劉 暢，俸婷婷，劉雄偉，石 慧，沈奇濤，周 英

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院、2.藥食兩用資源應(yīng)用與開發(fā)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

山豆根為豆科植物越南槐(SophoratonkinensisGagnep.)的干燥根及根莖，味苦，性寒有毒，具有清火、解毒、消腫、止痛的功效。山豆根具有抗炎、抗心律失常、抗?jié)儽８蔚人幚碜饔?，同時(shí)也可引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，如神經(jīng)毒性、肝毒性、心血管毒性及引起胃腸道反應(yīng)、過敏反應(yīng)等，以神經(jīng)毒性最為典型[1]。神經(jīng)毒性反應(yīng)的臨床表現(xiàn)稱為山豆根中毒性腦病(radixsophoraetonkinensistoxic encephalopathy)[2]，其臨床表現(xiàn)為頭昏、眼花、疲乏無(wú)力、嗜睡等，嚴(yán)重者則大汗淋漓、視覺障礙、意識(shí)模糊，全身肌肉顫動(dòng)、抽搐、驚厥、昏迷，最終中樞性呼吸衰竭而死亡。山豆根主要含黃酮、生物堿及多糖類成分，如金雀異黃素、槐酮、槐定、苦參堿、氧化苦參堿、臭豆堿、金雀花堿、N-甲基金雀花堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐氨、槐醇等[3]?？鄥A、氧化苦參堿為主要的生物堿成分，既是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也是毒性物質(zhì)基礎(chǔ)[1]，而金雀花堿含量太低難以引起毒性反應(yīng)[4]。

山豆根中生物堿是引起毒性反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，超劑量服用是中毒的主要原因，據(jù)報(bào)道用量3～5 g未發(fā)生中毒事件，6～9 g發(fā)生中毒反應(yīng)的報(bào)道為4.7%，12～15 g發(fā)生中毒反應(yīng)的報(bào)道為17.6%[3]。研究表明，過量服用山豆根后，苦參堿、氧化苦參堿等生物堿成分可抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(acetylcholin esterase，AChE)活性，誘發(fā)惡心、嘔吐、頭暈、出汗、吞咽困難、構(gòu)音障礙，以及腹瀉、肌肉痙攣、全身抽搐等乙酰膽堿樣臨床癥狀[1]。山豆根能夠?qū)е律窠?jīng)中毒，但山豆根中有效成分的毒性作用分子機(jī)制，其有效成分占比與其所發(fā)揮的活性是否成比例，目前尚不清楚。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，藥物分子作用于單一靶點(diǎn)或信號(hào)通路的研究難以揭示其科學(xué)內(nèi)涵。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從相互關(guān)聯(lián)的角度研究問題，從整體水平上研究藥物的作用機(jī)制，為中藥復(fù)雜作用規(guī)律提供新的思路[5]。從系統(tǒng)、整體的角度將藥物和疾病關(guān)聯(lián)起來，從多個(gè)角度將藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與生物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，更加系統(tǒng)全面地研究藥物的作用機(jī)制。因此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路構(gòu)建山豆根“活性成分-靶點(diǎn)-通路”的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，探討山豆根神經(jīng)毒性潛在作用的分子機(jī)制。

1 方法

1.1 山豆根成分收集與篩選以“山豆根”為關(guān)鍵詞在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP(http://tcmspw.comltcmsp.php)中查找山豆根所含活性成分。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其活性成分Smiles化學(xué)式。利用相對(duì)分子質(zhì)量(MW)≤500，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18 篩選山豆根的活性成分。OB 值是評(píng)價(jià)藥物能否發(fā)揮藥效的重要指標(biāo)，DL 值代表成分與已知藥物的相似性，OB 值越高通常表示藥物的生物活性分子的DL值越好，對(duì)確定中藥成分是否對(duì)機(jī)體產(chǎn)生活性具有重要參考價(jià)值。CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)提供多種毒理學(xué)信息，將TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的化合物輸入CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行毒性查詢，得到山豆根中有毒的化合物成分。

