的冗余，最終獲得高質(zhì)量的七星瓢蟲(chóng)觸角unigenes集。使用BUSCO(Benchmarking Universal Single Copy Orthologs)v3軟件于默認(rèn)參數(shù)下，將最終組裝獲得的unigenes通過(guò)與insecta_odb9數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥busco.ezlab.org/)1 658個(gè)昆蟲(chóng)進(jìn)化保守的直系同源基因進(jìn)行比較，檢測(cè)每個(gè)unigene的完整性，以評(píng)估轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及嗅覺(jué)相關(guān)基因鑒定

將1.4節(jié)所得unigenes，使用本地Blastx軟件分別與NR, NT, COG, Swiss-Prot和KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(E值<1×10-5)，獲得相應(yīng)的注釋信息。根據(jù)NR注釋信息獲得基因功能信息，然后提取每個(gè)基因相應(yīng)的GO注釋信息，并基于GO注釋把基因劃分到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能等三亞類(lèi)。利用COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息對(duì)直系同源蛋白家族進(jìn)行功能分類(lèi)。KEGG注釋信息用以呈現(xiàn)基因參與的代謝通路。茄二十八星瓢蟲(chóng)高質(zhì)量的unigenes集及相關(guān)基因功能注釋信息從我們以前的數(shù)據(jù)集相關(guān)研究中獲取(Zhangetal., 2018)。最后，采用以往文獻(xiàn)使用的方法(Jiaetal., 2016; Zhangetal., 2016; 鄭海霞等, 2018)，即根據(jù)基因注釋信息鑒定嗅覺(jué)相關(guān)基因。

2 結(jié)果

2.1 七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組序列分析與組裝

七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得10.73 Gb原始數(shù)據(jù)。質(zhì)控后獲得70 291 132條共10.54 Gb高質(zhì)量clean reads數(shù)據(jù)，Q20和Q30值堿基比例分別為97.57%和93.69%。利用Trinity軟件對(duì)獲得的高質(zhì)量reads進(jìn)行組裝，共獲得46 687條contigs，總長(zhǎng)度為41 887 759 bp，平均長(zhǎng)度為897 bp，N50的長(zhǎng)度為1 871 bp，N70的長(zhǎng)度為1 061 bp，N90的長(zhǎng)度為311 bp。對(duì)contigs進(jìn)一步進(jìn)行聚類(lèi)和去冗余，得到31 775條unigenes，總長(zhǎng)度為34 872 097 bp，平均長(zhǎng)1 097 bp，N50的長(zhǎng)度為2 010 bp；GC含量為38.99%。unigenes長(zhǎng)度分布(圖1)顯示，在長(zhǎng)度1 kb以上的unigenes為13 107條，占unigenes總數(shù)的41.25%。BUSCO分析結(jié)果顯示83.22%的unigenes為完整基因，7.13%是部分片段，剩下的unigenes沒(méi)有比對(duì)到任何序列。為了使相關(guān)學(xué)者使用方便，避免前期數(shù)據(jù)組裝的不便，unigenes集已釋放到公共存儲(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)Figshare(https:∥doi.org/10.6084/m9.figshare.10259660.v1)供直接下載使用。

圖1 七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組unigenes長(zhǎng)度分布Fig. 1 Length distribution of all assembled unigenes in the antennal transcriptome of Coccinella septempunctata

2.2 七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋

七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中，共有22 149條(69.71%) unigenes獲得注釋。其中NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的unigenes數(shù)目最多，為20 539條(64.64%)；GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的unigenes最少，為4 863條(15.30%)；NT數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到7 576條(23.84%)；Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到16 862條(53.07%)；KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到16 445條(51.75%)；COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到9 342條(29.40%)。

