嚴(yán) 佳，吳 博,2，陶 春，宋洪濤 （. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州 350025；2. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 35008）

頭癬、體癬、手癬等皮膚病多由淺部真菌感染引起，發(fā)病率高，可達(dá)全部皮膚病的25%左右。常用的市售制劑存在多個(gè)問題，首先，藥效不全面。淺部真菌感染常合并有細(xì)菌感染[1-2]，因此單純給予抗真菌藥物無法根治疾病。其次，耐藥性。市售復(fù)方酮康唑乳膏雖然結(jié)合了抗真菌和抗細(xì)菌藥物，但選用的硫酸新霉素易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。最后，皮膚安全性。為產(chǎn)生抗過敏作用，市售復(fù)方酮康唑乳膏中添加了丙酸氯倍他索，但易導(dǎo)致皮膚燒灼感、瘙癢刺痛和皮膚萎縮，長(zhǎng)期大面積用藥可導(dǎo)致高血糖、尿糖等不良反應(yīng)[3]。對(duì)此，前期研究制備并優(yōu)化了新型復(fù)方酮康唑軟膏，含有酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松[4]。其中，莫匹羅星是新型抗菌藥物，通過結(jié)合細(xì)菌異亮氨酸轉(zhuǎn)RNA 合成酶，阻斷異亮氨酸的供給，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，具有廣譜、高效、不易發(fā)生過敏、不易發(fā)生交叉耐藥和多重耐藥等優(yōu)勢(shì)[5-6]?？匪崮姿蓪儆趶?qiáng)效糖皮質(zhì)激素，皮膚不良反應(yīng)極為少見。

在此基礎(chǔ)上，本課題重點(diǎn)研究自制的復(fù)方酮康唑軟膏的體外抑菌作用，并對(duì)其皮膚刺激性和變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行考察，從而證明自制制劑的有效性和安全性，并說明選擇3 種藥物的合理性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

生物安全柜（HFsafe1200 型，上海力申科學(xué)儀器有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（303-6B 型，南通科學(xué)儀器廠）；霉菌培養(yǎng)箱（MJ-160 型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；LDZX-40KBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

自制復(fù)方酮康唑軟膏（第九〇〇醫(yī)院藥學(xué)科制備，含酮康唑，莫匹羅星，糠酸莫米松，批號(hào)20171220）；復(fù)方酮康唑乳膏（含酮康唑，丙酸氯倍他索，硫酸新霉素，批號(hào)1408028，上海寶龍藥業(yè)有限公司）；莫匹羅星軟膏（含莫匹羅星，批號(hào)20161006，人福醫(yī)藥有限公司）；酮康唑乳膏（含酮康唑，批號(hào)150302，福建太平洋制藥有限公司）。

1.3 菌種

紅色毛癬菌CMCC(F)T1a、須癬毛癬菌CMCC(F)T5a、斷發(fā)毛癬菌CMCC(F)T4b、犬小孢子菌CMCC(F)M3d、石膏樣小孢子菌CMCC(F)M2c、裴氏著色真菌CMCC(F)M2c，均購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 軟膏的制備

參考前期研究制備軟膏[4]，酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松的含量依次為2%、2%和0.1%。同時(shí)，制備缺酮康唑的陰性對(duì)照軟膏、缺莫匹羅星的陰性對(duì)照軟膏分別用于抗真菌試驗(yàn)、抗細(xì)菌試驗(yàn)。

2.2 抑菌試驗(yàn)

2.2.1 方法

取直徑9 cm 的培養(yǎng)皿，加入20 ml 培養(yǎng)液，制成培養(yǎng)基平板。細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1～3 d；真菌用沙堡弱培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。菌落形成后，挑取一定量的菌落，加入1 ml 滅菌蒸餾水，充分混合均勻。采用紫外分光光度計(jì)調(diào)整菌懸液濁度為0.5，相當(dāng)于5×10 CFU/ml。用無菌棉簽蘸取菌懸液，均勻涂布于實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基平皿表面。