1.2 作用靶點(diǎn)的篩選

1.2.1山豆根活性成分作用靶標(biāo)預(yù)測(cè) Swiss Target Prediction(http://www.swiss target prediction.ch/) 能夠精確預(yù)測(cè)生物活性分子靶點(diǎn)的服務(wù)器，根據(jù)化學(xué)成分的2D和3D結(jié)構(gòu)，基于Daylight FP2 的分子指紋方法，并采用Tanimoto系數(shù)定義的相似度度量方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用PubChem(https://pubchem.Ncbi.nlm.nih.gov/) 數(shù)據(jù)庫(kù)，將所有的化合物轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES 格式，將Canonical SMILES格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction平臺(tái)，將其屬性設(shè)置為“homo sapiens”，預(yù)測(cè)活性化合物的潛在靶點(diǎn)，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)將這些靶蛋白轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2.2神經(jīng)相關(guān)靶點(diǎn)的收集 通過GeneCards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)，以“toxic encephalopathy”或“nerve toxicity”為關(guān)鍵詞檢索與神經(jīng)毒性相關(guān)的基因，篩選并刪除重復(fù)靶點(diǎn)基因，與山豆根作用的靶標(biāo)基于進(jìn)行交集比對(duì)，最終獲得山豆根有毒化合物的神經(jīng)毒性潛在靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.3.1核心靶點(diǎn)之間的蛋白與蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖 為了分析山豆根神經(jīng)毒性靶點(diǎn)間的相互作用，將山豆根神經(jīng)毒性潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系，保存為TSV格式，把其中條目node1和node2數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，計(jì)算Degree值，將靶點(diǎn)大小和顏色設(shè)置用于反映節(jié)點(diǎn)數(shù)的大小，顏色的深淺設(shè)置用于反應(yīng)結(jié)合分?jǐn)?shù)的大小，從而獲得最終的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

由于廣義互相關(guān)算法(GCC-PHAT)[8]所需的數(shù)據(jù)量少且具有較好的抗混響能力,是目前基于到達(dá)時(shí)間差定位方法中使用較多的一種算法。信號(hào)x1和x2的廣義互相關(guān)函數(shù)的計(jì)算如式(1)所示:

1.3.2“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 將候選化合物與山豆根神經(jīng)毒性潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，建立山豆根毒性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)出山豆根引起神經(jīng)毒性反應(yīng)的化合物與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。化合物節(jié)點(diǎn)數(shù)(degree) 表示化合物對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)神經(jīng)毒性靶點(diǎn)的個(gè)數(shù)，度值較大的化合物進(jìn)行重點(diǎn)分析，靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)數(shù)(degree) 的度值越大，則這個(gè)靶點(diǎn)越有可能是化合物的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.4 靶點(diǎn)通路注釋分析GO(gene ontology)分析廣泛應(yīng)用于基因功能分類，主要用來描述基因的分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞組分。利用DAVID工具(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行對(duì)山豆根-中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損交集蛋白靶標(biāo)基因GO生物學(xué)過程富集分析(P<0.05)。應(yīng)用 KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)工具對(duì)山豆根-中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損交集蛋白靶標(biāo)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析(P<0.05)，篩選山豆根神經(jīng)毒性潛在靶點(diǎn)基因可能具有的生物學(xué)功能及參與的生物學(xué)通路。最后，將分析得到的靶點(diǎn)通路與山豆根成分相對(duì)應(yīng)，利用Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，形成毒性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 山豆根活性成分的篩選利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)收集到79個(gè)山豆根主要化學(xué)成分。篩選過程中發(fā)現(xiàn)部分成分未能滿足OB≥30%和DL≥0.18，但在山豆根中含量較高且有大量文獻(xiàn)證明其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害有關(guān)，所以也將其納入活性成分進(jìn)行研究，篩選主要的化學(xué)成分21個(gè)。將21個(gè)主要化學(xué)成分輸入比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD)數(shù)據(jù)庫(kù)，查找其毒理學(xué)作用，獲取15種山豆根毒性相關(guān)信息(Tab 1)。

Tab 1 The toxicity compound of Sophora tonkinensis Gagnep

2.2 候選化合物神經(jīng)毒性靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及篩選Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索15種山豆根候選毒性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白，合并以后去除重復(fù)的，整理得到14種化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)共343個(gè)(未查詢到臭豆堿對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn))，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)將靶蛋白轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與神經(jīng)毒性相關(guān)的基因，其中以“toxic encephalopathy”為關(guān)鍵詞檢索到226個(gè)基因，以“nerve toxicity”為關(guān)鍵詞檢索到到475個(gè)基因，合并去重復(fù)靶點(diǎn)后共得到554個(gè)基因。將此網(wǎng)絡(luò)與山豆根候選毒性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)功能相映射，篩選得到89個(gè)山豆根神經(jīng)毒性潛在的靶點(diǎn)。