基于NR注釋信息，七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中共注釋到20 539條unigenes，其中與赤擬谷盜Triboliumcastaneum的相似基因最多，所占比例為62.70%，其后依次為中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae(7.79%)、麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis(1.21%)、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum(1.05%)，其他物種占27.26%(圖2)?；贕O數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)(圖3)，共得到22 020條功能注釋信息，分布于4 863條unigenes，生物學(xué)過(guò)程(9 841條unigenes)中代謝過(guò)程基因最多(2 373條unigenes)，其次是細(xì)胞進(jìn)程(2 325條unigenes)和單生物進(jìn)程(1 695條unigenes)，其余的均低于1 000條unigenes；細(xì)胞組分(6 406條unigenes)中細(xì)胞部分和細(xì)胞最多，均為1 454條unigenes，其次是細(xì)胞器(931條unigenes)、膜(800條unigenes)、大分子復(fù)合物(641條unigenes)、膜部分(529條unigenes)，其余均低于500條unigenes；分子功能(5 773條unigenes)中催化活性有2 430條unigenes， 結(jié)合有2 350條unigenes，其余均低于500條unigenes。

圖2 七星瓢蟲(chóng)觸角unigenes在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種分布Fig. 2 Species distribution of antennal unigenes of Coccinella septempunctata in the NR database

圖3 七星瓢蟲(chóng)觸角unigenes GO功能注釋Fig. 3 GO function annotation of antennal unigenes of Coccinella septempunctata

在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中，9 342條unigenes被分為25個(gè)大類(lèi)，共包含14 906條注釋信息(圖4)。其中數(shù)量最多的是僅一般功能預(yù)測(cè)類(lèi)(2 841條, 19.06%)，其余依次為翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成類(lèi)(1 197條, 8.03%)，復(fù)制、重組和修復(fù)類(lèi)(1 136條, 7.62%)等。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組的注釋信息，16 445條unigenes注釋到31 645個(gè)代謝通路(表1)，有9個(gè)代謝通路包含300條以上的unigenes：代謝通路(649, 3.95%)、癌癥中通路(538, 3.27%)、內(nèi)吞作用(393, 2.39%)、艾巴氏病毒感染(382, 2.32%)、嘌呤代謝(370, 2.25%)、噬菌體(368, 2.24%)、癌癥中的蛋白多糖(362, 2.20%)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(328, 1.99%)、肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)(322, 1.96%)；包含150～300條unigenes的代謝通路有18個(gè)；其余代謝通路所含unigenes數(shù)量均低于150條。

圖4 七星瓢蟲(chóng)觸角unigenes COG功能分類(lèi)Fig. 4 COG function classification of antennal unigenes of Coccinella septempunctata

表1 七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組KEGG通路分析Table 1 KEGG pathways in the antennal transcriptome of Coccinella septempunctata

續(xù)表1 Table 1 continued

2.3 七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組嗅覺(jué)相關(guān)基因分析

基于六大公共數(shù)據(jù)庫(kù)得到的unigenes注釋信息，27個(gè)嗅覺(jué)相關(guān)基因在七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中被鑒定(表2): 1個(gè)氣味結(jié)合蛋白(OBP)基因(3.70%)、13個(gè)化學(xué)感受蛋白(CSP)基因(48.15%)、4個(gè)氣味受體(odorant receptor, OR)基因(14.48%)、7個(gè)味覺(jué)受體(GR)基因(25.93%)和2個(gè)感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(SNMP)基因(7.41%)。另外，在茄二十八星瓢蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中鑒定到38個(gè)嗅覺(jué)相關(guān)基因，包括5個(gè)OBP基因(13.16%), 17個(gè)CSP基因(44.74%), 4個(gè)OR基因(10.53%), 1個(gè)IR基因(2.63%), 5個(gè)GR基因(13.16%)和6個(gè)SNMP基因 (15.79%)。比較發(fā)現(xiàn)，茄二十八星瓢蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組各類(lèi)型嗅覺(jué)相關(guān)基因中，OBP基因比例(13.16%)高于七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組的(3.70%)，而七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中GR基因的比例(25.93%)高于茄二十八星瓢蟲(chóng)(13.16%)。

