黃心怡，周 瑞，胡佳穎，金 典，張辰歡，陸洪良

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 311121)

苯噻草胺(英文名mefenacet，分子式C16H14N2O2S)是20世紀80年代研發(fā)的一種酰胺類除草劑，主要通過抑制禾本科雜草細胞生成和分裂而達到除草的效果[1].因其低毒、高效除草作用，苯噻草胺在我國水稻田間得到了廣泛的應用.在生產(chǎn)實踐中，田間苯噻草胺施用后大部分在數(shù)天內(nèi)得到降解(稻田水體半衰期1.6～2.1 d，土壤半衰期3.7～12.3 d[2]).然而，部分殘留物及其降解產(chǎn)物仍可能長時間存留于水體或稻田土壤中，從而對生活于水體及土壤中的生物造成毒害作用[3-4].目前，僅有少數(shù)研究報道了苯噻草胺對包括浮游植物、兩棲類幼體在內(nèi)的水生生物毒理效應[4-6].例如，苯噻草胺的施用對稻田熱帶爪蟾(Siluranatropicalis)蝌蚪顯示出微弱的毒害作用[5].

龜鱉類動物大部分時間生活于水體中，水中的農(nóng)藥殘留物可能會在其體內(nèi)不斷累積而造成長期傷害.中華鱉(Pelodiscussinensis)是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟動物，在南方各省區(qū)被廣泛養(yǎng)殖.這些地區(qū)，中華鱉常養(yǎng)殖于緊鄰稻田的人工池塘，稻田中施用的農(nóng)藥殘留物很可能隨水流進入養(yǎng)殖塘.此外，中華鱉卵常被產(chǎn)于水塘邊堤岸的土壤中，發(fā)育中的胚胎潛在地會受到土壤中殘余農(nóng)藥的毒害作用.檢測稻田常用農(nóng)藥對中華鱉個體以及胚胎發(fā)育的作用，既可增加基礎性的毒理學數(shù)據(jù)，也有助于商品中華鱉的食品安全風險評估.本文用不同濃度的苯噻草胺處理孵化過程中的中華鱉受精卵以檢測該除草劑對其胚胎發(fā)育、孵出幼體形態(tài)、運動表現(xiàn)及肝臟生理的影響.

1 材料與方法

1.1 中華鱉受精卵收集

從余杭龜鱉養(yǎng)殖場購買新生的中華鱉受精卵150枚，帶回實驗室，測量每一卵的大小(直徑和質(zhì)量)并編號，隨機分為5個不同苯噻草胺質(zhì)量濃度處理組(蒸餾水組、助溶劑組(二甲基亞砜)、0.6、6.0、60.0 mg/L)，每組30枚.所有受精卵分配到含有-220 kPa濕度基質(zhì)(m蛭石∶m水=1∶1)的孵化盒中，利用點光源確定胚胎位置，受精卵放入基質(zhì)時將胚胎位置向上，并在每個胚胎上放置大小相等的紗布小圓片(打孔器打出)，孵化盒放置在預先設定為30 ℃的恒溫孵化箱中孵化.每隔1 d檢查是否有發(fā)霉的鱉卵，補充因蒸發(fā)失去的水分，并調(diào)節(jié)孵化盒在孵化箱內(nèi)的相對位置，以排除孵化箱內(nèi)部溫差所造成的潛在影響.

1.2 中華鱉受精卵孵化處理

根據(jù)處理組濃度，每隔1 d用移液槍吸取100 μL的相應苯噻草胺溶液滴加在胚胎位置的中華鱉受精卵表面紗布上.在孵化過程中每隔3 d檢查鱉卵的發(fā)霉情況，及時補充基質(zhì)水分和移除霉變的卵.

