龐曉麗，劉建衛(wèi)，李虎虎，楊 琳，王青龍

血管新生是以內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成管為特征的復(fù)雜過(guò)程，常在營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不足時(shí)發(fā)生，且受多種促血管生成因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等調(diào)控，VEGF在血管新生中具有重要作用[1-2]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯為傳統(tǒng)中藥方劑，常被用于治療腦血管疾病[3]?，F(xiàn)代科學(xué)研究顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用與促進(jìn)血管新生有關(guān)[4-5]。然而該方劑對(duì)血管新生的影響及作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究以血管段、內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，從體外實(shí)驗(yàn)探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血管新生的影響，為補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性損傷提供體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 補(bǔ)陽(yáng)還五湯首載于《醫(yī)林改錯(cuò)》，組方：黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g。飲片購(gòu)自北京同仁堂。鼠尾膠、MCDB131培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)8(CCK-8)、青霉素鏈霉素、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA、Trizol、Ⅰ型膠原和羧甲基纖維素等均購(gòu)自Gibco(美國(guó))公司；RNA反轉(zhuǎn)試劑盒、Real-time PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化技術(shù)有限公司。引物由Sangong生物技術(shù)公司(上海)合成。VEGF等抗體購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司(美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 初斷乳雄性SD 大鼠，體重約80 g，6周齡雄性SD大鼠，體重約 200 g，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[合格證號(hào) SCXK(京)2014-0004]，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMECs)購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司。

1.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清制備 將雄性6周齡SD大鼠，按人和大鼠用藥等效劑量換算(200 g大鼠對(duì)應(yīng)70 kg成人的體表面積系數(shù)0.018，故200 g大鼠每天服用生藥量為2.565 g)。課題組前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定低、中、高劑量分別為等效劑量的0.5倍、1.0倍、2.0倍，故以此為基礎(chǔ)分為補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組，分別以低、中、高劑量進(jìn)行灌胃，正常組則給予等體積生理鹽水灌胃。各組每日灌胃1次，持續(xù)1周，于末次灌胃后2 h，腹主動(dòng)脈無(wú)菌取血、分離血清，滅活后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 體外血管新生三維培養(yǎng)模型的構(gòu)建 參照Z(yǔ)hu等[6]研究體外構(gòu)建三維培養(yǎng)血管新生模型。7%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉初斷乳SD 大鼠后，75%乙醇浸泡10 min，超凈臺(tái)內(nèi)快速打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)右心耳，以預(yù)冷的D-hank′s 液進(jìn)行心臟灌流至流出液無(wú)色為止，切取約2 cm 胸主動(dòng)脈，在預(yù)冷的D-hank′s 液中除去外膜，用手術(shù)刀切成1 mm 厚血管環(huán)，置于鋪pH7.4鼠尾膠和MCDB131 混合培養(yǎng)基質(zhì)的96 孔板內(nèi)，37 ℃凝固20 min 后取出，在培養(yǎng)物上層再加入混合基質(zhì)，37 ℃再次凝固20 min，于上層加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后。將培養(yǎng)的血管段分為對(duì)照組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組(低劑量、中劑量、高劑量)，對(duì)照組加入10%空白鼠血清，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組加入10%不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清，培養(yǎng)72 h后在倒置顯微鏡下觀察血管新生情況。

1.4.2 細(xì)胞活力測(cè)定 將HBMECs(5 000個(gè))培養(yǎng)3～5代后將其接種于96孔板中，繼而將其分為對(duì)照組、模型組、模型+補(bǔ)陽(yáng)還五湯組(低劑量、中劑量、高劑量)。對(duì)照組給予10%空白鼠血清；模型組參考王波等[7]研究方法，通過(guò)氯化鈷(CoCl2)建立內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型，并給予10%空白鼠血清；模型+補(bǔ)陽(yáng)還五湯組給予10%不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.4.3 劃痕遷移試驗(yàn) 將HBMECs(1×105個(gè))接種于24孔板中，同步化后用0.2 mL吸管尖端在培養(yǎng)板中間劃“+”字，繼而將其分為對(duì)照組、模型組(CoCl2致缺氧)、模型+補(bǔ)陽(yáng)還五湯組。對(duì)照組和模型組均給予10%空白鼠血清，模型+補(bǔ)陽(yáng)還五湯組則基于細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，選擇有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清干預(yù)。采用倒置顯微鏡拍攝，通過(guò)測(cè)量劃痕傷口邊緣的相對(duì)距離來(lái)評(píng)估細(xì)胞遷移情況。

1.4.4 三維細(xì)胞培養(yǎng) 參照劉少坤等[8]研究方法，將HBMECs(1×106個(gè))接種于非貼壁96孔板中培養(yǎng)，直至細(xì)胞形成多個(gè)球狀體。將細(xì)胞小球與含體積分?jǐn)?shù)10%新生小牛血清的Ⅰ型膠原(1.5 g/L)-甲基纖維素(1∶1)混合液中混勻后，移入24孔板中(每孔1 mL；每孔20～30個(gè)細(xì)胞球)并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱30 min。待混合物形成膠狀結(jié)構(gòu)后，每孔分別加入200 μL含有20 ng/mL的VEGF和/或不含10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯大鼠血清的培養(yǎng)基。繼而將接種好的細(xì)胞球分為對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組。對(duì)照組給予10%空白鼠血清，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組則基于細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，選擇有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清干預(yù)。在倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)，并分別于24 h、48 h和72 h內(nèi)在放大40倍情況下拍照。

