方海波, 張 璟, 劉小俠, 張青文, 李 貞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)系, 北京 100193)

梨小食心蟲(chóng)Grapholitamolesta屬鱗翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae)，簡(jiǎn)稱“梨小”，是一種世界性果樹(shù)害蟲(chóng)，在我國(guó)除西藏以外的各果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。梨小食心蟲(chóng)主要以幼蟲(chóng)造成為害，果樹(shù)生長(zhǎng)季前期主要為害桃樹(shù)新梢，后可轉(zhuǎn)入梨、蘋果、杏、李等多種果園蛀食為害果實(shí)(陳梅香等, 2009)。梨小食心蟲(chóng)蛀梢導(dǎo)致果樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)減弱，蛀果后又可嚴(yán)重降低果質(zhì)和產(chǎn)量，影響果農(nóng)收入(周仙紅等, 2011)。由于梨小食心蟲(chóng)鉆蛀取食、為害隱蔽，因此有效防控時(shí)間短，常規(guī)防控難以獲得理想效果。

羽化、求偶、交尾、繁殖等過(guò)程是昆蟲(chóng)行為節(jié)律研究的重要內(nèi)容。另外，害蟲(chóng)羽化高峰期經(jīng)常是田間成蟲(chóng)防治關(guān)鍵期。因此，掌握害蟲(chóng)羽化規(guī)律對(duì)于適時(shí)開(kāi)展有效防治具有重要參考意義。研究表明，昆蟲(chóng)的羽化規(guī)律同時(shí)受光周期、溫度、性別等多種環(huán)境和個(gè)體因素的影響(Edmondsetal., 2000; Thiéryetal., 2014; Yadavetal., 2015)。例如，在自然條件下，條紋小斑蛾Thyrassiapenangae在弱光狀態(tài)下羽化率更高，羽化高峰也會(huì)隨著溫度的升高而提前，但羽化時(shí)間受光周期影響極小(何海敏等, 2015)；溫濕度對(duì)楊小舟蛾Micromelalophasieversi的羽化有極顯著影響，具體表現(xiàn)為隨溫濕度的增加其羽化率呈先上升后下降的駝峰式節(jié)律，并于光期溫度30±1℃、暗期溫度24±1℃、光期濕度50%±10%、暗期濕度70%±10%時(shí)達(dá)到最佳羽化效率，但不同光周期處理對(duì)其羽化節(jié)律無(wú)顯著影響(范立鵬等, 2014)；印鼠客蚤Xenopsyllacheopi的性比和羽化規(guī)律探究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室種群和野外種群中雌性均多于雄性，并且雄性的累積羽化率隨時(shí)間的變化呈S型增長(zhǎng)規(guī)律，但雌性的羽化數(shù)量與時(shí)間呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系(孟鳳霞等, 2006)；楊小舟蛾雄蛹羽化高峰期比雌蛹提前4 d(范立鵬等, 2014)。

生物的行為節(jié)律均受生物鐘基因(circadian clock genes)的調(diào)控，目前確認(rèn)的主要生物鐘基因有鐘蛋白基因(clock,clk)、周期蛋白基因(period,per)、永恒蛋白基因(timeless,tim)、周期循環(huán)蛋白基因(cycle,cyc)、雙時(shí)蛋白基因(double-time,dbt)、旋轉(zhuǎn)蛋白基因(vrille,vri)和隱花色素基因 (cryptochrome,cry)等。其中，以果蠅為模式的生物鐘基因研究較為深入。在果蠅體內(nèi), CLK和CYC可結(jié)合形成異二聚體，此二聚體在正午時(shí)分可以與E-box序列(CACGTG)結(jié)合，激活多個(gè)節(jié)律基因(如per,tim,vri或PAR結(jié)構(gòu)蛋白基因)啟動(dòng)子的E-box元件。其中，節(jié)律行為的核心激活因子per和tim的mRNA在傍晚/夜晚時(shí)分被大量轉(zhuǎn)錄，PER蛋白和TIM蛋白在細(xì)胞質(zhì)中大量積累，TIM蛋白對(duì)PER蛋白的穩(wěn)定存在至關(guān)重要，缺少TIM蛋白的保護(hù)PER蛋白將被 Double-Time (DBT)激酶磷酸化，磷酸化的PER蛋白將被泛素化并隨之降解。夜間TIM和PER蛋白積累，各自或以異質(zhì)二聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。PER可結(jié)合DBT激酶共同進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞核后，PER-DBT-TIM復(fù)合體靶標(biāo)CLK和CYC，終止CLK和CYC的轉(zhuǎn)錄。白天期間CRY蛋白促進(jìn)TIM的降解進(jìn)而導(dǎo)致PER/TIM的降解，CLK和CYC的轉(zhuǎn)錄重新激活，這樣在光照驅(qū)動(dòng)下，相應(yīng)生物鐘基因呈現(xiàn)約24 h的周期性變化，對(duì)外表現(xiàn)為生物體的晝夜節(jié)律性(Collinsetal., 2006; Tataroglu and Emery, 2014)。與此同時(shí)，VRI和CWO對(duì)CLK的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也共同參與生物體晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)作用(Zhouetal., 2016)。