1.3 幼體大小與運動表現(xiàn)

幼體孵出后，記錄孵出時間以計算孵化期，檢查其形態(tài)畸形情況，用電子天平測量幼體質(zhì)量，待腹部卵黃完全吸收后，在29 ℃體溫條件下測定幼體運動(游泳)表現(xiàn).測定游泳表現(xiàn)時，將動物放在120 cm×10 cm×20 cm的玻璃泳道，用毛刷驅(qū)趕動物向前游動，同時用SONY DCR-SR220E數(shù)碼攝像機拍攝動物在泳道中的游泳過程，隨后分析行為錄像.截取其中動物持續(xù)向前游動的3個不同視頻片段，計算每一片段中動物游過25 cm距離的速度(cm/s)，取平均值用于后續(xù)統(tǒng)計分析.

1.4 幼體生長發(fā)育情況

孵化出的中華鱉幼體單獨飼養(yǎng)于直徑為20 cm的盒內(nèi)，盒內(nèi)含水高度約3 cm，定期喂食，每隔一個月用電子天平測量其質(zhì)量，并與原來質(zhì)量進行比較分析.

1.5 幼體肝臟生理指標

購買魚甘油三酯(triglyceride, TG)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)ELISA檢測試劑盒.隨機選取剛孵出幼鱉每組10只，放置在碎冰上麻醉后解剖，取肝臟，并稱重.將肝臟按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9比例加入0.85%生理鹽水，冰水浴上機械研磨成勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書來測定肝臟TG含量和SOD活力.將得到的中華鱉幼體肝臟濕質(zhì)量除以其自身體質(zhì)量來表示其肝臟指數(shù).

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計分析.對數(shù)據(jù)進行參數(shù)統(tǒng)計分析前，分別檢驗其正態(tài)性(Kolmogorov-Smirnov檢驗)和方差同質(zhì)性(Bartlett檢驗).用單因子方差分析檢測苯噻草胺處理對中華鱉受精卵大小、孵化期、孵出幼體游泳速度、肝臟生理指標的影響；以卵質(zhì)量為協(xié)變量的單因子協(xié)方差分析檢測苯噻草胺處理對孵出幼體大小(體質(zhì)量)的影響；用重復測量方差分析檢測孵出幼體早期生長情況；用卡方(χ2)檢驗檢測不同濃度苯噻草胺處理組卵孵化成功率的差異.描述性統(tǒng)計值用平均值±標準誤表示，顯著性水平設置為α =0.05.

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苯噻草胺對中華鱉胚胎發(fā)育的影響

入孵的中華鱉卵皆是受精卵，孵化過程中可見其受精白斑在不斷擴大，直至整顆卵呈白色.不同處理組的初始卵質(zhì)量無顯著組間差異(F4, 148=1.17,P=0.326).苯噻草胺處理對孵化成功率(χ2=0.40,df=4,P=0.983)無顯著影響，但苯噻草胺處理下的卵孵化時間有所縮短(F4,128=6.20,P<0.01)(表1).

表1 不同濃度苯噻草胺處理下中華鱉入孵卵大小、孵化率及孵化時間Tab.1 Egg size, hatching success and incubation period of Pelodiscus sinensis under different concentration treatments of mefenacet

2.2 不同濃度苯噻草胺對中華鱉孵出幼體大小和游泳速度的影響

苯噻草胺處理對孵出幼體大小(以卵質(zhì)量為協(xié)變量的協(xié)方差分析：F4,126=1.06,P=0.377)和肝臟大小(以幼體質(zhì)量為協(xié)變量的協(xié)方差分析：F4,39=1.80,P=0.149)無顯著影響.苯噻草胺處理對孵出幼體游泳速度無顯著影響(F4,80=1.76,P=0.146)(圖1).

圖1 不同苯噻草胺處理組孵出中華鱉幼體游泳速度Fig.1 Swimming performance of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

2.3 不同濃度苯噻草胺對中華鱉幼體生長發(fā)育情況的影響

孵出幼體在前3個月內(nèi)體質(zhì)量增加明顯(F3,240=2333.05,P<0.001)，但是苯噻草胺處理對幼體早期生長的影響不顯著(F4,80=0.89,P=0.477)(圖2).

