徐淑曄，郭政新

腸桿菌科細菌是醫(yī)院感染的常見病原體。碳青霉烯類藥物是治療革蘭陰性桿菌特別是腸桿菌科細菌感染最強效的β內(nèi)酰胺類抗生素[1]。由于抗生素的不合理的應(yīng)用[2]，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌隨之出現(xiàn)，尤其以耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae,CRKP)最為嚴重[3]，由CRKP引起的院內(nèi)感染因其高傳播率、高病死率、高耐藥率引起廣泛關(guān)注[4- 5]。我院近年來CRKP感染的患者逐漸增多，細菌耐藥形勢較為嚴峻。為了防止我院CRKP的擴散，了解我院流行菌株背景是前提[6]。本文擬通過全基因組測序[7]，以MLST、核心基因組多位點序列分型(core genome multilocus sequence typing,cgMLST)和構(gòu)建最小生成樹(minimum spanning tree,MST)等手段系統(tǒng)的分析了本院院內(nèi)感染流行菌株的特點，為醫(yī)院感染防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集蚌埠市第三人民醫(yī)院2018年11月—2019年3月臨床標本分離得到的CRKP(對于任一種碳青霉烯類藥物耐藥的肺炎克雷伯即認為CRKP)21株，剔除同一患者、同一部位的重復(fù)分離株。

1.2 儀器與試劑 Vitek 2 Compact 全自動細菌藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司)及配套革蘭陰性菌的鑒定卡(Vitek-GN)。MH干粉培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)， Bio-Rad電泳儀 (Bio-Rad公司,美國)，超微量分光光度計(Biochrom公司、英國)，美國Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)，細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，DNA Marker D，4S Red plus 核酸染色劑，上樣緩沖液均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 菌株鑒定及藥敏實驗 所有菌株使用法國生物梅里埃Vitek 2 Compact 全自動細菌藥敏分析儀及配套革蘭陰性菌的鑒定卡(AST-GN13)進行細菌鑒定和藥敏實驗，結(jié)果判定根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會 (CLSI) 2017年推薦的標準執(zhí)行。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.4 菌株基因組提取、測序、組裝 在無菌試管中加入3 mL LB培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落加入LB培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃、220 rpm搖菌過夜。取渾濁的菌液2 mL, 12 000 rmp離心2 min，棄上清后用DNA提取試劑盒提取菌株DNA?；厥盏玫疆a(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測純度和濃度，產(chǎn)物OD260∶OD280在1.8～2.0范圍之內(nèi)并且基因組條帶清晰完整、無明顯RNA條帶視為樣品合格[8]。將DNA濃度≥20 ng/μL,總量大于600 ng的樣品送往上海生工生物有限公司。通過illumina Hiseq2500測序平臺對21株CRKP進行全基因組測序,在Linnux系統(tǒng)下運行SPAdes-2.0軟件拼接原始數(shù)據(jù)[9]。

1.5 菌株耐藥基因分析及MLST的分型 應(yīng)用staramr軟件對比ResFinder, PointFinder和PlasmidFinder數(shù)據(jù)庫來掃描組裝菌株基因，確定細菌耐藥基因型[10]；采用MLST軟件根據(jù)肺炎克雷伯基因組上的7個管家基因，比對并確定給出菌株對應(yīng)的ST分型[11]。

1.6 cgMLST分型及MST構(gòu)建 采用Ridom SeqSphere+軟件進行cgMLST分型及MST構(gòu)建(cgMLST是 MLST 的一個拓展方法)，以www.cgMLST.org網(wǎng)站上公布的2358個基因作為參考核心基因組，以基因比對的方式搜尋基因序列的差異,并且賦予每株菌一組等位基因編號，分型確定CT(complex type)型別。MST是可視化的描述菌株之間進化關(guān)系，利用Ridom SeqSphere+把每個菌株基因與2358個核心基因組進行比對，確定對應(yīng)菌株的等位基因圖譜，標記每個菌株等位基因圖譜間相差的等位基因數(shù)。本資料將密切相關(guān)的基因型(有15個等位基因，差異的等位基因個數(shù)是Ridom SeqSphere+軟件自定義)差異以內(nèi)的菌株歸為同一簇[12-13]。在同一簇的菌株之間相差1～15個等位基因不等，相差的等位基因少則意味著親緣關(guān)系近。

2 結(jié)果

2.1 CRKP菌株的科室分布 21株CRKP 14株來源于痰液，3株來源于血液，3株來源于尿液；21株菌來源于9個不同的臨床科室，其中重癥醫(yī)學(xué)科11株，占52.38%。見表1。

表1 21株CRKP科室分布

2.2 藥敏試驗結(jié)果 21株CRKP對特殊級抗菌藥物亞胺培南及頭孢菌素類、青霉素類、氨基糖苷類、喹諾酮類等常規(guī)藥物耐藥率均為100%，對復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥率為95.24%，而對四環(huán)素的耐藥率為14.29%。見表2。

表2 21株CRKP對抗菌藥物耐藥情況

2.3 菌株ST分型和耐藥基因譜分析結(jié)果 21株CRKP的 MLST分型均為ST11型，均攜帶KPC-2耐藥基因；blaSHV、blaCTX-M-65、blaTEM-1B、blaOXA-1攜帶ESBLs基因，每株攜帶2種以上；15株CRKP攜帶AmpC耐藥基因blaDHA-1；檢測出氨基糖苷類耐藥基因有rmtB、aadA2、aac(3)-Ⅱd、armA；喹諾酮類耐藥基因有qnrB4和qnrS1；磺胺類耐藥基因：sul，四環(huán)素類耐藥基因：tet(A)。見表3。