表2 七星瓢蟲(chóng)和茄二十八星瓢蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組嗅覺(jué)相關(guān)基因統(tǒng)計(jì)Table 2 Olfaction-related genes in the transcriptomes of Coccinella septempunctata and Henosepilachna viginyioctopunctata

3 討論

迄今為止，嗅覺(jué)相關(guān)基因已經(jīng)在20余種鞘翅目昆蟲(chóng)中被研究，但是在瓢蟲(chóng)中還鮮有報(bào)道。此外，通過(guò)與其他組裝的45種節(jié)肢動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組BUSCO結(jié)果(Theissingeretal., 2016)比較，本研究獲得的七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中，完整的unigenes占比為83.22%，證實(shí)了我們得到高質(zhì)量的七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及組裝結(jié)果。采用NR蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得的unigenes最佳比對(duì)物種信息注釋分類(lèi)顯示，最高相似性的物種為赤擬谷盜和中歐山松大小蠹(圖2)，這兩種甲蟲(chóng)作為最佳比對(duì)物種的unigenes占據(jù)了所有注釋基因的約70%，這主要?dú)w因于其與七星瓢蟲(chóng)一道作為鞘翅目昆蟲(chóng)，具有相對(duì)完整的全基因組序列，且具有豐富的基因組注釋信息；尤其赤擬谷盜為著名的模式動(dòng)物，擁有鞘翅目昆蟲(chóng)中最全面的基因組學(xué)信息(Tribolium Genome Sequencing Consortium, 2008)。已有大量研究結(jié)果表明，注釋到的基因均與基因組信息已知且親緣關(guān)系較近的物種相似性序列最多(鄭海霞等, 2018; 杜迎剛等, 2019)。GO分類(lèi)表明，七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組基因劃分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分與分子功能3個(gè)亞類(lèi)，其中參與細(xì)胞進(jìn)程、代謝過(guò)程、細(xì)胞和細(xì)胞部分、結(jié)合、催化活性的基因功能注釋較多，這與大多數(shù)鞘翅目昆蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中報(bào)道的(Guetal., 2015; 鄭海霞等, 2018)較為一致，表明這些基因是維持甲蟲(chóng)觸角生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。當(dāng)然，不同文獻(xiàn)報(bào)道的不同鞘翅目昆蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中基因功能注釋的GO數(shù)目不同，這可能是由不同的昆蟲(chóng)種類(lèi)、生存環(huán)境、測(cè)序手段和分析參數(shù)等不同所導(dǎo)致的。此外，包括KEGG注釋信息，69.71%的unigenes在所有六大數(shù)據(jù)庫(kù)中得以注釋?zhuān)@個(gè)結(jié)果表明有超過(guò)30%的七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組unigenes沒(méi)有任何注釋信息，可見(jiàn)仍有一大批未知基因功能的新基因有待鑒定，其中也可能包含許多潛在的新的嗅覺(jué)相關(guān)基因。此外，unigenes主要涉及代謝、免疫防御、核糖體和蛋白過(guò)程等代謝通路，表明了外源物質(zhì)防御、免疫響應(yīng)、蛋白質(zhì)的合成及代謝在七星瓢蟲(chóng)嗅覺(jué)行為活動(dòng)中的重要性。