在生物鐘反饋回路中，per和tim基因作為核心激活因子具有極其重要的作用。因此，對(duì)重要蛀果害蟲(chóng)梨小食心蟲(chóng)生物鐘基因per和tim的分子鑒定及兩基因在梨小食心蟲(chóng)羽化過(guò)程中的功能分析將為進(jìn)一步明確生物鐘基因?qū)[翅目害蟲(chóng)羽化節(jié)律的調(diào)控作用和監(jiān)測(cè)害蟲(chóng)羽化規(guī)律進(jìn)行適時(shí)防控提供數(shù)據(jù)參考，同時(shí)可為開(kāi)發(fā)基于發(fā)育行為節(jié)律調(diào)控的梨小食心蟲(chóng)防控方法提供新線索。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

本實(shí)驗(yàn)的供試?yán)ハx(chóng)來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)IPM實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)的梨小食心蟲(chóng)室內(nèi)種群，原始種群采集于遼寧果樹(shù)科學(xué)研究所，并在室內(nèi)采用人工氣候箱連續(xù)培養(yǎng)30代以上，培養(yǎng)條件為光周期14L∶10D，溫度為26±1℃，相對(duì)濕度70%±10%。培養(yǎng)箱于早上8∶00時(shí)開(kāi)燈，晚上22∶00時(shí)熄燈，記燈亮?xí)r間點(diǎn)為授時(shí)時(shí)間0 (ZT0)。具體飼養(yǎng)方法參照中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)曹進(jìn)軍等方法 (Caoetal., 2015) 并加以改進(jìn)，具體操作如下：成蟲(chóng)在干凈的2 000 mL玻璃燒杯中飼養(yǎng)，利用蘸有10%蜂蜜水脫脂棉飼喂成蟲(chóng)，并于燒杯口蓋上一層紗布防止成蟲(chóng)逃逸，燒杯內(nèi)放1～2個(gè)干凈無(wú)傷痕的蘋果和硫酸紙作為梨小食心蟲(chóng)產(chǎn)卵場(chǎng)所；根據(jù)梨小食心蟲(chóng)產(chǎn)卵情況及時(shí)更換蘋果，將更換下來(lái)的蘋果置于一次性塑料盒中，盒蓋上扎小孔透氣；約兩周后，將接有蟲(chóng)卵的腐爛蘋果用手術(shù)刀小心剖開(kāi)，將各齡幼蟲(chóng)置于裝有人工飼料的培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)至老熟，每日挑取4～5頭老熟幼蟲(chóng)放入裝有人工飼料的10 mL指形管中，脫脂棉封口；化蛹后小心將蛹掏出并置于底部鋪有濕潤(rùn)濾紙的一次性杯子中，雌雄成蟲(chóng)羽化后配對(duì)交尾產(chǎn)卵。

1.2 梨小食心蟲(chóng)Gmper和Gmtim的克隆

通過(guò)序列分析，從梨小食心蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組(未發(fā)表)數(shù)據(jù)中獲得生物鐘基因Gmper和Gmtim的序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)序列全長(zhǎng)的擴(kuò)增引物(表1)。