2.3 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)作圖將篩選出的山豆根神經(jīng)毒性潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得蛋白相互作用關(guān)系，將其保存為TSV.文件，導(dǎo)入Cytoscape中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。核心靶點(diǎn)蛋白互作(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 1)。其中顏色深淺反映該靶點(diǎn)連接其他靶點(diǎn)個(gè)數(shù)的多少，用連接度Degree 體現(xiàn)，顏色的深淺反映Degree程度。Degree 值越高，顏色越深(黃色)表明該靶點(diǎn)的作用越關(guān)鍵(Fig 1)，連接度較高的核心靶點(diǎn)有AKT1(degree=58)、MAPK3(degree=52)、MAPK1(degree=45)、EGFR(degree=42)、SRC(degree=42)、HSP90AA1(degree=39)、APP(degree=37)、JUN(degree=37)、PTGS2(degree=37)等，靶點(diǎn)兩兩間的互作作用程度各不相同。

Fig 1 Nerve toxicity target interaction network of Sophora tonkinensis Gagnep

2.4 候選化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析化合物-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)描述山豆根中候選毒性成分作用于上述89個(gè)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)(Fig 2)。每種化合物作用于多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)也可由多個(gè)化合物產(chǎn)生作用，但BCL2、BCL2L1、CDK4、ERBB2、GRM1、GSTM1、HDAC4、LRRK2、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8、MAPK9、MDM2、NR3C1、REN、RET、SORD等僅有醉茄素(withaferine)作用。從蛋白靶點(diǎn)角度來看，較為重要的蛋白靶點(diǎn)ACHE、CHRNA3、CHRNA4、MAOA、PARP1、PTGS1、PTGS2、TYR、XDH等，其中PARP1與10種化合物存在互相關(guān)系，CHRNA4與8種化合物存在互相關(guān)系，ACHE與8種化合物存在互相關(guān)系。從化合物角度來看，槲皮苷(quercetin)、黃羽扇豆魏特酮(lupiwighteone)、金雀異黃酮(genistein)、苦參堿(matrine)、山柰酚(kaempferol)、醉茄素(withaferine)等，其中槲皮素(quercetin)與36個(gè)靶點(diǎn)存在相互關(guān)系。

Fig 2 A network of toxic compounds-nerve target of Sophora tonkinensis Gagnepred arrow node Represents active component,cyan node represents target.

Fig 3 Nerve toxicity target GO enrichment analysis in Sophora tonkinensis Gagnep

利用Kobas3.0在線軟件進(jìn)行KEGG 生物通路分析。KEGG結(jié)果表明，89個(gè)靶點(diǎn)主要富集在160個(gè)信號(hào)通路(P<0.05)，主要涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、粘合斑(focal adhesion)、含血清素的神經(jīng)突觸(serotonergic synapse)、FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)、神經(jīng)活性配體與受體相關(guān)作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、間隙連接(gap junction)、鞘脂類信號(hào)通路(sphingolipid signaling pathway)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路(neurotrophin signaling pathway)、多巴胺能神經(jīng)突觸(dopaminergic synapse)、膽堿能突觸(cholinergic synapse)、MAPK 信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、鈣信號(hào)通路(calcium signaling pathway)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)、toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)等(Tab 2)。

Tab 2 Nerve toxicity target KEGG pathway analysis in Sophora tonkinensis Gagnep

2.6 山豆根有毒活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型將富集分析得到的20個(gè)主要通路對(duì)應(yīng)山豆根有毒活性成分及靶點(diǎn)，構(gòu)建“有毒成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型。此網(wǎng)絡(luò)黃色節(jié)點(diǎn)代表山豆根中的活性成分，青色節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，紫色箭頭節(jié)點(diǎn)代表調(diào)控通路，邊代表三者之間的相互作用(Fig 4)。從富集通路的多少來看，較為重要的蛋白靶點(diǎn)AKT1、BCL2、EGFR、GSK3B、JUN、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8、MAPK9、PIK3CG、PRKCA、RAF1和SRC等，其中MAPK1和MAPK3均富集到17個(gè)通路，AKT1富集到15個(gè)相關(guān)的通路，PIK3CG富集到13個(gè)相關(guān)的通路，PRKCA富集到12個(gè)相關(guān)的通路。每種活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)連接多種成分，體現(xiàn)山豆根多成分、多靶點(diǎn)導(dǎo)致神經(jīng)中樞受損的作用機(jī)制。同時(shí)多條通路之間是通過共有靶點(diǎn)連接而非獨(dú)立分開的，表明各條通路之間可能協(xié)同作用在山豆根導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)受損中發(fā)生作用。

Fig 4 Toxic component-target-pathway network of Sophora tonkinensis GagnepPurple arrow represents pathway;yellow node represents active component;cyan node represents potential target.

