裴宇盛，蔡 彤，陳 晨，高 華

(中國(guó)食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所藥理室，北京 102629)

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和熱原檢查法是《中國(guó)藥典》(2015版)[3]中收載的用于檢測(cè)注射劑熱原污染的方法，一般品種熱原控制首選細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。家兔熱原檢查法由于使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且只能定性檢測(cè)無(wú)法定量給出具體數(shù)值，可作為終產(chǎn)品放行方法，但對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量控制意義較小。新的體外熱原檢測(cè)方法[4-5](單核細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn))是根據(jù)人的發(fā)熱機(jī)理而設(shè)計(jì)的一類檢測(cè)方法，報(bào)告基因法本質(zhì)是對(duì)單核細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)的改良。通過(guò)引入報(bào)告基因而簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程。

本研究選擇了人源高表達(dá)TLR2受體的HEK細(xì)胞系和人源高表達(dá)TLR4受體的HEK細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)，并選擇了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法作對(duì)照研究。參照藥典要求[6]3種方法分別進(jìn)行線性與范圍、專屬性、檢測(cè)限、耐用度、回收率等方法學(xué)研究，其中以專屬性為研究重點(diǎn)。以期為MPLA佐劑建立適宜的熱原質(zhì)量控制方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：150800-201601)中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；動(dòng)態(tài)顯色法試劑盒(貨號(hào)：KC-125，批號(hào)：1611182)購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；人源高表達(dá)TLR2受體的HEK細(xì)胞系(貨號(hào)：hkb-htlr2)購(gòu)自美國(guó)InvivoGen公司；人源高表達(dá)TLR4受體的HEK細(xì)胞系(貨號(hào)：hkb-htlr4)購(gòu)自美國(guó)InvivoGen公司；合成MPLA分別購(gòu)買(mǎi)自sigma(貨號(hào)：5086PHB029，批號(hào)：69800P-5mg-B-029)和InvivoGen公司(貨號(hào)：tlrl-mpls，批號(hào)：MPS-40-02)。

1.2 線性和范圍

1.2.1細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：用1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)溶解細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻15 min后，稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，每步稀釋混勻不少于30 s；標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍100～104EU·L-1，稀釋梯度為10(本文中標(biāo)準(zhǔn)曲線均為10倍稀釋)。陰性對(duì)照制備：將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入酶標(biāo)板，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照設(shè)2個(gè)復(fù)孔，加樣量均為100 μL每孔，于37 ℃孵育10 min；將鱟試劑按標(biāo)示量1.25 mL溶解，立即加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL,振蕩10 s；于37 ℃條件下孵育，于660 nm處每隔30 s讀取一次數(shù)據(jù)，預(yù)設(shè)OD值為0.02。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.2人源高表達(dá)TLR2受體的HEK細(xì)胞系 當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到50%～80%時(shí)，經(jīng)懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋2×108個(gè)·L-1，接種到96孔板，每孔160 μL。用1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)溶解細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻15 min后，稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍100～104EU·L-1每個(gè)濃度平行3孔。在酶標(biāo)板中每孔加入20 μL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入20 μL的BET水。培養(yǎng)24 h后每孔吸取上清液20 μL至一個(gè)新酶標(biāo)板中，每孔續(xù)加180 μL專用顯色溶液，37 ℃孵育3 h，顯色為藍(lán)紫色，在波長(zhǎng)630 nm下檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

為了進(jìn)一步探求圖式理論策略與閱讀能力的關(guān)系，該研究采用逐步進(jìn)入法（stepwise）對(duì)圖式理論策略與閱讀能力進(jìn)行多元回歸分析（見(jiàn)表3）。

1.2.3人源高表達(dá)TLR4受體的HEK細(xì)胞系 除采用細(xì)胞系為人源高表達(dá)TLR4受體的HEK細(xì)胞系，其余操作同1.2.2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 專屬性研究MPLA與鱟試劑的反應(yīng)：取商業(yè)化生產(chǎn)的兩批MPLA分別稀釋至1 μg·L-1與鱟試劑進(jìn)行反應(yīng)。人源高表達(dá)TLR2/TLR4受體的HEK細(xì)胞系：取商業(yè)化生產(chǎn)的兩批MPLA分別稀釋至1～10 000 μg·L-1分別與人源高表達(dá)TLR2/TLR4受體的HEK細(xì)胞系進(jìn)行反應(yīng)，記錄每一濃度響應(yīng)值(OD值)。另取細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，使用內(nèi)毒素檢查用水，稀釋至100～106EU·L-1，分別使用人源高表達(dá)TLR2/TLR4受體的HEK細(xì)胞系進(jìn)行反應(yīng)，記錄每一濃度的響應(yīng)值(OD值)。

1.4 最低檢測(cè)限

1.4.1細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 最低檢測(cè)限為鱟試劑標(biāo)識(shí)靈敏度的下限。