采用定性濾紙制成直徑7 mm 的圓形紙片、經(jīng)滅菌，爾后分別浸入空白軟膏（不含藥）、自制復(fù)方酮康唑軟膏、以及市售的復(fù)方酮康唑乳膏、酮康唑乳膏和莫匹羅星軟膏的甲醇溶液中，待藥液完全浸潤(rùn)紙片后，取出紙片放置于已涂布菌懸液的培養(yǎng)基表面。細(xì)菌置隔水式恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3 d，真菌置霉菌培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)7 d。觀察各藥敏紙片周圍抑菌圈，并測(cè)定其直徑值（長(zhǎng)徑與短徑的平均值, mm），每株菌同時(shí)做3 個(gè)平板。

2.2.2 統(tǒng)計(jì)方法

2.2.3 對(duì)真菌抗菌試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莫匹羅星軟膏和空白軟膏的紙片均被真菌包圍，而其余3 種制劑的紙片均產(chǎn)生了明顯的抑菌圈。自制軟膏、市售的酮康唑乳膏和復(fù)方酮康唑乳膏的抑菌圈直徑相當(dāng)（P＞0.05），對(duì)不同真菌的抑菌圈直徑大小為：斷發(fā)毛癬菌＞石膏樣小孢子菌＞裴氏著色真菌＞須癬毛癬菌＞犬小孢子菌＞紅色毛癬菌。由此可知，各制劑的抑菌圈直徑大小順序?yàn)椋鹤灾茝?fù)方酮康唑軟膏=復(fù)方酮康唑乳膏=酮康唑乳膏＞莫匹羅星軟膏=陰性對(duì)照軟膏。提示自制復(fù)方酮康唑軟膏對(duì)真菌的抑菌活性與市售單成分酮康唑乳膏、復(fù)方成分的復(fù)方酮康唑乳膏相當(dāng)，結(jié)果見表1。

2.2.4 對(duì)細(xì)菌抗菌試驗(yàn)結(jié)果

在2 種細(xì)菌的培養(yǎng)皿中，各組對(duì)銅綠假單胞菌均未產(chǎn)生抑菌圈；對(duì)金黃色葡萄球菌，空白軟膏和市售的酮康唑乳膏未產(chǎn)生抑菌圈，其余制劑產(chǎn)生了明顯的抑菌圈。自制軟膏與市售莫匹羅星軟膏的抑菌圈直徑均為20 mm 左右（P＞0.05），且均顯著大于復(fù)方酮康唑乳膏（P＜0.01）。由此可知，各制劑的抑菌圈直徑大小順序?yàn)椋鹤灾仆颠蜍浉?莫匹羅星軟膏＞復(fù)方酮康唑乳膏＞酮康唑乳膏=陰性對(duì)照組軟膏，結(jié)果見表2。

2.3 皮膚安全性實(shí)驗(yàn)[10-12]

2.3.1 單次刺激性試驗(yàn)

取雌雄各半的健康家兔4 只，于試驗(yàn)前24 h，在家兔背部脊柱兩側(cè)對(duì)稱劃定左、右各3 cm×3 cm 的相同區(qū)域。用電剪刀剔除兔毛后，用硫化鈉溶液進(jìn)行脫毛處理，并于脫毛24 h 后，檢查去毛處皮膚是否損傷，排除損傷皮膚。采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，設(shè)給藥組（自制復(fù)方酮康唑軟膏）與對(duì)照組（空白軟膏）。家兔背部左側(cè)皮膚涂布空白軟膏，右側(cè)皮膚涂布0.5 g 復(fù)方酮康唑軟膏，然后用一層玻璃紙和二層紗布覆蓋，再用膠布和繃帶加以固定。

表1 自制與市售制劑對(duì)幾種皮膚真菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果（抑菌圈直徑/mm）

表2 自制與市售制劑對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果（抑菌圈直徑/mm）

采用封閉實(shí)驗(yàn)，貼敷時(shí)間為4 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后除去受試藥品并用溫水清潔給藥部位，在自然光線下觀察皮膚反應(yīng)。于清洗后的1、24、48、72 h 觀察涂抹部位皮膚反應(yīng)，按表3 進(jìn)行皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分，并計(jì)算受試動(dòng)物積分的平均值，按表4 判斷皮膚刺激強(qiáng)度。

觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組僅有1 只家兔出現(xiàn)勉強(qiáng)可見的輕微紅斑，其余均未出現(xiàn)紅斑、充血、水腫等刺激癥狀。根據(jù)表3 評(píng)分，對(duì)照組皮膚刺激反應(yīng)平均積分值為0，而實(shí)驗(yàn)組的分值小于0.5（表5），根據(jù)表4 可認(rèn)為復(fù)方酮康唑軟膏單次給藥對(duì)皮膚無刺激性。

