肖小年，劉悅珍，易孜成，章 輝，劉 璟，王 凡，易醒

（南昌大學(xué)a.中德聯(lián)合研究院；b.中德食品工程中心，江西 南昌 330047）

肉桂（Cinnamomumcassia）屬于樟科（Lauraceae）植物，是一種常用的藥食兩用原料。中國(guó)是世界上肉桂產(chǎn)量最大的國(guó)家，種植歷史已經(jīng)超過2000年，種植區(qū)域主要是廣東和廣西兩省［1-3］。肉桂油能夠發(fā)揮抗氧化、抗菌、抗癌等多種作用，因此在食品、衛(wèi)生、制劑、包裝、化妝品等領(lǐng)域中被廣泛地應(yīng)用［4］。肉桂醛是肉桂油中的主要功效成分，含量高達(dá)90%，近些年來被學(xué)者們廣泛研究［5］?？诜夤鹑┛梢源碳ひ葝u素的釋放并且改善胰島素敏感性，從而發(fā)揮降血糖的作用［6-9］。肉桂醛也可以通過刺激AMPK活化，促進(jìn)脂肪酸氧化，阻止細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞形成［9-10］。此外，大量的研究也已證實(shí)，肉桂油對(duì)細(xì)菌和真菌都有很強(qiáng)的抑制作用［11-15］。肉桂油（Cinnamon Oil，CO）溶解度低、揮發(fā)性強(qiáng)，在加工、利用和貯存過程中易在空氣、光和加熱作用下分解［4］，并且肉桂醛很容易在血液中轉(zhuǎn)化為肉桂酸，從而影響肉桂油發(fā)揮其藥理活性［16］。因此構(gòu)建一種提高肉桂油水溶性和穩(wěn)定性的制劑是十分必要的。

微乳是一個(gè)由水、油和雙親性物質(zhì)表面活性劑組成的熱力學(xué)穩(wěn)定的各向同性液體［17］。微乳不僅對(duì)難溶性及脂溶性的藥物具有增溶作用，還能夠提高藥物的穩(wěn)定性，因此在中醫(yī)藥中，用微乳作為制劑的應(yīng)用越來越多［18］。制備肉桂油的O／W型微乳，是一種提高肉桂油的溶解性、穩(wěn)定性以及保持其功能性的有效的辦法。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)肉桂油的研究主要集中在提取、化學(xué)成分鑒定以及相關(guān)制劑的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)［19-23］，對(duì)于肉桂油微乳在體外釋放方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。在本研究中，我們討論了表面活性劑和助表面活性劑的比例（Km）以及溫度對(duì)于O／W型肉桂油微乳（Cinnamon Oil Microemulsion，COME）形成的影響。從離心、冷熱循環(huán)和長(zhǎng)期儲(chǔ)藏3個(gè)方面考察了肉桂油微乳的穩(wěn)定性。此外，還對(duì)肉桂油微乳在不同pH介質(zhì)中的釋放動(dòng)力學(xué)和機(jī)理進(jìn)行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂醛對(duì)照品≥99.5%，胃蛋白酶（酶活力1∶3000），胰酶，USP grade，阿拉丁試劑有限公司；肉桂油，吉安國(guó)光香料廠；甲醇，乙腈，色譜純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、EL-40、Span 80、Tween 80、無水乙醇、丙三醇均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

DDS-307型電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；WYA-2W型阿貝折射儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；PB-10型pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；NICOMP380ZL型激光納米粒度測(cè)定儀，美國(guó)PSS粒度分析儀公司；JB-3型恒溫磁力攪拌器，上海雷磁新涇儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉桂油微乳的制備