1.4.2人源高表達(dá)TLR2/TLR4受體的HEK細(xì)胞系 最低檢測(cè)限為所制備的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(S 型四參數(shù)擬合曲線)的最低點(diǎn)濃度,該檢測(cè)限所至單核細(xì)胞分泌的內(nèi)熱原量應(yīng)不小于閾值(陰性對(duì)照的平均值加上其 3 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差)；若小于閾值，則將閾值對(duì)應(yīng)的OD值代入上述四參數(shù)擬合曲線中，獲得的濃度值即為最低檢測(cè)限。

1.5 耐用度研究人源高表達(dá)TLR2/TLR4受體的HEK細(xì)胞系：考察細(xì)胞代次的對(duì)實(shí)驗(yàn)影響，將細(xì)胞傳至20代。按照1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線線性和范圍實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作，r值應(yīng)大于0.980。檢測(cè)限不應(yīng)降低。

1.6 回收率實(shí)驗(yàn)

1.6.1內(nèi)毒素檢查法 樣品制備：將2種不同來(lái)源的MPLA用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行系列稀釋，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中，2批樣品在1 μg·L-1測(cè)定。樣品陽(yáng)性對(duì)照制備：用內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋，每步稀釋混勻不少于30 s；將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到2批MPLA中，使其含有內(nèi)毒素含量為104EU·L-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：用1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)溶解細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻15 min后，稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍100～106EU·L-1，每個(gè)濃度平行3孔。陰性對(duì)照制備：為內(nèi)毒素檢查用水。

1.6.2人源高表達(dá)TLR2/TLR4受體的HEK細(xì)胞系 樣品制備：將2種不同來(lái)源的MPLA用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行系列稀釋，TLR4細(xì)胞系中，2批樣品在1 mg·L-1測(cè)定。TLR2細(xì)胞系中，2批樣品在0.1 g·L-1測(cè)定。樣品陽(yáng)性對(duì)照制備同1.6.1。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：用1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)溶解細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻15 min后，稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍100～ 106EU·L-1每個(gè)濃度平行3孔。陰性對(duì)照制備：為內(nèi)毒素檢查用水。

1.7 內(nèi)毒素含量檢測(cè)樣品制備、樣品陽(yáng)性對(duì)照制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、陰性對(duì)照制備同1.6回收率試驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

1.8.1細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 到達(dá)預(yù)設(shè)OD值的時(shí)間(Onset time)與對(duì)應(yīng)的內(nèi)毒素濃度進(jìn)行雙對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，以內(nèi)毒素濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以O(shè)nset time對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，擬合相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值應(yīng)大于0.980。

按中國(guó)藥典內(nèi)毒素檢查法干擾實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目下計(jì)算回收率，回收率在50%～200 %范圍內(nèi)有效。

1.8.2人源高表達(dá)TLR2/TLR4受體的HEK細(xì)胞系 以內(nèi)毒素濃度值為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行四參數(shù)擬合，擬合相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.980。按中國(guó)藥典內(nèi)毒素檢查法干擾實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目下計(jì)算回收率，回收率在50%～200 %范圍內(nèi)有效。

2 結(jié)果

2.1 線性和范圍采用3種方法進(jìn)行檢測(cè)，r的絕對(duì)值均>0.980，檢測(cè)范圍上下限及r的絕對(duì)值，詳見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Results of linear range

2.2 專屬性MPLA與鱟試劑反應(yīng)方面，MPLA可以引起類似內(nèi)毒素的響應(yīng)，其響應(yīng)值高達(dá)1×109EU·g-1水平，與純品細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)水平相當(dāng)(參照細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū))，應(yīng)為假陽(yáng)性結(jié)果。MPLA專屬性研究試驗(yàn)結(jié)果方面，MPLA對(duì)TLR2細(xì)胞系在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)測(cè)定值與陰性對(duì)照均無(wú)顯著性差異，表明在該濃度范圍內(nèi)，MPLA并不會(huì)與TLR2細(xì)胞系發(fā)生反應(yīng)，詳見(jiàn)Fig 1。MPLA在1 mg·L-1以上可激動(dòng)TLR4受體并產(chǎn)生效應(yīng)。此即MPLA的免疫激活效應(yīng)，詳見(jiàn)Fig 2。內(nèi)毒素專屬性研究結(jié)果方面，不同純度內(nèi)毒素在不同濃度表現(xiàn)出對(duì)TLR2/TLR4細(xì)胞刺激結(jié)果不同。TLR2細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品在10 000～106EU·L-1范圍內(nèi)顯示出隨濃度依賴的響應(yīng)，詳見(jiàn)Fig 3。對(duì)于TLR4細(xì)胞內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品在濃度100～106EU·L-1范圍內(nèi)細(xì)胞顯示出隨劑量依賴的響應(yīng)，詳見(jiàn)Fig 4。綜上所述，MPL和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)鱟試劑和TLR4細(xì)胞系引起類似的響應(yīng)活性，不能將兩者區(qū)分；而TLR2細(xì)胞系僅對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品有響應(yīng)，因此可用TLR2細(xì)胞系作為MPL的檢測(cè)細(xì)胞。