取10頭梨小食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)，采用Trizol法提取總RNA，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA產(chǎn)物的完整性，同時(shí)采用NanoDrop 2000檢測(cè)其濃度和純度，取1 μg質(zhì)量合格的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒)，cDNA產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以上述合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于預(yù)測(cè)序列較長(zhǎng)，因此使用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增拼接。反應(yīng)體系: 2×PCR Mix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于4℃保存。

采用天根膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將純化的PCR產(chǎn)物連接至T載體 (北京全式金生物技術(shù)有限公司)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞 (天根生化科技有限公司)，隨后接種至帶有氨芐青霉素 (100 mg/mL, Sigma-Aldrich)的LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑選多個(gè)陽(yáng)性單克隆送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用DNAMAN的ORF Finder工具預(yù)測(cè)克隆序列的開(kāi)放閱讀框，并采用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域鑒定，分析結(jié)果證明克隆所得的兩序列確實(shí)為梨小食心蟲(chóng)生物鐘基因Gmper和Gmtim的cDNA序列全長(zhǎng)，并將其提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。后續(xù)使用Expasy在線工具pI/Mw(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)其編碼蛋白分子質(zhì)量及等電點(diǎn)；利用NCBIblast(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得其他昆蟲(chóng)生物鐘基因序列，并采用DNAMAN6.0進(jìn)行梨小食心蟲(chóng)與其他昆蟲(chóng)生物鐘基因氨基酸序列的多重聯(lián)配分析；采用MEGA6.06構(gòu)建鄰接(neighbour-joining)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)選取親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的嚙齒目鼠科的PER和TIM分別作為GmPER和GmTIM的外群。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)梨小食心蟲(chóng)Gmper和Gmtim基因表達(dá)模式

根據(jù)所獲得梨小食心蟲(chóng)Gmper和Gmtim開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)qPCR引物(表1)，并以EF-1α作為內(nèi)參基因(Caoetal., 2015; Wangetal., 2017)進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測(cè)。

收集梨小食心蟲(chóng)羽化24 h內(nèi)雌、雄成蟲(chóng)，用眼科鑷分別將頭、胸、腹、足取下后置于EP管中用于后續(xù)基因表達(dá)水平的組織特異性檢測(cè)，每性別每個(gè)組織樣品包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的組織樣品來(lái)自20頭個(gè)體；另外，每隔3 h取1日齡雌、雄蛹頭部分別置于EP管中，持續(xù)取樣24 h，獲得雌雄蛹頭部各8個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品，用于檢測(cè)生物鐘基因在蛹頭部的表達(dá)水平隨時(shí)間的變化模式，每性別每個(gè)樣品包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)來(lái)自20頭個(gè)體。將上述樣品迅速置于液氮中冷凍，并于-80℃保存用于后續(xù)總RNA的提取。

總RNA提取及cDNA合成參照1.2節(jié)。采用SYBR Primer Script RT-PCR Kit (TaKaRa)進(jìn)行qPCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(20 μL): SYBR 10 μL, ddH2O 7 μL, 正反向引物 (10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)后65～95℃ (每5 s增加0.5℃，用于特異性擴(kuò)增的解離和熔解曲線分析)。

1.5 siRNA顯微注射及干擾效率檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射siRNA進(jìn)行靶標(biāo)生物鐘基因的RNA干擾。為保證干涉效率，基于1.2節(jié)克隆和測(cè)定的基因序列，為Gmper和Gmtim分別設(shè)計(jì)合成3段siRNA，引物序列見(jiàn)表1，由蘇州吉瑪基因股份有限公司完成。取梨小食心蟲(chóng)2日齡蛹，分別將Gmtim的3段siRNA和Gmper的3段siRNA按1∶1∶1均勻混合，采用顯微注射儀(NanojectⅡ, 美國(guó))分雌雄蛹分別注射。注射時(shí)將蛹置于冰袋上以降低其活動(dòng)力，為避免對(duì)頭部的機(jī)械損傷，我們選擇從近頭的翅下進(jìn)行扎入注射，每頭蟲(chóng)注射1.5 μg siRNA，對(duì)照注射等量陰性對(duì)照(NC) (siRNA合成時(shí)由公司附贈(zèng)，序列見(jiàn)表1)。注射后的梨小食心蟲(chóng)單頭置于指形管中于正常條件下飼養(yǎng)。

