單潔齡 李志強(qiáng) 吳書(shū)菊△

（1.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院，上海 200125；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

缺血性腦血管病是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的高危疾病，約占腦血管疾病的70%～80%，是因腦部血液循環(huán)障礙引發(fā)缺血、缺氧，導(dǎo)致局部腦組織變性壞死，腦組織受損［1］。腦缺血在發(fā)生和發(fā)展中多伴有炎癥反應(yīng)，在急性期尤為明顯。凋亡是腦缺血神經(jīng)元死亡的主要方式，是目前腦缺血機(jī)制研究的熱點(diǎn)。目前研究認(rèn)為，Bcl-2和p53是最重要的調(diào)控基因［2］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性期腦缺血的機(jī)制為痰瘀互結(jié)、兼夾氣血不足、脾胃升降失調(diào)，所致腦脈不通，治宜活血醒腦開(kāi)竅［3-4］。清開(kāi)靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開(kāi)竅之功效，用于治療熱病神昏、中風(fēng)偏癱、神志不清等腦血管病，具有較好的臨床療效［5］，但其作用機(jī)制研究尚不明確。本研究旨在觀察清開(kāi)靈注射液對(duì)腦缺血模型大鼠急性期的腦組織病理學(xué)、炎癥因子及腦細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，旨在為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于上海邦耀生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（滬）2018-0034。置于（23±2）℃室溫中，晝夜節(jié)律，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)環(huán)境7 d后于9∶00～17∶00進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與儀器

清開(kāi)靈注射液（廣州白云上制藥有限公司，批號(hào)181205）；尼莫地平注射液（上海信誼金朱藥業(yè)有限公司，批號(hào)190407）；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蘇木素和伊紅以及TTC（Sigma公司）、BCA蛋白定量試劑盒和trizol試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、兔p53和Bcl-2抗體（Sigma公司），PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；免疫組組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于凋亡試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；GAPDH抗體購(gòu)與Cell Signaling Technology公司；PBS緩沖液和二抗由碧云天生物技術(shù)研究所提供；其他試劑均為分析純購(gòu)于天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉注射液（批號(hào)07112133）由山東康寧藥業(yè)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 分組與造模

將評(píng)分相近的60只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，即假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組。參考文獻(xiàn)［6］制備腦缺血大鼠模型，將除假手術(shù)組外的大鼠，采用水合氯麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺(tái)，采用改良線栓法制作腦缺血大鼠模型，分組分籠飼養(yǎng)，不禁食水。假手術(shù)組大鼠僅用玻璃分針游離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈不做結(jié)扎處理。造模成功后7 d，陽(yáng)性組給予尼莫地平注射液10 mg/kg腹腔注射；實(shí)驗(yàn)組給予清開(kāi)靈注射液50 mg/kg腹腔注射，對(duì)照組和模型組均給予同體積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，連續(xù)7 d。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 采用BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分［7］評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能，于術(shù)后7 d后對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分并記錄結(jié)果，分為各關(guān)節(jié)活動(dòng)能力、后肢步態(tài)及協(xié)調(diào)能力以及運(yùn)動(dòng)過(guò)程中爪的精細(xì)動(dòng)作等3部分，共21分，評(píng)分越高運(yùn)動(dòng)功能越理想。采用Garcia評(píng)分法［8］對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，總分計(jì)3～18分，得數(shù)越低，損傷程度越重。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 腦組織梗死情況及神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 造模7 d后，頸椎脫臼法處死大鼠后迅速剝?nèi)∧X組織，置于-20℃冰箱中15 min。取出腦組織，剝離海馬CA1區(qū)，0.9%氯化鈉注射液清洗，固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片。取切片置于2%TTC染色液中染色，避光孵育30 min，10%甲醛固定，通過(guò)經(jīng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腦梗死面積。其中梗死的腦組織呈白色，正常的腦組織為紅色。取切片脫蠟脫水，置于TUNEL試劑盒反應(yīng)液和復(fù)合液中進(jìn)行DAB顯色，蘇木素染色5 min后封片，陰性對(duì)照置于蒸餾水中，顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，選取5個(gè)400倍視野分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目。

1.5.2 炎癥因子的測(cè)定 7 d后收集3 mL腹動(dòng)脈血液，離心，分離血清，ELISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）以及白介素-18（IL-18）炎癥因子水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5.3 凋亡基因測(cè)定 稱取200 mg腦組織進(jìn)行樣品制備，trizol法提總RNA，取1 g總RNA進(jìn) 行逆轉(zhuǎn)錄cRNA合成，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和相關(guān)引物的說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量的試劑進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠分析儀檢測(cè)目的cRNA。BCA法測(cè)定蛋白濃度，Western blotting檢測(cè)Bcl-2表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)p53表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 RT-PCR相關(guān)參數(shù)