1.4.5 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析 將HBMECs(2×106個(gè))接種于6孔板中，將其分為對(duì)照組、模型組(CoCl2致缺氧)、模型+補(bǔ)陽(yáng)還五湯組。對(duì)照組和模型組均給予10%空白鼠血清，模型+補(bǔ)陽(yáng)還五湯組則基于細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，選擇有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清干預(yù)。24 h后采用Trizol法提取補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清干預(yù)后的HBMECs細(xì)胞總RNA，繼而采用RT試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA?；谠O(shè)計(jì)好的引物(VEGF，5′-3′端GCTACTGCCATCCAATCGAG，3′-5′端TGCATTCACATTTGTTGTGC)根據(jù)PCR說(shuō)明書(shū)，以25 μL作為反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，以雙Δ法計(jì)算VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)變化。

2 結(jié) 果

2.1 主動(dòng)脈血管段新生血管情況 各組均有不同程度的血管新生，補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組新生血管數(shù)量較對(duì)照組增加，尤以高劑量組最為明顯。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組主動(dòng)脈血管段新生血管情況(光鏡，×100)

2.2 HBMECs增殖情況 采用CoCl2建立內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型。如圖2所示，以250 μmol/L CoCl2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故本研究采用此濃度構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型，造模后給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清干預(yù)。結(jié)果顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，且與劑量呈正相關(guān)(見(jiàn)圖3)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用高劑量載藥血清進(jìn)行干預(yù)。

與0 μmol/L比較，*P<0.05，ΔP<0.01。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.3 HBMECs遷移情況 在血管新生過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞遷移是必不可少的過(guò)程。本研究通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響，基于內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)陽(yáng)還五湯組選擇高劑量組作為藥物干預(yù)組；對(duì)照組為正常條件下培養(yǎng)0～10 h，模型組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組采用CoCl2(250 μmol/L)進(jìn)行化學(xué)缺氧造模，繼而在不同濃度載藥血清(0和10%)條件下孵育0～10 h。結(jié)果顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯能有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組內(nèi)皮細(xì)胞遷移情況(光鏡，×100)

2.4 內(nèi)皮細(xì)胞成管情況 基于三維培養(yǎng)以圖5A中血管計(jì)數(shù)方法為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)血管數(shù)量。結(jié)果顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清干預(yù)后，與對(duì)照組比較管腔數(shù)量明顯增加；在維持時(shí)間上，對(duì)照組在72 h管腔開(kāi)始退化，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯組管腔結(jié)構(gòu)正常(見(jiàn)圖5B)。詳見(jiàn)圖5。

圖5 各組對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響(光鏡，×40)

2.5 VEGF mRNA表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示，與模型組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組可以促進(jìn)VEGF表達(dá)(P<0.01)。詳見(jiàn)圖6。

與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，# P<0.01。圖6 各組VEGF mRNA表達(dá)比較

3 討 論

血管新生對(duì)于缺血性組織損傷性疾病的恢復(fù)，如缺血性腦卒中、心肌梗死等至關(guān)重要[1]。新生血管不僅可以為組織提供氧氣，還可以恢復(fù)細(xì)胞代謝，進(jìn)而改善組織功能。補(bǔ)陽(yáng)還五湯為治療腦卒中之名方，該方由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁組成，活血而不傷正，能使虧損之氣得以補(bǔ)還，因虛致瘀之血得以運(yùn)行，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之效，對(duì)心腦血管疾病療效確切[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用與促進(jìn)血管新生有關(guān)[10-11]。

為進(jìn)一步闡明補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血管新生的影響，本研究首先構(gòu)建血管段三維培養(yǎng)模型，判斷補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血管新生的作用。結(jié)果表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能促進(jìn)主動(dòng)脈環(huán)的血管新生反應(yīng)，說(shuō)明該方劑對(duì)血管新生有影響。如前所述，血管新生常在缺血缺氧情況下發(fā)生，是一個(gè)從已有血管中建立新血管的復(fù)雜過(guò)程，主要包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、出芽形成新的血管網(wǎng)等步驟[1-2]。故本研究以內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血管新生的影響。結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成管。

眾所周知，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成管受一系列血管生長(zhǎng)因子調(diào)控[1]。其中VEGF作為最具代表的血管新生調(diào)控因子之一[2，12]，可與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體VEGF受體2(VEGFR 2)結(jié)合激活酪氨酸激酶，進(jìn)而啟動(dòng)一系列事件，包括磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和RAF/MEK/ERK信號(hào)通路，最終刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成管[13-14]。研究顯示通過(guò)阻斷VEGF受體或抑制VEGF的產(chǎn)生可明顯減少血管新生[15]。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)。因此，推測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血管新生的作用與促VEGF表達(dá)有關(guān)。

總之，本研究從體外角度探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血管新生的影響。雖然闡明該方劑促血管新生與調(diào)控VEGF有關(guān)，但具體信號(hào)通路還需進(jìn)一步研究。