閆五玲

乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)是世界性流行的傳染病，腎臟是乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,HBV)感染最常受累的肝外器官，稱為HBV相關(guān)性腎炎(hepatitis b virus-associated glomerulonephritis，HBV-GN)，而HBV-GN病理類型約60%表現(xiàn)為膜性腎病，即HBV相關(guān)性膜性腎病(hepatitis b virus membranous nephropathy，HBV-MN)[1]。磷脂酶A2(phospholipase a2，PLA2)受體(PLA2R)是一種跨膜蛋白，屬于甘露糖受體家族，包括N型和M型，M型PLA2R最先在成人特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)腎組織足細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[2]。已有研究表示，血清抗PLA2R抗體和腎小球PLA2R是診斷IMN既敏感又特異的指標(biāo)[3]。國外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在MN患者中，高基線或增加的抗PLA2R抗體水平與腎臟功能進行性喪失有關(guān)[4]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，血清PLA2R抗體與腎小球沉積物中的PLA2R的表達(dá)存在強正相關(guān)性[5]，但其在HBV-MN病情進展中的作用仍需更多研究討論?；诖?，本研究選取80例HBV-MN患者作為研究對象，以探究腎組織M型PLA2R及血清抗PLA2R抗體表達(dá)水平與HBV-MN病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月—2017年12月收治的HBV-MN患者80例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)腎活檢病理學(xué)明確診斷者，HBV-MN患者符合HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；年齡>18歲者；入組前無環(huán)磷酰胺、他克莫司等藥物或系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素治療者；患者知情同意；經(jīng)我院倫理委員會審核通過。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他器官嚴(yán)重功能障礙、惡性腫瘤者；IMN及繼發(fā)于自身免疫病、其他急慢性感染性疾病的膜性腎病者；毒物、重金屬接觸史者。80例HBV-MN患者男62例，女18例；年齡41～70(52.05±11.63)歲。

1.2 方法 所有患者均于超聲引導(dǎo)下經(jīng)腎活檢獲得組織標(biāo)本，采用石蠟包埋，采用微波修復(fù)和免疫熒光法測定PLA2R表達(dá)：脫蠟復(fù)水、水浴后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，配置pH 6.0檸檬酸緩沖液后將石蠟片置入，100%火力行微波修復(fù)8次，首次4 min，此后2分鐘/次，行封閉及抗體孵育，加入一抗(兔抗人PLA2R抗體，LifeSpan Biosciences公司提供)后置于濕盒，4 ℃冰箱過夜，加入二抗(驢抗兔FITC標(biāo)記二抗，美國Millipore公司提供)孵育1 h，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察。所有患者均于入院當(dāng)日或次日采集外周靜脈血，采集后6 h內(nèi)3 000 r/min常溫離心，取上清液，-70 ℃保存待測，采用間接免疫熒光法測定血清抗PLA2R抗體的表達(dá)：PBST1∶10稀釋，加30 μL樣本至反應(yīng)區(qū)，室溫下放置30 min，PBST沖洗載片，混勻FITC標(biāo)記的二抗，滴加25 μL熒光二抗，避光室溫孵育0.5 h，PBST沖洗載片，封片熒光顯微鏡下觀察。采用酶聯(lián)免疫法測定患者血肌酐(SCr)；采用ADVIA2400型全自動生化分析儀(德國西門子公司生產(chǎn))測定血清白蛋白(ALB)；收集患者24 h尿液，采用免疫比濁法測定24 h尿蛋白。

1.3 評估標(biāo)準(zhǔn) 腎組織PLA2R：陽性者特征為可觀察到沿腎小球毛細(xì)血管袢顆粒樣分布熒光，陰性者則不能在腎小球內(nèi)觀察到熒光；血清抗PLA2R抗體：細(xì)胞質(zhì)可觀察到綠色熒光，陰性者則不能觀察到熒光。

1.4 觀察指標(biāo) 評估患者腎組織PLA2R及血清抗PLA2R抗體表達(dá)水平，比較不同血清抗PLA2R抗體水平、不同腎組織PLA2R水平HBV-MN患者疾病嚴(yán)重程度(SCr、ALB、24 h尿蛋白)，采用Spearman相關(guān)分析法分析血清PLA2R抗體水平、腎組織PLA2R與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 HBV-MN患者腎組織PLA2R及血清抗PLA2R抗體表達(dá)水平 80例患者中腎組織PLA2R陽性率45.00%(36/80)，血清抗PLA2R抗體陽性率33.75%(27/80)。

2.2 不同血清抗PLA2R抗體水平HBV-MN患者疾病嚴(yán)重程度 血清抗PLA2R抗體陽性者與陰性者SCr比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，血清抗PLA2R抗體陽性者ALB水平低于陰性者(P<0.05)，24 h尿蛋白水平高于陰性者(P<0.05)。見表1。

表1 不同血清抗PLA2R抗體水平HBV-MN患者疾病嚴(yán)重程度

2.3 不同腎組織PLA2R水平HBV-MN患者疾病嚴(yán)重程度 腎組織PLA2R陽性與陰性者SCr對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，腎組織PLA2R陽性者ALB水平低于陰性者(P<0.05)，24 h尿蛋白水平高于陰性者(P<0.05)。見表2。