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)比較組內(nèi)和組間差異；計(jì)數(shù)資料以（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的BBB評(píng)分和神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的BBB評(píng)分和神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于模型組（P＜0.05），兩組大鼠的BBB評(píng)分和神經(jīng)功能評(píng)分間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠的BBB評(píng)分和神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，±s）

表2 各組大鼠的BBB評(píng)分和神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性組實(shí)驗(yàn)組n 10 10 10 10 BBB評(píng)分19.40±2.04 8.27±1.34*13.14±0.81*#15.62±0.76*#神經(jīng)功能評(píng)分16.50±2.00 8.08±1.21*12.08±1.19*#14.25±0.92*#

2.2 各組大鼠腦組織梗死體積及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較

見(jiàn)表3。假手術(shù)組大鼠的腦組織細(xì)胞未見(jiàn)明顯病理改變、神經(jīng)元排列緊密整齊，核仁明顯可見(jiàn)，居中，細(xì)胞膜清晰。模型組腦組織神經(jīng)元明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊構(gòu)型紊亂，不規(guī)則出現(xiàn)不同程度變性壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)、核體固縮深染；與模型組相比，陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)元均明顯增多，有不同程度的緩解恢復(fù)，核固縮核體均有不規(guī)則程度的減輕，間質(zhì)水腫減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，見(jiàn)圖1～圖2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的腦梗死體積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯升高（P＜0.05），給予藥物治療后，陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組的腦梗死體積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平明顯降低（P＜0.05），兩組間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較（±s）

表3 各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性組實(shí)驗(yàn)組n 15 15 15 15腦梗死體積（%）0.00±0.00 45.37±4.38*32.03±5.01*#33.95±3.96*#神經(jīng)細(xì)胞凋亡（個(gè)）11.12±1.87 65.28±7.26*30.98±3.42*#32.15±4.05*#

圖1 各組大鼠的腦組織病理圖（TTC，400倍）

圖2 各組大鼠的腦組織梗死面積比較

2.3 各組大鼠炎癥因子水平比較

見(jiàn)表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18水平明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的炎癥因子水平明顯降低（P＜0.05），兩組大鼠的炎癥因子比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表4 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

與陽(yáng)性組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性組實(shí)驗(yàn)組n 15 15 15 15 TNF-α 45.89±6.16 124.75±12.08*75.09±9.14*#64.28±7.32*#△IL-1β 34.53±4.67 106.72±13.85*64.66±7.54*#55.69±6.71*#△IL-6 26.12±2.67 78.47±7.86*50.57±4.45*#42.87±3.09*#△IL-18 23.14±2.59 61.23±6.12*40.47±5.74*#35.12±3.26*#△

2.4 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達(dá)比較

見(jiàn)表5，圖3。與假手術(shù)組比較，Bcl-2基因表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)的相對(duì)豐度值明顯降低，具有顯著差異（P＜0.05），模型組大鼠的凋亡基因p53基因表達(dá)和p53蛋白表達(dá)的相對(duì)豐度值明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，Bcl-2基因表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)的相對(duì)豐度值明顯高于模型組（P＜0.05），陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的p53基因表達(dá)和p53蛋白表達(dá)的相對(duì)豐度值明顯低于模型組，兩組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表5 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達(dá)比較（分，±s）

表5 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達(dá)比較（分，±s）

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性組實(shí)驗(yàn)組n 15 15 15 15 Bcl-2基因表達(dá)0.86±0.15 0.21±0.06*0.68±0.18*#0.73±0.10*#△蛋白表達(dá)的相對(duì)豐度值0.97±0.11 0.39±0.09*0.74±0.12*#0.87±0.17*#△p53基因表達(dá)1.21±0.16 15.37±1.38*9.53±1.11*#8.72±1.52*#△蛋白表達(dá)的相對(duì)豐度值0.33±0.14 1.12±0.07 0.78±0.10*#0.62±0.09*#△