注射后24, 48和72 h分別取樣(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭個(gè)體)，進(jìn)行總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄，并采用qPCR進(jìn)行干涉效率檢測(cè)。反應(yīng)體系(20 μL): SYBR 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán); 65～95℃ (每5 s增加0.5℃，用于特異性擴(kuò)增的解離和熔解曲線分析)。

1.6 梨小食心蟲(chóng)羽化節(jié)律的觀察

另收集1.5節(jié)中成功注射的蛹30頭，以10頭為一重復(fù)置于事先放入濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為：溫度為26±1℃，相對(duì)濕度70%±10%，光周期14L∶10D。將皿置于攝像頭下記錄每頭蛹的羽化時(shí)間。

1.7 數(shù)據(jù)分析

基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，其中ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因， ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對(duì)照。用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。梨小食心蟲(chóng)不同組織和羽化時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(Tukey氏多重比較)；雌雄間同一組織的基因表達(dá)量的比較以及siRNA處理組與其相應(yīng)對(duì)照組間基因表達(dá)量、羽化率的比較均采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

梨小食心蟲(chóng)Gmper(GenBank登錄號(hào): MN862636)的開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)2 862 bp，編碼953個(gè)氨基酸，蛋白分子量107 kD，等電點(diǎn)為6.18；蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，序列中含2個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域和1個(gè)PAC結(jié)構(gòu)域。Gmtim(GenBank登錄號(hào): MN862637)開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)3 048 bp，編碼1 015個(gè)氨基酸；推測(cè)相應(yīng)編碼蛋白分子量115.1 kD，等電點(diǎn)為5.13。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，梨小食心蟲(chóng)GmPER與其他鱗翅目蝶類和蛾類的PER都聚在一簇，但與蜚蠊目、直翅目和雙翅目昆蟲(chóng)的PER分別聚在不同分枝上；與PER系統(tǒng)發(fā)育情況不同，GmTIM與柑橘鳳蝶Papilioxuthus的TIM系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，并與甜菜夜蛾Spodopteraexigua、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera、家蠶Bombyxmori和柞蠶Antheraeapemyi等鱗翅目蛾類的TIM聚在一簇 (圖1～4)。

圖4 鄰接法構(gòu)建的基于梨小食心蟲(chóng)GmTIM與其他昆蟲(chóng)TIM氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1 000次重復(fù))Fig. 4 Phylogenetic tree of GmTIM from Grapholita molesta and TIM proteins from other insect species based on amino acid sequence by neighbour-joining method (1 000 replicates)

2.2 Gmper和Gmtim的表達(dá)模式分析

Gmper和Gmtim在雌、雄成蟲(chóng)頭部的表達(dá)水平均顯著高于兩基因在胸、腹、足中的表達(dá)水平；相同組織雌雄之間基因表達(dá)水平的結(jié)果分析表明，兩基因在雄成蟲(chóng)胸和足中的表達(dá)水平均顯著高于雌成蟲(chóng)(胸:tper=49.376,Pper=0.0003;ttim=16.770,Ptim=0.0007; 足:tper=19.318,Pper=0.002;ttim=15.741,Ptim=0.004<0.05)，雄成蟲(chóng)腹部Gmper的表達(dá)水平高于雌蟲(chóng)(t=4.338,P=0.012)，而雌蟲(chóng)腹部Gmtim表達(dá)量顯著高于雄成蟲(chóng)(t=3.608,P=0.023)，但頭部?jī)苫虮磉_(dá)水平在雌雄之間均無(wú)顯著性差異 (tper=2.247,Pper=0.088;ttim=0.679,Ptim=0.534) (圖5)。

圖5 Gmper (A)和Gmtim (B)在梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)量Fig. 5 Expression levels of Gmper (A) and Gmtim (B) in different tissues of Grapholita molesta adults 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母和大寫字母分別表示基因表達(dá)量在雄成蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)不同組織間差異顯著(P<0.05, Tukey氏多重比較)；星號(hào)和ns分別表示雌雄成蟲(chóng)之間表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)和不顯著(P>0.05)(獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。Data in theFigure are mean±SE. Different lowercase letters and uppercase letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different tissues of male adults and female adults, respectively (P<0.05, Tukey’s multiple comparison), and asterisk and ns represent significant difference (P<0.05) and no significant difference (P>0.05), respectively, in the gene expression level between male and female adults (independent samples T-test).