表3 21株CRKP耐藥基因譜及其占比

2.4 cgMLST分型及MST生成 21株菌株經(jīng)過cgMLST分型共被分為5個譜型。CT3176型共有14株，占比66.67%。其它分別為CT1689(3株)、CT1313(2株)、CT1814(1株)和CT3195(1株)，見表4。在MST中21株菌株根據(jù)15個等位基因閾值被分為3簇，第1簇為CT3176型，為主要的優(yōu)勢型別。該簇中4、35和7號菌株因位于簇的中心，周圍菌株與其具有1～15個等位基因的差別，可被認為與周圍菌株有密切的進化關(guān)系。同時18與36號沒有等位基因的差別，則被標記為同一個圈。4號與35號菌株情況與此相同。2株CT1689型構(gòu)成第2簇，兩者相差7個等位基因。另外2株CT1313形成第3簇，有2個等位基因的差別。而其它15、28、32號因為等位基因超出15個閾值，菌株沒有成簇，與其他菌株之間親緣關(guān)系較遠。見圖1。

表4 21株CRKP cgMLST分型結(jié)果

圖1 基于21個肺炎克雷伯菌菌株的cgMLST等位基因譜生成的最小生成樹注：每個圓圈代表一個基于2358個cgMLST靶基因的序列分析的等位基因圖譜。連接線上的數(shù)字表示具有不同等位基因的靶基因的數(shù)量。 圓圈的顏色代表不同的CT型。密切相關(guān)的基因型(15個等位基因的差異)被陰影化，即被分為一簇被連續(xù)編號(1～3)。

3 討論

CRKP的耐藥機制主要是碳青霉烯酶的產(chǎn)生[14],本次調(diào)查的21株菌株均產(chǎn)生KPC-2酶，同時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶菌株不僅對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，而且同時對氨基糖苷類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物100%耐藥。21株菌株均檢出氨基糖苷類耐藥基因aac(3)-Ⅱd、aadA2、armA、rmtB與對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的100%耐藥結(jié)果相一致；喹諾酮類耐藥基因：qnrB4、qnrS1(qnrB4陽性率71.43%;qnrS1檢出率9.52%)檢出情況,小于環(huán)丙沙星、左氧氟沙星(耐藥率100%)的藥敏結(jié)果,可能與其他抗菌藥物耐藥基因的高水平表達起協(xié)同耐藥的作用。其他的如磺胺類:sul、四環(huán)素類:tet(A)耐藥基因均與藥敏結(jié)果表型相一致。這勢必給臨床治療帶來困難，所以必須嚴格執(zhí)行防控措施,控制耐藥菌株的流行。

目前對CRKP的基因分型方法主要包括脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)[15]、多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)。在這些方法中PFGE被認為細菌分子分型的“金標準”[16]，該方法的主要缺點是操作復(fù)雜，耗時長同時還受實驗環(huán)境、操作人員等因素影響，且不同批次之間可比性較差[17]；MLST是通過比對7個管家基因序列的分型方法，其操作簡單，可比性強，但是分辨率不高[18]?；谌蚪M測序的cgMLST分型方法是用肺炎克雷伯菌核心基因組中的上千個基因序列差異，對菌株進行區(qū)分和分型，具有很好分辨力、重復(fù)性和實驗室間可比性,便于建立公共數(shù)據(jù)庫,實現(xiàn)標準化的應(yīng)用[19-22]。對本院的21株CRKP的基因組分型后發(fā)現(xiàn)：cgMLST分型將均為ST11型菌株分為不同亞型，提示ST11型的不均一性。

根據(jù)等位基因的差別個數(shù)構(gòu)建的MST，能把進化關(guān)系近的菌株聚集成簇，并且區(qū)分開親緣關(guān)系較遠的菌株[23]。本調(diào)查對本院連續(xù)5個月收集的21株CRKP進行了分析，從MST圖中可以看出，在第1簇中CT3176型為本院的優(yōu)勢型別,并且4、35、7號菌株與其周圍菌株形成一定范圍的進化關(guān)系，即在院內(nèi)引起了一定范圍內(nèi)的播散。在第2簇和第3簇中具有密切進化關(guān)系的菌株數(shù)量較少，也沒有形成較為大的播散。所以針對CT3176型別的CRKP必須輔以詳細的流行病學(xué)調(diào)查和分析，以明確感染源和傳播途徑，便于及時采取針對性的防控方案，阻止CT3176型的菌株造成更大的播散甚至是院內(nèi)感染暴發(fā)。針對其他簇中或暫時還沒有形成簇的菌株也需以積極的采取措施，以防成為優(yōu)勢型別或一定范圍的播散。所以實時監(jiān)控醫(yī)院的CRKP的MST不僅可以及時有效的發(fā)現(xiàn)院內(nèi)感染播散的源頭、趨勢，也可以檢測醫(yī)院感染控制工作的成效，其主要體現(xiàn)在優(yōu)勢型別的菌群由聚集成簇變?yōu)榉稚顟B(tài)。此外使用全基因組測序技術(shù)，利用cgMLST分型和MST圖能快速準確區(qū)分高度相關(guān)的病原體譜系，及時證實或排除醫(yī)院感染暴發(fā)[22-23]。所以通過CRKP基因組的分型對以往的菌株進行分析，可為以后院感工作提供參考，更為潛在暴發(fā)的甄別提供判斷依據(jù)[24]。