把肉桂油和肉豆蔻酸異丙酯（IPM）按1∶1的比例加入燒杯中，攪拌均勻以后再依次加入Tween 80和丙三醇，把蒸餾水逐滴地加入正在磁力攪拌的預(yù)混料中。并且在開始加入蒸餾水后，把電導(dǎo)率儀放入燒杯里面，不斷觀察電導(dǎo)率的變化并記錄，當(dāng)電導(dǎo)率出現(xiàn)最大值時(shí)，停止水相的加入，并且記錄下蒸餾水的用量。計(jì)算出油相、乳化劑和水相三相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并以此為基礎(chǔ)在偽三元相圖標(biāo)記為點(diǎn)，這些點(diǎn)的覆蓋面積就是所形成的微乳區(qū)域面積（Microemulsion Area，ME）。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)最大的微乳區(qū)域面積來選擇合適的組成和工藝條件。

1.3.2 表面活性劑和助表面活性劑的質(zhì)量（Km）的選擇

據(jù)1.3.1的實(shí)驗(yàn)步驟，在固定溫度下，選擇不同Km值（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，w／w）制備微乳并繪制偽三元相圖，選擇出合適的Km值。

1.3.3 溫度對(duì)肉桂油微乳制備的影響

分別于25℃，40℃，50℃的溫度下制備微乳，根據(jù)偽三元相圖微乳區(qū)域的大小來確定最佳溫度。

1.3.4 肉桂油微乳配方的優(yōu)化

CO／IPM（1∶1，w／w）作為混合油相，無水乙醇／丙三醇（1∶1，w／w）作為混合助表面活性劑，選擇Span 80和EL-40為表面活性劑分別與Tween 80進(jìn)行復(fù)配，固定Km=4，在40℃下，根據(jù)1.3.1節(jié)的方法制備O／W型肉桂油微乳。

1.3.5 微乳的判別及類型鑒別

將制備的澄清體系在4 000r·min-1條件下離心20min，通過觀察是否出現(xiàn)分層或者沉淀，來判斷微乳的形成。在制得的微乳體系中加入紅色的油溶性染料蘇丹Ⅲ和藍(lán)色的水溶性染料亞甲基藍(lán)，觀察兩種染料在微乳中的擴(kuò)散速度，判斷微乳的類型［24］。

1.3.6 COME理化參數(shù)的測(cè)定

利用NICOMP380ZL型激光納米粒度測(cè)定儀、DDS-307電導(dǎo)率儀以及WYA-2W型阿貝折射儀分別對(duì)肉桂油微乳的粒徑、平均分布、電導(dǎo)率和折光度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 肉桂油中肉桂醛的檢測(cè)［25］

液相色譜條件：色譜柱C18，5μm，4.6mm×250mm；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液（33∶67）；柱溫25℃；進(jìn)樣量20μL；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)285nm。

工作曲線的制備：精密稱量0.020 0g肉桂醛對(duì)照品，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中并定容，得到800μg·mL-1的肉桂醛儲(chǔ)備液。用甲醇將儲(chǔ)備液稀釋成系列質(zhì)量濃度為20，40，60，80，100，120，140，160μg·mL-1的對(duì)照品溶液，取20 μL進(jìn)樣，按照色譜條件檢測(cè)肉桂醛含量，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，以肉桂醛對(duì)照品濃度（x）對(duì)峰面積（y）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

COME供試品溶液：精密稱取4.00g COME，加入一定質(zhì)量的無水硫酸鈉，破乳后取上清液，用甲醇適當(dāng)稀釋，過0.45μm微孔濾膜，得到COME供試品溶液。

1.3.8 肉桂油微乳穩(wěn)定性考察

分別通過離心試驗(yàn)、加熱-冷卻循環(huán)實(shí)驗(yàn)、貯藏試驗(yàn)考察所制備的微乳配方的穩(wěn)定性。

1.3.9 體外釋放實(shí)驗(yàn)

人工腸液的配制（SIF）［26-27］：精確稱量磷酸氫二鉀（KH2PO4）6.8g，加蒸餾水溶解，移至500mL容量瓶并用蒸餾水定容。用濃度為0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8或者7.4；取胰酶10 g，加適量蒸餾水量溶解，將兩液混合均勻，移至1 000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即得pH 6.8和7.4的人工腸液。