本研究首次以?xún)煞N食性分化程度最高的瓢蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組為對(duì)象，從七星瓢蟲(chóng)中挖掘到27個(gè)嗅覺(jué)相關(guān)基因(表2)，并通過(guò)以往獲得的茄二十八星瓢蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Zhangetal., 2018)，從中鑒定到38個(gè)嗅覺(jué)相關(guān)基因，主要包括OBP, CSP, OR, IR, GR和SNMP基因。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)捕食性的異色瓢蟲(chóng)Harmoniaaxyridis觸角轉(zhuǎn)錄組中至少存在57個(gè)嗅覺(jué)相關(guān)基因(包括30個(gè)OBP基因和27個(gè)CSP基因)(張偉, 2018)?？梢?jiàn)，嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)量差異在捕食-捕食瓢蟲(chóng)間比捕食-植食瓢蟲(chóng)間大。另一方面，不同食性的瓢蟲(chóng)間，嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)量差異不及瓢蟲(chóng)與其他目昆蟲(chóng)間嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)量差異大。例如鞘翅目紅脂大小蠹Dendroctonusvalens、星天牛Anoplophorachinensis、光肩星天牛Anoplophoraglabripennis和紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus觸角轉(zhuǎn)錄組中六大類(lèi)嗅覺(jué)相關(guān)基因總數(shù)分別為60, 151, 108和157個(gè)(Guetal., 2015; Antonyetal., 2016; Huetal., 2016b; Wang Jetal., 2017)；鱗翅目美國(guó)白蛾、草地螟Loxostegesticticalis和沙棘木蠹蛾Eogystiahippophaecolus觸角轉(zhuǎn)錄組中分別為124, 131和137個(gè)(Huetal., 2016a; Zhangetal., 2016; Weietal., 2017)；半翅目柑橘木虱Diaphorinacitri、枯蟬Subpsaltriayangi和黑肩綠盲蝽Cyrtorhinuslividipennis觸角轉(zhuǎn)錄組中分別為126, 77和57個(gè)(Wuetal., 2016; Qietal., 2018; Wangetal., 2018)；雙翅目南亞實(shí)蠅Bactroceratau、黑帶食蚜蠅Episyrphusbalteatus和大灰優(yōu)食蚜蠅Eupeodescorollae、柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax觸角轉(zhuǎn)錄組中分別為104, 154, 134和127個(gè)(Wang Betal., 2017; 杜迎剛等, 2019; Wuetal., 2019)。因此，我們提出昆蟲(chóng)觸角嗅覺(jué)相關(guān)基因的絕對(duì)數(shù)量可能不是昆蟲(chóng)食性分化一個(gè)最重要的因素。如兩種食性瓢蟲(chóng)、不同食性蠅類(lèi)間等食性差異很大，但嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)量差異較??；相反，有的昆蟲(chóng)類(lèi)群(如柑橘木虱與枯蟬和黑肩綠盲蝽、紅脂大小蠹與天牛和象甲等)食性相似，但嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)量差異較大。另外，上述例子中兩種(星天牛和光肩星天牛)同隸屬Anoplophora屬食性相似的天牛觸角轉(zhuǎn)錄組中嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)目也有一定差異(151vs108)，而與其他鞘翅目昆蟲(chóng)又較為一致，這兩種天牛嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)量差異，可能是除食性外的其他環(huán)境因子引起的。