蛹頭部?jī)苫虻娜毡磉_(dá)模式分析表明，Gmper和Gmtim呈現(xiàn)出類似的表達(dá)節(jié)律，且Gmper的表達(dá)水平在所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于Gmtim的表達(dá)水平。雌雄蛹中，Gmper在光期和暗期均各有一個(gè)表達(dá)高峰，雄蛹頭部光期的表達(dá)高峰出現(xiàn)在ZT12，暗期表達(dá)高峰出現(xiàn)在ZT18；雌蛹頭部光期表達(dá)峰值出現(xiàn)在ZT0，暗期表達(dá)高峰出現(xiàn)在ZT15；雄蛹頭部的表達(dá)峰值均出現(xiàn)在雌蛹之后(圖6: A)。Gmtim在梨小食心蟲(chóng)蛹頭部的表達(dá)水平均呈現(xiàn)出暗期高于光期的表達(dá)趨勢(shì)，其中雌雄蛹的表達(dá)最低值均出現(xiàn)在ZT3，而表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在ZT18的雄蛹頭部和ZT15的雌蛹頭部。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，除ZT3外，Gmper表達(dá)量在雄蛹頭部的表達(dá)量均極顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的雌蛹頭部(t0=12.681,P0=0.0002;t3=4.051,P3=0.015;t6=11.99,P6=0.0003;t9=12.812,P9=0.0002;t12=16.661,P12=0.00008;t15=20.216,P15=0.00004;t18=9.941,P18=0.008;t21=15.235,P21=0.004) (圖6: A)；除ZT3和ZT12外，Gmtim在雄蛹頭部的表達(dá)量極顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的雌蛹頭部(t0=11.328,P0=0.0003;t3=2.267,P3=0.086;t6=6.715,P6=0.003;t9=18.527,P9=0.00005;t12=0.074,P12=0.945;t15=4.628,P15=0.01;t18=17.299,P18=0.00007;t21=10.037,P21=0.006) (圖6: B)。

圖6 Gmper(A)和Gmtim(B)在梨小食心蟲(chóng)蛹頭部的日表達(dá)模式Fig. 6 Daily expression patterns of Gmper (A) and Gmtim (B) in the head of Grapholita molesta pupae ZT: 授時(shí)時(shí)間Zeitgeber time; ZT0-ZT14: 光期Photophase; ZT14-ZT24: 暗期Scotophase. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；圖上雙星號(hào)表示雌雄間基因表達(dá)量差異極顯著(P<0.01, 獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。Data in theFigure are mean±SE. Double asterisk represents extremely significant difference in the gene expression level between male and female (P<0.01, independent samples T-test).

2.3 RNAi對(duì)梨小食心蟲(chóng)羽化節(jié)律的影響

qPCR結(jié)果顯示，注射siRNA可以顯著降低Gmper和Gmtim在梨小食心蟲(chóng)蛹體內(nèi)的表達(dá)水平。其中，雄蛹在注射Gmper-siRNA后，per在48 h和72 h呈現(xiàn)極顯著下調(diào)趨勢(shì)(tper-24h=0.540,Pper-24h=0.618;tper-48h=10.498,Pper-48h=0.0005;tper-72h=12.16,Pper-72h=0.0003)(圖7: A)；注射Gmtim-siRNA后24-72 h均表現(xiàn)出目的基因的極顯著下調(diào)(ttim-24h=24.882,Ptim-24h=0.00001;ttim-48h=19.557,Ptim-48h=0.00004;ttim-72h=17.632,Ptim-72h=0.00006) (圖7: C)。