三角瓶里面加入一定體積的SIF，以100 r·min-1的速度震蕩并且溫度保持在37℃±0.5℃。取20mL肉桂油微乳放入透析袋中，兩端用繩子扎緊后放進(jìn)三角瓶里面。以固定的時(shí)間間隔從三角瓶中取樣，取樣后立刻向三角瓶中加入同體積的相同溫度的人工腸液。參照1.3.7的方法對(duì)樣品進(jìn)行破乳并稀釋，測(cè)定肉桂醛含量，計(jì)算釋放液中肉桂醛含量?？瞻兹橐旱尼尫沤橘|(zhì)溶液同法處理。累積釋放速率用下式計(jì)算：

式中：Q為累積釋放百分?jǐn)?shù)（%）；V0為釋放介質(zhì)溶液總體積（mL）；V為取樣體積（mL）；Ct為在釋放時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的釋放介質(zhì)溶液中肉桂醛的濃度（mg·mL-1）；C為在前一個(gè)釋放時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的釋放介質(zhì)溶液中肉桂醛的濃度（mg·mL-1）；W為被包封的肉桂醛的總質(zhì)量（mg）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 7.5進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 微乳配方的篩選

2.1.1 最佳Km值

通過比較偽三元相圖微乳區(qū)域大小來考察Km值（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，w／w）對(duì)微乳液制備的影響（圖1）。當(dāng)Km=1時(shí)，只有部分比例可以形成微乳，構(gòu)成的微乳區(qū)域最小。當(dāng)Km值為2，3和4時(shí)，在8∶1～4∶1都可以形成微乳，且微乳面積隨著Km值的增加而增大。這有可能是因?yàn)橹砻婊钚詣╇m然可以降低界面張力，但是當(dāng)助表面活性劑過量時(shí)，也相對(duì)地使表面活性劑的量減少了，從而乳化的能力也相應(yīng)地降低，并且還會(huì)使混合膜的強(qiáng)度和穩(wěn)定性降低，因此不利于微乳的形成［28］。因此確定最佳Km為4。

2.1.2 乳化溫度的選擇

根據(jù)2.1.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定攪拌速度，考察乳化溫度（25℃，40℃，50℃）對(duì)肉桂油微乳液制備的影響（圖2）。隨實(shí)驗(yàn)溫度的升高，ME先增加后減小。40℃的微乳區(qū)域面積最大，為最佳溫度。這可能是因?yàn)樯邷囟瓤梢约涌旆肿拥倪\(yùn)動(dòng)速度，能夠促進(jìn)水油兩相與混合膜的相互作用，從而降低界面表面張力，更有利于形成微乳［29］。但是，當(dāng)乳化溫度為50℃時(shí)，微乳制備過程中肉桂油的揮發(fā)不利于微乳的形成，因此形成的肉桂油微乳的面積變小。

2.1.3 肉桂油微乳配方的優(yōu)化

不同種類的表面活性劑的復(fù)合使用可以調(diào)節(jié)其HLB值，并且形成一種更為堅(jiān)固的復(fù)合凝聚膜，從而增加微乳的穩(wěn)定性［30-31］。因此，選取Span 80或者EL-40分別與Tween 80進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果如表1。Tween 80／Span 80組合無法形成微乳，而Tween 80／EL-40組合都能夠形成澄清透明的體系，且經(jīng)過4 000r·min-1，20min離心后沒有出現(xiàn)相分離。

2.2 肉桂油微乳類型鑒定及理化性質(zhì)