表2 不同腎組織PLA2R水平HBV-MN患者疾病嚴(yán)重程度

2.4 血清PLA2R抗體水平、腎組織PLA2R與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，血清抗PLA2R抗體陽性與ALB呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；腎組織PLA2R陽性與ALB呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與24 h尿蛋白呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 血清PLA2R抗體水平、腎組織PLA2R與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性

3 討論

相關(guān)調(diào)查顯示，過去30年中膜性腎病檢出率為12.6%，HBV-MN檢出率為2.6%，且膜性腎病、HBV-GN的比例傾向于增加[6]。原發(fā)和病毒繼發(fā)性膜性腎病均是重要的腎臟病，相關(guān)研究顯示，PLA2R抗體診斷IMN的靈敏度為73%，特異度為95.6%，PLA2R診斷IMN效能良好[7]。既往有研究認(rèn)為抗PLA2R抗體是鑒別診斷IMN和SMN的特異性指標(biāo)，但近年來有不同認(rèn)知。血清抗PLA2R抗體和腎小球PLA2R與HBV-MN等繼發(fā)性膜性腎病的研究仍不足夠，且各研究結(jié)果存在較大差異。許秀華等[8]學(xué)者的研究顯示，HBV-MN等繼發(fā)性膜性腎病腎小球PLA2R均為陰性，但該研究中樣本量小。而另一研究則顯示，HBV-MN患者中腎組織PLA2R陽性率為35%，血清抗PLA2R抗體陽性率為25%[9]。不同研究對HBV-MN患者PLA2R陽性率結(jié)論存在較大差異，故本資料從此入手，以加深PLA2R與HBV-MN等繼發(fā)膜性腎病關(guān)系的認(rèn)知。

本研究以IgAN患者作為對照組，對照組腎組織PLA2R和血清抗PLA2R抗體陽性檢出率均非常低。而觀察組腎組織PLA2R陽性率、血清抗PLA2R抗體陽性率分別為45%和33.75%，明顯高于對照組陽性率。這說明腎組織PLA2R和血清抗體不能作為IMN和繼發(fā)性膜性腎病的鑒別診斷指標(biāo)，在HBV-MN部分患者中也存在腎組織PLA2R陽性和血清抗體陽性。本研究中，HBV-MN患者PLA2R在腎組織及血清樣本中的表達(dá)均略高于其他研究結(jié)論[10]。推測原因是，本研究是一個針對HBV-MN的研究，且為單中心樣本研究；另一方面，雖有腎活檢病理學(xué)檢查，但也存在部分患者是乙型肝炎相關(guān)腎小球腎炎合并IMN的可能性。目前普遍認(rèn)為IMN的主要發(fā)病機制可能是，足細(xì)胞免疫復(fù)合物沉淀后激活補體，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷進一步產(chǎn)生蛋白尿，而PLA2R在膜攻擊復(fù)合物引發(fā)足細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮重要作用[11]。HBV-MN腎組織PLA2R陽性則表示HBV病毒在病情進展過程中抗原也可能通過腎小球基膜濾過屏障，引起腎組織PLA2R的特異性改變，引發(fā)腎組織PLA2R陽性。腎組織PLA2R陽性與血清抗PLA2R抗體陽性關(guān)系密切，但本研究數(shù)據(jù)中PLA2R抗原陽性和抗體陽性檢出率并不完全一致，考慮與自身抗體被循環(huán)清除等原因相關(guān)。

SCr、ALB和24 h尿蛋白是臨床評估IMN患者病情嚴(yán)重程度的常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，血清抗PLA2R陽性者ALB水平低于陰性者，24 h尿蛋白水平高于陰性者；腎組織PLA2R陽性者也較陰性者具有更低的ALB水平和更高的24 h尿蛋白水平。相關(guān)性分析也顯示，血清抗PLA2R抗體陽性、腎組織PLA2R與ALB均呈負(fù)相關(guān)，腎組織PLA2R與24 h尿蛋白呈正相關(guān)。上述結(jié)果均說明，HBV-MN患者PLA2R與其病情嚴(yán)重程度存在一定關(guān)聯(lián)。IMN患者也有結(jié)論相似的相關(guān)研究，說明IMN患者血清PLA2R抗體水平與血清ALB和尿蛋白存在顯著相關(guān)，血清抗體水平較低這，自發(fā)緩解率較高，預(yù)后較好[12-13]。出現(xiàn)這種情況，可以佐證腎組織PLA2R在IMN和HBV-MN足細(xì)胞損傷中起的作用，腎組織PLA2R陽性者靶抗原暴露更多，腎小球濾過屏障破壞更嚴(yán)重，因此尿蛋白水平更高，白蛋白下降更快。

綜上所述，HBV-MN患者腎組織PLA2R及血清抗PLA2R抗體表達(dá)陽性率分別為45%和33.75%，HBV-MN患者PLA2R抗原抗體表達(dá)水平與其腎功能相關(guān)指標(biāo)存在相關(guān)性，腎組織PLA2R、血清PLA2R抗體表達(dá)水平均能在一定程度上反映患者病情嚴(yán)重程度。