圖2 不同苯噻草胺處理組中華鱉幼體的生長狀況Fig.2 Growth status of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

2.4 不同濃度苯噻草胺對中華鱉幼體肝臟甘油三酯含量和超氧化物歧化酶活性的影響

苯噻草胺處理對孵出幼體肝臟指數(shù)無顯著影響(F4,40=1.54,P=0.208)(圖3).苯噻草胺處理對孵出幼體肝臟TG含量(F4,45=0.34,P=0.849)和SOD活性(F4,45=1.73,P=0.160)無顯著影響(圖4).

圖3 不同苯噻草胺處理組中華鱉幼體的肝臟指數(shù)Fig.3 Liver index of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

3 討論

爬行動物胚胎發(fā)育期是生命周期中最為脆弱的時期.胚胎期直接暴露于一定濃度的農(nóng)藥下可能造成胚胎死亡或者孵出幼體畸形影響后續(xù)生存表現(xiàn).本研究測定的中華鱉所有變量(包括胚胎存活、孵出幼體表型及肝臟生理指標)在不同苯噻草胺濃度處理組間均無顯著差異，表明在一定濃度條件下苯噻草胺暴露對中華鱉胚胎發(fā)育及幼體的影響是有限的.胚胎期除草劑暴露對其他龜鱉類動物無明顯的毒害效應也見于其他研究，例如一定濃度的異丙甲草胺、草甘膦暴露對北美擬鱷龜(Chelydraserpentina)、紅耳滑龜(Trachemysscriptaelegans)和中華鱉胚胎及孵出幼體表現(xiàn)的影響并不大[7-9].當然在高濃度除草劑處理下也檢測到卵孵化成功率會有所降低[7].相反，殺蟲劑(如毒殺芬、溴氰菊酯)暴露常會直接引起龜鱉類動物胚胎死亡[10-11].因此，與其他有機磷除草劑或殺蟲劑農(nóng)藥相比，苯噻草胺對水生生物的毒害作用應是較低的.

已有研究也顯示，不同濃度的苯噻草胺處理對熱帶爪蟾(S.tropicalis)蝌蚪的毒害效應不明顯[4].在質(zhì)量濃度為0.03和0.3 mg/L的苯噻草胺處理下，并沒有觀察到虛弱或者死亡的爪蟾蝌蚪，所檢測的蝌蚪形態(tài)(脊柱側(cè)位畸形)及行為變量(不協(xié)調(diào)游泳、過度通氣、不典型靜止等)與助溶劑對照處理個體亦無顯著的差異[4].而在一項研究中顯示，苯噻草胺處理對熱帶爪蟾24 h的中致死質(zhì)量濃度為2.7～3.0 mg/L[5].此外，在不同藻類測試中，苯噻草胺的72 h半效應質(zhì)量濃度為0.25～0.67 mg/L[6].雖然苯噻草胺對水生動物的毒性較低，但是其所造成的潛在毒害仍然存在.在一定濃度范圍內(nèi)，苯噻草胺處理是否影響水生動物遺傳物質(zhì)損傷、某些基因表達等毒理效應仍有待于后續(xù)研究.

本研究中華鱉孵出幼體肝臟生理指標(肝臟指數(shù)、TG含量和SOD活性)不隨著苯噻草胺濃度的增加而改變，這與其他有機磷除草劑暴露的研究結(jié)果存在差異.例如，一些有機磷除草劑暴露可能導致受試動物肝臟脂肪積累而顯示出致肥胖效應[12]，SOD活性上升[13-14].苯噻草胺污染引起的SOD活性變化僅見于一些細菌研究，顯示出隨苯噻草胺濃度增加，SOD活性先上升后下降的趨勢[15-16].對于苯噻草胺暴露是否會引起水生動物肝臟生理及抗氧化防御反應變化的問題，仍需要在更多物種中進行相關(guān)測試才可能得以解答.