由2.1得出的最佳微乳制備條件為乳化溫度40℃，固定Km=4，所得最佳微乳配方為CO／IPM／Tween 80／EL 40／無水乙醇／丙三醇／水，其中CO／IPM=1∶1（w／w），Tween 80／EL-40=3∶1（w／w），無水乙醇／丙三醇=1∶1（w／w），蒸餾水含量為64.29%，肉桂油的最大含量為3.57%。將所制備的微乳在4 000r·min-1下離心20min，沒有出現(xiàn)相分離，初步表明所制備的乳液為微乳。如圖3，優(yōu)化以后的配方制備的乳液平均粒徑是14.6nm，多分布指數(shù)為0.111，進(jìn)一步表明形成了微乳。

表1 Tween 80與不同種類表面活性劑復(fù)配形成的COME

在微乳液中滴加亞甲基藍(lán)和蘇丹紅染色液，比較擴(kuò)散速度發(fā)現(xiàn)，水溶性亞甲基藍(lán)的擴(kuò)散速度快，說明制得的樣品為O／W型。O／W型、雙連續(xù)（BC）型和W／O型，這3種微乳可以在形成過程中通過電導(dǎo)率來區(qū)分［32］。所制備的微乳液電導(dǎo)率為228μs·cm-1，這是因?yàn)镃OME的連續(xù)相是水，電導(dǎo)率相對(duì)來說比較高。微乳的折光率（RI）為1.3829，接近水相的折射率，也進(jìn)一步證明形成了O／W型肉桂油微乳。樣品離心后，沒有出現(xiàn)沉淀、乳化和相分離的現(xiàn)象，說明樣品具有較好的物理穩(wěn)定性，構(gòu)建的微乳體系良好。

2.3 肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

在1.3.7節(jié)色譜條件下，對(duì)肉桂醛對(duì)照品溶液和COME供試品溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果如圖4，肉桂醛保留時(shí)間為（16.700±0.200）min，所得線性回歸方程為y=162.7x+169，R2=0.998，表明肉桂醛濃度在20μg·mL-1～160μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。經(jīng)計(jì)算，COME中肉桂醛含量為24.05mg·g-1。

2.4 肉桂油微乳的穩(wěn)定性

2.4.1 離心穩(wěn)定性

以10 000r·min-1離心30min，微乳外觀依然澄清透明，沒有出現(xiàn)沉淀、乳化，說明制備的微乳離心穩(wěn)定性良好。

2.4.2 冷熱循環(huán)穩(wěn)定性

將肉桂油微乳在40℃的條件下放置12h，取出后再在4℃溫度下放置12h，作為1次加熱-冷卻循環(huán)。肉桂油微乳經(jīng)過5次加熱冷卻循環(huán)后，沒有發(fā)生破乳、聚結(jié)和相分離，依然保持著良好的穩(wěn)定性。

2.4.3 貯藏穩(wěn)定性

將制備的肉桂油裝入密閉的容器中，30℃±2℃下放置6個(gè)月，期間測(cè)定其理化性質(zhì)、肉桂醛含量并目測(cè)微乳形態(tài)，結(jié)果如圖5。0～6個(gè)月間，微乳體系pH略有下降，這可能是因?yàn)樵趦?chǔ)藏過程中，微乳體系中的肉桂醛被氧化為肉桂酸，導(dǎo)致pH值變小。微乳體系的電導(dǎo)率呈先增大后減小的趨勢(shì)，在0～1個(gè)月間增加較大，1～6個(gè)月間變化較小。在貯藏過程中，微乳體系的折光率變化并不明顯。微乳中的肉桂醛含量在貯藏期間只稍微降低，6個(gè)月之后，微乳中肉桂醛的保留率高達(dá)92.79%。而同等條件下，普通肉桂油的保留率僅有46.52%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，微乳體系可以成功地提高肉桂油的穩(wěn)定性。