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出山豆根中主要毒性成分15種，包括臭豆堿Anagyrine、芒柄花黃素formononetin、山柰酚kaempferol、黃羽扇豆魏特酮lupiwighteone、苦參堿matrine、槲皮素quercetin、槐二醇sophoradiol、槐果堿sophocarpine、槐胺堿Sophoramine、槐定堿sophoridine、醉茄素 withaferine、金雀異

黃酮genistein、羽扇豆醇lupeol、金雀花堿cytisine、紫檀醇pterocarpol等。其中有毒活性成分作用于343個(gè)靶點(diǎn)，在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中得到神經(jīng)毒性靶點(diǎn)554個(gè)，與山豆根的靶點(diǎn)映射得到山豆根神經(jīng)毒性靶點(diǎn)89個(gè)。

由PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選到9個(gè)較為重要的靶點(diǎn)：ACHE、CHRNA3、CHRNA4、MAOA、PARP1、PTGS1、PTGS2、TYR、XDH。其中PARP1與10種化合物存在互相關(guān)系，CHRNA4與8種化合物存在互相關(guān)系，ACHE與8種化合物存在互相關(guān)系。PARP1(poly ADP-ribose polymerase 1)是一種高度保守的細(xì)胞核內(nèi) DNA 結(jié)合蛋白，在 DNA 損傷與修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用，DNA 損傷會(huì)誘發(fā)神經(jīng)毒性，與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的病理過程相關(guān)[6]。CHRNA4編碼煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)亞基，該基因與癲癇癥狀有關(guān)[7]。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，ACHE)能夠水解乙酰膽堿，降低突觸后膜對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)敏感性，可促進(jìn)β-淀粉樣蛋白(amyloid β-proteina，Aβ)纖維狀沉積[8]。

為進(jìn)一步分析山豆根神經(jīng)靶點(diǎn)所涉及的信號(hào)通路和生物過程，對(duì)山豆根神經(jīng)毒性靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路和GO生物過程富集分析。將89個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行通路富集分析，山豆根導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損害主要涉及炎癥、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)突觸、離子信號(hào)通路等，如PI3K-Akt 信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、含血清素的神經(jīng)突觸(serotonergic synapse)、神經(jīng)活性配體與受體相關(guān)作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路(neurotrophin signaling pathway)、多巴胺能神經(jīng)突觸(dopaminergic synapse)、膽堿能突觸(cholinergic synapse)、MAPK 信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、鈣信號(hào)通路(calcium signaling pathway)等。不同的信號(hào)通路及相關(guān)蛋白、基因調(diào)控參與毒性作用的發(fā)生，產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用。

神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路是質(zhì)膜中樞上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體的集合[9]。MAPK信號(hào)通路與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)生、修復(fù)存在著緊密的聯(lián)系，通過酶、底物的交互級(jí)聯(lián)反應(yīng)與其它信號(hào)通路一起參與神經(jīng)損傷的過程，活化的MAPK信號(hào)通路與阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的致病機(jī)制密切相關(guān)[10]。膽堿能神經(jīng)元突觸傳遞是膽堿能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元、γ-氨基丁酸等神經(jīng)元之間重要的交流方式，而膽堿能神經(jīng)元突觸傳遞功能異常引起早期阿爾茨海默病認(rèn)知功能下降[11]。研究表明，山豆根中毒后基底節(jié)區(qū)域的膽堿能神經(jīng)及毛細(xì)血管相對(duì)比較豐富，乙酰膽堿酯酶(AChE) 抑制后，乙酰膽堿蓄積而使交感神經(jīng)節(jié)興奮，釋放腎上腺素、去甲腎上腺素，導(dǎo)致血管痙攣，基底節(jié)水腫、滲血，乃至基底節(jié)壞死、軟化[12]。當(dāng)基底節(jié)受損，破壞多巴胺和乙酰膽堿的平衡，從而產(chǎn)生帕金森綜合征樣的錐體外系甚至錐體系的癥狀[13]。因此，山豆根中有效化合物可能通過作用與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的靶點(diǎn)來干預(yù)神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)中毒。

大腦損傷引起興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過度釋放，使突觸后膜處于持續(xù)性去極化狀態(tài)，造成大量Ca2+內(nèi)流，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的生化反應(yīng)，而Ca2+在神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮和舒張、基因轉(zhuǎn)錄及信號(hào)傳導(dǎo)等方面起重要作用，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的異常引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[14]。山豆根有毒活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型表明，山豆根中活性成分金雀花堿、芒柄花黃素、金雀異黃酮、山柰酚、黃羽扇豆魏特酮、苦參堿、紫檀醇、槲皮素、槐胺堿、槐定堿和醉茄素作用于靶點(diǎn)CHRNA7、ADORA2A、EGFR、HTR2A、DRD1、GRM5、PRKCA、ERBB2和GRM1富集于鈣離子信號(hào)通路。山豆根活性成分可能引起神經(jīng)元內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)及重要基因表達(dá)異常，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞蛋白活性異常的表達(dá)、減少神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳遞，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死，最終產(chǎn)生神經(jīng)進(jìn)行性病變。