在七星瓢蟲(chóng)觸角和茄二十八星瓢蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中，CSP基因數(shù)量均占據(jù)了嗅覺(jué)相關(guān)基因數(shù)目的絕大多數(shù)(40%以上)(表2)。不同昆蟲(chóng)間CSP基因所占嗅覺(jué)相關(guān)基因比重不同，如星天牛(10.60%)、紅脂大小蠹(10%)和美國(guó)白蛾(13.71%)(Guetal., 2015; Zhangetal., 2016; Wang Jetal., 2017)。另外，OBP基因在七星瓢蟲(chóng)觸角(3.70%)和茄二十八星瓢蟲(chóng)(13.16%)轉(zhuǎn)錄組中所占比例差異較大(表2)。其他嗅覺(jué)相關(guān)基因類(lèi)型也是如此，可見(jiàn)不同昆蟲(chóng)類(lèi)群間，嗅覺(jué)相關(guān)基因組成比重不盡相同。另外，OBPs是嗅覺(jué)發(fā)生進(jìn)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^(guò)昆蟲(chóng)感覺(jué)淋巴將氣味從外部環(huán)境傳送到ORs (Leal, 2004, 2013)。在七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中，未有IR基因被鑒定到，茄二十八星瓢蟲(chóng)中鑒定到了1個(gè)IR基因(表2)。IR基因家族包含兩大類(lèi)：一類(lèi)是與嗅覺(jué)有關(guān)的保守的觸角IRs；另一類(lèi)是在包括味覺(jué)器官在內(nèi)的其他組織中表達(dá)的具有物種特異性的IRs (Crosetetal., 2010)。本研究中，七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組未發(fā)現(xiàn)IR基因，再者茄二十八星瓢蟲(chóng)因?yàn)槭瞧洳煌l(fā)育階段整個(gè)蟲(chóng)體的轉(zhuǎn)錄組混池組裝結(jié)果，故這些證據(jù)表明瓢蟲(chóng)中鑒定到的IR基因極有可能屬于第2種類(lèi)型。然而，還需要通過(guò)與其他昆蟲(chóng)兩種類(lèi)型的IR基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和進(jìn)行不同組織基因表達(dá)分析最終確認(rèn)。GR基因在昆蟲(chóng)中主要在味覺(jué)器官的味覺(jué)感受神經(jīng)元中表達(dá)，作為糖受體、熱傳感器、二氧化碳和苦味受體，參與糖、苦味化合物和其他昆蟲(chóng)信息素的檢測(cè) (Nietal., 2013; Guetal., 2015)。本研究中發(fā)現(xiàn)七星瓢蟲(chóng)觸角所含GR基因的比例(25.93%)是茄二十八星瓢蟲(chóng)中的近2倍(13.16%)(表2)，表明了七星瓢蟲(chóng)在捕食過(guò)程中觸角有更強(qiáng)的代謝能力，對(duì)糖及苦味化合物有更靈敏的嗅覺(jué)，對(duì)其他昆蟲(chóng)(尤其捕食對(duì)象)有更快速的響應(yīng)。SNMPs的功能在昆蟲(chóng)中還鮮有報(bào)道，故仍需更多的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究測(cè)序、組裝及注釋了七星瓢蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組，并結(jié)合茄二十八星瓢蟲(chóng)不同發(fā)育階段測(cè)序數(shù)據(jù)混池組裝的轉(zhuǎn)錄組，在兩種食性的瓢蟲(chóng)中鑒定了六大類(lèi)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)基因，并基于每類(lèi)基因所占鑒定出的嗅覺(jué)相關(guān)基因總數(shù)比例，比較了它們?cè)趦煞N食性瓢蟲(chóng)間的差異。值得注意的是，因?yàn)闇y(cè)序深度及測(cè)序組織的不同，直接比較每種嗅覺(jué)相關(guān)基因類(lèi)型在兩種瓢蟲(chóng)中的絕對(duì)數(shù)目是欠妥的，故我們將其轉(zhuǎn)換成統(tǒng)一測(cè)序背景下，不同類(lèi)型嗅覺(jué)相關(guān)基因在總數(shù)中所占的比重/比例進(jìn)行比較。本研究獲得了七星瓢蟲(chóng)高質(zhì)量的觸角轉(zhuǎn)錄組及兩種瓢蟲(chóng)中的一批嗅覺(jué)相關(guān)基因，但這些基因的組織表達(dá)模式和生理生態(tài)功能仍有待進(jìn)一步研究。今后，可利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)瓢蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)基因組織特異表達(dá)情況確認(rèn)，以輔助明確其生物學(xué)功能；結(jié)合不同層次的組學(xué)測(cè)序結(jié)果，利用正反向遺傳學(xué)手段，過(guò)表達(dá)或沉默關(guān)鍵嗅覺(jué)相關(guān)基因，進(jìn)一步明確嗅覺(jué)相關(guān)基因在瓢蟲(chóng)食性分化中的作用。