圖3 各組大鼠的凋亡相關(guān)蛋白電泳條帶

3 討 論

腦缺血病理生理變化與炎癥因子及氧自由基大量產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的啟動(dòng)等多方面因素密切相關(guān)［9］。神經(jīng)功能和神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)對(duì)腦缺血疾病的研究具有重要作用，可真實(shí)反映腦缺血疾病程度。炎癥在腦缺血病程進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，腦缺血可打破促炎和抗炎反應(yīng)間的動(dòng)態(tài)平衡，且炎癥標(biāo)志物水平與預(yù)后不良密切相關(guān)［10-11］，研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血的炎癥反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，腦部缺血中心區(qū)的壞死組織因大量的炎癥介質(zhì)及炎癥因子的釋放，激活免疫應(yīng)答，加重炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)釋放大量的氧自由基、一氧化氮、興奮性氨基酸等毒性物質(zhì)，相互作用明顯造成腦組織不可逆的損傷，可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡甚至壞死，加重腦損傷［12］。TNF-α是炎癥反應(yīng)的起始因子，具有多效促炎性及神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，致使內(nèi)皮細(xì)胞屏障的滲透性增加［13］。IL-1β是腦缺血狀態(tài)下由星形膠質(zhì)細(xì)胞等大量分泌而成的，參與炎癥級(jí)聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)，是腦缺血早期炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子，是腦缺血損傷的病理生理基礎(chǔ)。而且IL-1β的激活會(huì)促進(jìn)TNF-α分泌，同時(shí)二者會(huì)增加其他炎癥因子表達(dá)，導(dǎo)致腦損傷程度加重。IL-6為炎癥遞質(zhì)，可加重腦缺再灌注的全身反應(yīng)和局部損傷。IL-18參與了急性腦損傷的病理生理過(guò)程，且其血清中含量與腦損傷程度密切相關(guān)，對(duì)于臨床診斷預(yù)后判斷和提高患者救治水平有重要意義［14］。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體受刺激后一系列基因參與的細(xì)胞自主有序的程序性死亡，Bcl-2、P53等是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的關(guān)鍵。Bcl-2為高度同源蛋白中的經(jīng)典的抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，在調(diào)控細(xì)胞自噬的過(guò)程中也有重要作用［15］。此外，Bcl-2還能調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬和凋亡［16］。p53作為轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋，是調(diào)控的凋亡蛋白中的重要成員之一［17］。

腦缺血屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，痰瘀互結(jié)、腦脈不通為病機(jī)，氣血、脾胃升降失調(diào)，治宜活血醒腦開(kāi)竅。清開(kāi)靈注射液方中水牛角粉清熱定驚、涼血解毒、為君藥。膽酸、豬去氧膽酸清熱解毒、息風(fēng)止痙、開(kāi)竅豁痰；梔子、板藍(lán)根、黃芩、金銀花清熱解毒，燥濕瀉火，共為臣藥。佐以珍珠母清心肝之火而明目。諸藥相合，共奏清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開(kāi)竅之功?，F(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)［18-20］，水牛角有明顯的抗炎作用，可用于炎癥性疾病的治療；黃芩苷可通過(guò)調(diào)控線粒體自噬減輕胞神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧再灌注損傷；梔子中的活性成分梔子苷和西紅花苷I，可通過(guò)改善線粒體的能量代謝抗氧化抗炎抑制細(xì)胞凋亡等途徑在腦缺血的治療中發(fā)揮作用，而且黃芩苷梔子苷配伍可通過(guò)抑制興奮性氨基酸的釋放而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低，大鼠的腦組織神經(jīng)元明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊構(gòu)型紊亂，不規(guī)則出現(xiàn)不同程度變性壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)、核體固縮深染，腦梗死體積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL18水平。給藥后，陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的神經(jīng)元均明顯增多，有不同程度的緩解恢復(fù)，核固縮核體均有不規(guī)則程度的減輕，間質(zhì)水腫減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，神經(jīng)功能評(píng)分和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯升高，腦梗死體積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥因子水平明顯低于模型組，提示清開(kāi)靈注射液能有效地提高腦缺血大鼠的神經(jīng)功能和神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)，減少腦梗死體積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，降低炎癥因子水平。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦部Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，p53表達(dá)顯著上調(diào)。給予藥物干預(yù)后，陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組的大鼠腦部Bcl-2蛋白水平顯著上調(diào)，p53表達(dá)顯著下調(diào)，提示清開(kāi)靈注射液能有效地調(diào)整凋亡相關(guān)因子表達(dá)，減少腦部細(xì)胞的死亡，激活腦細(xì)胞自我保護(hù)。

綜上所述，清開(kāi)靈注射液對(duì)腦缺血模型大鼠可有效地減少腦梗死面積，保護(hù)腦組織免受炎癥因子的損傷，調(diào)整凋亡相關(guān)因子表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，激活腦細(xì)胞自我保護(hù)。