Fig 1 Results of MPLA specificity test on TLR2 cell line n=3)

Fig 2 Results of MPLA specificity test on *P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 3 Results of endotoxin specificity test on TLR2 cell line n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 4 Results of endotoxin specificity test on TLR4 cell line n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.3 檢測(cè)限根據(jù)“1.4.1”和“1.4.2”，內(nèi)毒素檢查法檢測(cè)限確定為10 EU·L-1，TLR2細(xì)胞法為104EU·L-1，TLR4細(xì)胞法為100 EU·L-1。

2.4 耐用度考察細(xì)胞傳代次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)影響，TLR2/TLR細(xì)胞系傳至20代，按照“1.2.2”標(biāo)準(zhǔn)曲線線性和范圍實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作，r值均大于0.980。各自檢測(cè)限與“2.3項(xiàng)”相比，均未降低。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)和內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)Tab 2。根據(jù)藥典規(guī)定，回收率在50%～200 %即符合規(guī)定，其檢測(cè)值即為樣品的內(nèi)毒素含量。

Tab 2 Results of endotoxin detection and recovery

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPLA和細(xì)菌內(nèi)毒素都能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)。細(xì)菌內(nèi)毒素一般由3部分組成，類脂A核心多糖和特異性多糖，鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的結(jié)合位點(diǎn)在于類脂A部分[7]。而MPLA恰恰是人工合成的類脂A結(jié)構(gòu)類似物。雖然其具有相同的結(jié)合位點(diǎn)，但是其與鱟試劑的反應(yīng)劑量依賴性卻與細(xì)菌內(nèi)毒素表現(xiàn)出很大差異，由于這種特性，類似于生物測(cè)定量反應(yīng)平行線法測(cè)定中，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的生物活性不同，不能用來(lái)定量。另一方面，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的目的是間接反映樣品中污染的熱原量，MPLA雖然能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)，然而卻不具有致熱性[8]，這就使得使用鱟試劑這種方法來(lái)控制其熱原污染程度失去了意義。因此表2中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所測(cè)定結(jié)果，雖然回收率實(shí)驗(yàn)符合藥典的規(guī)定，用來(lái)量化細(xì)菌內(nèi)毒素并不準(zhǔn)確，僅作為同濃度不同樣品間內(nèi)毒素含量比較參考值。

TLR4細(xì)胞法專屬性結(jié)果與細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)專屬性研究結(jié)果類似。同樣存在無(wú)法確定檢測(cè)值是由MPLA引起還是由于細(xì)菌內(nèi)毒素引起，因此也不適合用來(lái)量化細(xì)菌內(nèi)毒素含量。根據(jù)中國(guó)藥典規(guī)定，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在檢測(cè)過(guò)程中，僅需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證和干擾試驗(yàn)，即回收率，可建立檢測(cè)方法。并不進(jìn)行專屬性、耐用度等方面的研究。然而根據(jù)研究結(jié)果顯示，MPLA會(huì)嚴(yán)重干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)和TLR4細(xì)胞法準(zhǔn)確檢測(cè)出細(xì)菌內(nèi)毒素。

根據(jù)Fig 2、4結(jié)果，雖然MPLA和內(nèi)毒素均能夠激動(dòng)TLR4受體，根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素質(zhì)量和效價(jià)關(guān)系，0.12 ng對(duì)應(yīng)1 EU效價(jià)，可估算0.012 μg·L-1即可激活TLR4受體，明顯高于MPLA(1 mg·L-1)。推測(cè)與細(xì)菌內(nèi)毒素的分子大小與聚集形態(tài)更適合于結(jié)合TLR4受體。

細(xì)菌內(nèi)毒素是經(jīng)典的TLR4受體激動(dòng)劑[9]，本實(shí)驗(yàn)表明細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品同樣可以激活TLR2受體。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，細(xì)菌中的脂蛋白，或者熱滅活大腸桿菌均可以激活TLR2受體，即使TLR2受體是由非內(nèi)毒素成分激活，本研究所建立的TLR2細(xì)胞檢測(cè)體系仍然可以用于質(zhì)控，其原因在于自然界不存在細(xì)菌內(nèi)毒素純品，在質(zhì)量控制活動(dòng)中出現(xiàn)的細(xì)菌內(nèi)毒素必定為細(xì)菌死亡后的產(chǎn)物。TLR2細(xì)胞檢測(cè)體系即為檢測(cè)微生物污染間接反映熱原的量。