山豆根的毒性主要是由于其所含的苦參堿、氧化苦參堿、金雀花堿、槐果堿等生物堿引起，其中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、金花雀堿是引起山豆根臨床中毒反應(yīng)的化學(xué)成分，而苦參堿是引起山豆根毒性反應(yīng)的主要化學(xué)成分[1]。小鼠腹腔注射不同濃度苦參堿，高劑量苦參堿組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、行動(dòng)遲緩、雙目緊閉、震顫、輕度不安、前肢稍震顫等現(xiàn)象，部分小鼠出現(xiàn)興奮、發(fā)抖；組織病理顯示小鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性變[15]。利用Swiss target prediction在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到苦參堿的靶點(diǎn)為BCHE、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA7、DPP4、DRD1、EPHX1、GRM5、HTR1D、MME、PARP1、SLC6A3、DRD2。nAChRs與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能有關(guān)，如隨意運(yùn)動(dòng)、記憶力及注意力等[8]?？鄥A作為山豆根的主要有效成分，可能通過作用與nAChRs相關(guān)的靶點(diǎn)基因，如CHRNA3、CHRNA4、CHRNA7，使得受體釋放的Ca2+異常，導(dǎo)致突觸前釋放的GABA減少。

山豆根候選毒性成分槐花二醇、紫檀醇、金雀異黃素、羽扇豆醇、紫藤皂醇A、臭豆堿的口服利用度OB值未能達(dá)到30%。研究表明，山豆根中生物堿的含量占山豆根干質(zhì)量的0.93%，其中苦參堿0.52%、氧化苦參堿0.35%，而其它的微量成分如金雀花堿，含量太低難以引起毒性反應(yīng)[4]。藥物的口服生物利用度低將增大機(jī)體毒性的可能性，臨床用藥中山豆根超過藥典規(guī)定劑量(6 g)時(shí)易發(fā)生急性中毒反應(yīng)[3]，而長(zhǎng)時(shí)間服用山豆根會(huì)出現(xiàn)蓄積性中毒，由此可見，超劑量使用是山豆根中毒最根本的原因[2]。山豆根存在毒性反應(yīng)且涉及多個(gè)系統(tǒng)，其毒性呈劑量依賴性。因此，山豆根過量服用導(dǎo)致中毒可能是由于某些有效化學(xué)成分口服利用度低，但過量服用造成有效成分在體內(nèi)蓄積，影響與膽堿能突觸、神經(jīng)突觸、鈣離子通路等關(guān)鍵基因的表達(dá)。而膽堿能突觸、神經(jīng)突觸、鈣離子通路信號(hào)通路中重要因子差異表達(dá)，誘導(dǎo)或加速神經(jīng)細(xì)胞蛋白活性表達(dá)的異常、減少神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳遞，從而導(dǎo)致神經(jīng)中毒。

綜上，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究山豆根神經(jīng)毒性的作用機(jī)制，超量服用山豆根，使口服利用度較低的化學(xué)成分，如槐花二醇、紫檀醇、金雀異黃素、羽扇豆醇、紫藤皂醇A、臭豆堿在體內(nèi)蓄積，調(diào)控與膽堿能突觸、神經(jīng)突觸、鈣離子通路等關(guān)鍵基因的表達(dá)。而膽堿能突觸、神經(jīng)突觸、鈣離子通路信號(hào)通路中重要基因的差異表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞蛋白異常表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳遞，從而導(dǎo)致神經(jīng)中毒。藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，山豆根作用于神經(jīng)毒性是多靶點(diǎn)、多通路、多功能的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)機(jī)制，其主要通路不僅直接參與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的通路，還通過炎癥、細(xì)胞凋亡、離子信號(hào)通路等來干預(yù)和影響神經(jīng)系統(tǒng)。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究存在局限性，基于系統(tǒng)生物學(xué)雖能夠較為直觀地系統(tǒng)地預(yù)測(cè)化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)結(jié)合，但未能明確化學(xué)成分對(duì)關(guān)鍵基因表達(dá)的上調(diào)與下調(diào)關(guān)系，尚不能完全揭示藥物在生物體內(nèi)狀況。因此以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法為基點(diǎn)，進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)工作以闡明山豆根神經(jīng)毒性的多靶點(diǎn)、多通路、整合調(diào)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)機(jī)制。