2.5 pH對(duì)肉桂油釋放速率的影響

從圖6可以看出，肉桂油微乳在pH 6.8和pH 7.4的人工腸液中的累計(jì)釋放率都隨著時(shí)間而增加。在8h時(shí)，肉桂油在pH 6.8的人工腸液中的釋放率達(dá)到了31.21%，而在pH 7.4中只有18.62%，說明不同的pH值對(duì)肉桂油微乳的體外釋放行為有影響。從釋放總量來看，到8h時(shí)，兩種介質(zhì)中的釋放總量都不到一半，這說明還有釋放的可能，8h后的釋放情況還有待進(jìn)一步研究。

2.6 體外釋放動(dòng)力學(xué)模型的建立

繪制累積釋放率與時(shí)間的關(guān)系并用5個(gè)經(jīng)驗(yàn)方程來擬合（圖6），分析肉桂油微乳在兩種不同釋放介質(zhì)中的釋放動(dòng)力學(xué)。在不同的pH條件下，由5個(gè)動(dòng)力學(xué)方程分別得到R2（表2，3）。

通過比較R2值表明，在pH 6.8和pH 7.4SIF中，Retger-peppas方程的擬合都優(yōu)于其他4個(gè)動(dòng)力學(xué)方程。這些結(jié)果顯示Retger-peppas方程適合COME的釋放擬合。

表2 COME在pH 6.8人工腸液中的釋放動(dòng)力學(xué)模型建立結(jié)果

表3 COME在pH 7.4人工腸液中的釋放動(dòng)力學(xué)模型建立結(jié)果

通過Retger-peppas方程，可以研究肉桂油釋放的機(jī)理和動(dòng)力學(xué)。方程如下式：Q=k×tn

其中k是系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，n是擴(kuò)散指數(shù)，是分析釋放速率機(jī)制的重要參數(shù)［33］。肉桂油微乳在兩種pH的人工腸液中的n值都介于0.45和0.85之間，表明肉桂油的釋放屬于非Fickian擴(kuò)散機(jī)制，依賴于藥物擴(kuò)散和聚合物松弛的共同作用，藥物釋放的過程加快，因此高于Fickian釋放［33-34］。k值與釋放速度動(dòng)力學(xué)有關(guān)，k值越高，藥物的釋放速度越快［35］。

表4總結(jié)了肉桂油在pH 6.8和pH 7.4釋放的k值和n值?？梢钥闯觯趐H 6.8的人工腸液中，釋放的k值（8.663 58）大于7.4的人工腸液（3.868 59）。這說明肉桂油微乳在酸性環(huán)境中比在堿性環(huán)境中釋放的更快，這與累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)Q的結(jié)果是一致的。

表4 pH 6.8和pH 7.4人工腸液中COME的擴(kuò)散指數(shù)（n）和擴(kuò)散常數(shù)（k）

3 結(jié)論

本研究制備了O／W型肉桂油微乳，確定最佳配方為CO／IPM／Tween 80／EL 40／無水乙醇／丙三醇／水體系，其中 Tween 80／EL-40=3∶1（w／w），無水乙醇／丙三醇=1∶1（w／w），Km=4，最佳制備溫度為40℃，肉桂油含量為3.57%，經(jīng)染色法鑒定為O／W型微乳。結(jié)果表明，肉桂油微乳具有良好的離心穩(wěn)定性，冷熱循環(huán)穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，在貯藏6個(gè)月以后，肉桂油微乳中肉桂醛的保留率較普通肉桂油提高了1倍，表明將肉桂油制成微乳是解決肉桂油易氧化、易揮發(fā)問題的有效方法。

體外釋放實(shí)驗(yàn)及釋放動(dòng)力學(xué)模型擬合方面的的結(jié)果表明，肉桂油在pH 6.8人工腸液中的釋放速率比pH 7.8人工腸液更快，兩種介質(zhì)中的釋放動(dòng)力學(xué)都與Retger-peppas方程擬合度最高，釋放機(jī)制屬于非Fickian釋放。全面地考察肉桂油微乳的生物利用度，有待于對(duì)肉桂油微乳的腸吸收情況做進(jìn)一步研究。