雌蛹在注射Gmper-siRNA后，per在24-72 h呈現(xiàn)極顯著下調(diào)趨勢(shì)(tper-24h=15.438,Pper-24h=0.0001;tper-48h=7.334,Pper-48h=0.002;tper-72h=5.930,Pper-72h=0.004) (圖7: B); 而注射Gmtim-siRNA后24和72 h均表現(xiàn)出目的基因的極顯著下調(diào)(ttim-24h=16.721,Ptim-24h=0.0001;ttim-72h=26.42,Ptim-72h=0.0001) (圖7: D)。

圖7 梨小食心蟲(chóng)蛹體內(nèi)Gmper (A, B)和Gmtim (C, D)的siRNA基因干涉效率Fig. 7 Interference efficiency of Gmper (A, B) and Gmtim (C, D) siRNA in Grapholita molesta pupae A, C: 雄蛹Male pupa; B, D: 雌蛹Female pupa. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)和雙星號(hào)分別表示基因表達(dá)量在siRNA處理組與對(duì)照組(NC)間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。Data in theFigure are mean±SE. Asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, in the gene expression level between the siRNA treatment group and the control group (NC)(independent samples T-test).

成蟲(chóng)羽化率監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，Gmper干涉處理組與對(duì)照組試蟲(chóng)的羽化節(jié)律呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，但對(duì)照組羽化高峰時(shí)間更加集中(ZT0)，而處理組呈現(xiàn)出兩個(gè)明顯的羽化高峰時(shí)間(ZT0和ZT2)，在ZT0時(shí)處理組羽化率顯著低于對(duì)照組(t=2.616,P=0.045)(圖8: A)。類似地，Gmtim干涉處理后，對(duì)照和處理組試蟲(chóng)羽化高峰仍然集中出現(xiàn)在ZT0時(shí)，但干涉處理組羽化高峰期的成蟲(chóng)羽化率顯著低于對(duì)照組試蟲(chóng)(t=2.998,P=0.040) (圖8: B)，干涉處理組試蟲(chóng)羽化時(shí)間也較對(duì)照組更加分散，但對(duì)Gmper和Gmtim進(jìn)行干涉后對(duì)試蟲(chóng)整體羽化率沒(méi)有顯著性影響(tper=1.457,Pper=0.219;ttim=1.251,Ptim=0.279) (圖8: C)。

圖8 分別RNAi干擾Gmper (A)和Gmtim (B)對(duì)梨小食心蟲(chóng)羽化節(jié)律以及總體羽化率(C)的影響Fig. 8 Effect of the RNAi-based Gmper (A) and Gmtim (B) silencing on the emergence rhythm and overall emergence rate (C) of Grapholita molesta ZT: 授時(shí)時(shí)間Zeitgeber time; ZT0-ZT14: 光期Photophase; ZT14-ZT24: 暗期Scotophase. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 柱上ns表示siRNA處理組和對(duì)照組(NC)間無(wú)顯著性差異(P>0.05, 獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))；星號(hào)和雙星號(hào)分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。Data in theFigure are mean±SE. ns above bars represents no significant difference between the siRNA treatment group and the control group (NC) (P>0.05, independent samples T-test), and the asterisk and double asterisk represent significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively by independent samples T-test.

3 討論

本研究通過(guò)基因克隆、序列分析、基因表達(dá)量測(cè)定及基于RNAi的基因功能研究，初步分析了梨小食心蟲(chóng)Gmper和Gmtim的組織和時(shí)間表達(dá)模式及對(duì)成蟲(chóng)羽化節(jié)律的調(diào)控作用。序列分析結(jié)果顯示，GmPER蛋白含有2個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域和1個(gè)PAC結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，GmPER和GmTIM均分別與鱗翅目昆蟲(chóng)的PER和TIM聚為一支(圖3和4)，但與昆蟲(chóng)間親緣關(guān)系的一致性有差異，部分進(jìn)化樹(shù)上很多節(jié)點(diǎn)的支持值較小，一方面這可能是由于兩個(gè)基因處于較為活躍的進(jìn)化中，另外，鑒于已報(bào)道的昆蟲(chóng)per和tim基因的全序列較少，分析樣本不足可能也會(huì)影響其準(zhǔn)確性。在后續(xù)獲得較多的全長(zhǎng)基因序列后進(jìn)行進(jìn)一步比對(duì)，會(huì)得到更為可靠的分析結(jié)果。

在果蠅研究中，PAS (Per-Arnt-Stim)功能域，可以作為一個(gè)開(kāi)關(guān)進(jìn)行PER蛋白和TIM蛋白的結(jié)合調(diào)控(Yildizetal., 2005; Kingetal., 2011)。另外PAS+PAC結(jié)構(gòu)域可以充當(dāng)光傳感器功能，接受外界環(huán)境光信號(hào)進(jìn)而調(diào)控一系列下游回路(Ponting and Aravind, 1997)。TIM是一種酸性蛋白質(zhì)，不僅在周期節(jié)律中起到核心因子的作用，在生物發(fā)育中也有重要作用。如在哺乳動(dòng)物中，tim的缺失可導(dǎo)致上皮組織發(fā)育畸形，胚胎死亡率升高，近年來(lái)學(xué)者更是在其對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的預(yù)報(bào)功能上投入大量研究力量(宋何煜等, 2014)。蛋白激酶基因產(chǎn)物DBT對(duì)PER的穩(wěn)定性具有負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)也可以介導(dǎo)磷酸化后的PER與TIM結(jié)合形成穩(wěn)定二聚體。在果蠅中PER/TIM復(fù)合體可抑制CYC和CLK的轉(zhuǎn)錄，CRY經(jīng)光誘導(dǎo)后作用于TIM使其降解，自此PER/TIM復(fù)合體降解，CYC和CLK的新一輪轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)(Ashmore and Sehgal, 2003)。因此，per和tim在昆蟲(chóng)體內(nèi)作為重要的生物鐘反饋途徑元件保證了生物體一天24 h的行為活動(dòng)節(jié)律。

基因表達(dá)水平檢測(cè)表明，梨小食心蟲(chóng)雌雄成蟲(chóng)中，Gmper和Gmtim的表達(dá)水平均在頭部最高(圖5)。在果蠅中，生物鐘可分為中樞生物鐘和外周生物鐘，中樞生物鐘被定位于頭部，梨小食心蟲(chóng)體內(nèi)Gmper和Gmtim在頭部的高表達(dá)說(shuō)明兩基因也在中樞生物鐘中發(fā)揮更重要的調(diào)控作用，若要進(jìn)一步探究其調(diào)節(jié)中樞可再?gòu)哪X部、觸角、復(fù)眼等結(jié)構(gòu)進(jìn)行更細(xì)致的表達(dá)分析。蛹頭部Gmper和Gmtim的表達(dá)峰值均出現(xiàn)在暗期，在光期呈現(xiàn)表達(dá)水平低谷，且雄蛹中的表達(dá)水平顯著高于雌蛹(圖6)，說(shuō)明蛹期兩基因的表達(dá)具有一定的晝夜節(jié)律性但同時(shí)存在一定的性別差異。兩基因在夜間的大量表達(dá)與果蠅中tim和per的消長(zhǎng)規(guī)律較為吻合(Tataroglu and Emery, 2014)。由于梨小食心蟲(chóng)的羽化高峰出現(xiàn)在凌晨，因此推測(cè)，蛹期生物鐘基因在夜間的高表達(dá)可能對(duì)次日黎明的羽化有重要調(diào)控作用。果蠅的相關(guān)研究結(jié)果也表明，羽化節(jié)律的準(zhǔn)確性依賴于晝夜節(jié)律調(diào)控作用的加強(qiáng)(Varmaetal., 2019)。雖然光照對(duì)蛹期Gmper和Gmtim的表達(dá)有顯著的抑制效果，但昆蟲(chóng)各個(gè)時(shí)期對(duì)光的敏感性可能存在差異，如在家蠶中發(fā)現(xiàn)卵孵化期給予的光周期、溫度變化對(duì)幼蟲(chóng)至蠶蛾期的per和tim表達(dá)無(wú)顯著性影響(宋艷, 2009)。在鱗翅目昆蟲(chóng)中，per的作用和該基因在晝夜節(jié)律中的負(fù)反饋?zhàn)饔么嬖跔?zhēng)議，但近年來(lái)通過(guò)基因敲除技術(shù)對(duì)家蠶的研究發(fā)現(xiàn)，敲除per的試蟲(chóng)出現(xiàn)羽化規(guī)律紊亂現(xiàn)象(Ikedaetal., 2019)，這為進(jìn)一步探索per在鱗翅目昆蟲(chóng)晝夜節(jié)律調(diào)控中發(fā)揮的作用提供了基礎(chǔ)和方向。在梨小食心蟲(chóng)中，雌蛹Gmper和Gmtim的表達(dá)高峰期較雄蟲(chóng)略有提前(圖6)，猜測(cè)可能與雌蟲(chóng)的卵巢發(fā)育、交尾行為等有關(guān)。在哺乳動(dòng)物中，確有大量數(shù)據(jù)表明per的缺失會(huì)導(dǎo)致卵巢發(fā)育受阻和產(chǎn)仔量下降(李瑞文, 2013; 劉超, 2015)。在昆蟲(chóng)中，per,tim和dbt等生物鐘基因的缺失對(duì)于昆蟲(chóng)的卵泡發(fā)育、產(chǎn)卵行為、卵孵化率等都具有較大影響。如在果蠅中，per和tim的缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅中成熟卵母細(xì)胞數(shù)量下降，而雌蟲(chóng)的產(chǎn)卵量可下降近50%(Beaveretal.，2003)。在雙斑蟋Gryllusbimaculatus中tim2基因缺失后除了影響試蟲(chóng)的活動(dòng)節(jié)律之外，卵巢中卵母細(xì)胞的數(shù)量會(huì)大大下降，且卵孵化率下降至2%以下(Noseetal., 2017)，因此生物鐘基因?qū)ι诚到y(tǒng)影響的探究極具研究潛力，可作為后續(xù)深入全面探究的切入點(diǎn)。面對(duì)諸多未探明的結(jié)果，昆蟲(chóng)全發(fā)育期的系統(tǒng)表達(dá)模式分析可為更加細(xì)致的探究per和tim的調(diào)控作用機(jī)制提供更多的參考信息。

Gmtim和Gmper的基因表達(dá)干涉對(duì)梨小食心蟲(chóng)的羽化節(jié)律有顯著影響。與對(duì)照相比，處理組節(jié)律性明顯減弱，表現(xiàn)出羽化時(shí)間點(diǎn)更加分散、羽化高峰期的羽化率顯著低于對(duì)照的現(xiàn)象(圖8: A, B)。果蠅的研究表明tim缺失型果蠅突變體timmutant的活動(dòng)節(jié)律出現(xiàn)紊亂，但其羽化規(guī)律沒(méi)有改變(Wülbecketal., 2005)。但麻蠅Sarcophagacrassipalpis的研究發(fā)現(xiàn)，per基因在溫度影響羽化節(jié)律的過(guò)程中起到極其重要的調(diào)控作用。類似地，蔥蠅Deliaantiqua的研究表明，溫度改變可導(dǎo)致昆蟲(chóng)羽化時(shí)間和生物鐘基因表達(dá)出現(xiàn)一致的改變。這些結(jié)果都說(shuō)明，生物鐘基因在某些種類昆蟲(chóng)的羽化過(guò)程發(fā)揮著重要作用 (Miyazakietal., 2016; Shortetal., 2016)。然而，不同物種的生活環(huán)境、生物學(xué)習(xí)性不同，因此種間的生物鐘基因種類、表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制等均可能存在差異。隨著更多相關(guān)研究，尤其是受物候變化影響巨大的農(nóng)林害蟲(chóng)的相關(guān)研究進(jìn)展的報(bào)道，將為我們進(jìn)一步理解生物鐘對(duì)昆蟲(chóng)羽化節(jié)律的調(diào)控作用提供更多參考，并可能為開(kāi)發(fā)基于發(fā)育和行為節(jié)律調(diào)控的害蟲(chóng)防控方法提供新思路或新靶標(biāo)。