表3 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分

2.3.2 多次刺激性試驗(yàn)

多次刺激性試驗(yàn)中家兔的處理方法和初次給藥方法與“2.3.1”項(xiàng)下相同，不同的是，對(duì)照組和給藥組每天涂抹1 次，給藥時(shí)間持續(xù)涂抹14 d。從第2 天開始，每次涂抹前修剪毛，用溫水清除殘留受試物1 h 后觀察，按表3 評(píng)分。最后按公式每天每只動(dòng)物平均積分=紅斑和水腫積分總和/（受試動(dòng)物×14），計(jì)算平均積分，以表4 判斷皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)。

多次給藥后定期觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的家兔在各時(shí)間均未出現(xiàn)紅斑、充血和水腫等皮膚刺激。實(shí)驗(yàn)組有2 只家兔在8、12、13 和14 d 時(shí)出現(xiàn)極輕微的紅斑，平均分值為0.25，在其余時(shí)間所有家兔無紅斑、充血等刺激癥狀（表6），根據(jù)表4 可認(rèn)為復(fù)方酮康唑軟膏多次給藥對(duì)皮膚無刺激性。

表4 皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)

表5 自制復(fù)方酮康唑軟膏皮膚單次刺激性試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

表6 自制復(fù)方酮康唑軟膏皮膚多次刺激性試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

2.3.3 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

采用豚鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，試驗(yàn)前約24 h，將豚鼠背部左側(cè)2 cm×2 cm 區(qū)域的毛剔短后，用硫化鈉溶液進(jìn)行脫毛處理。脫毛后24 h，檢查去毛處皮膚是否損傷，有損傷的皮膚不宜進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)分為2 個(gè)階段，首先在誘導(dǎo)接觸階段，將約0.5 g 樣品涂于豚鼠皮膚上，用一層玻璃紙和二層紗布覆蓋，再以膠布封閉固定6 h；第7 天和14 天同法重復(fù)一次。在激發(fā)接觸階段，于末次誘導(dǎo)接觸后14～28 d，將約0.2 g 的樣品涂于豚鼠背部右側(cè)2 cm×2 cm 去毛區(qū)（接觸前24 h 脫毛），然后用一層玻璃紙和二層紗布覆蓋，再以無刺激膠布固定6 h。激發(fā)接觸后24 h 和48 h 觀察皮膚反應(yīng)，按表3 評(píng)分，當(dāng)受試組動(dòng)物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分≥2時(shí)，認(rèn)為該動(dòng)物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)(陽性)，按表7判定受試物的致敏強(qiáng)度。

表7 致敏強(qiáng)度分級(jí)

將豚鼠隨機(jī)分為3 組，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組均含20 只豚鼠，陰性對(duì)照組含10 只豚鼠。實(shí)驗(yàn)組采用上述的復(fù)方酮康唑軟膏，陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組的處理方法與實(shí)驗(yàn)組基本相同，但陽性對(duì)照組采用2,4-二硝基氯代苯為樣品，而陰性對(duì)照組在誘導(dǎo)接觸時(shí)不給予任何樣品，在激發(fā)接觸時(shí)給予自制復(fù)方酮康唑軟膏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8 所示，自制復(fù)方酮康唑軟膏致敏率為0，無皮膚變態(tài)反應(yīng)。

2.3.4 組織學(xué)考察

在單次、多次刺激性試驗(yàn)和皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)之后，將試驗(yàn)動(dòng)物處死，并取左右側(cè)皮膚，經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋及切片后，進(jìn)行HE 染色，最后在倒置相差顯微鏡下觀察皮膚。如圖1、2、3 所示，在單次、多次刺激性試驗(yàn)和皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)中，給予自制軟膏后，皮膚的各層結(jié)構(gòu)完整，與對(duì)照組的正常皮膚組織基本一致。

3 討論

淺部真菌病主要由毛癬菌屬、小孢子菌屬和表皮癬菌屬引起[13-14]，其中紅色毛癬菌和須癬毛癬菌是手、足癬中最常見的真菌，70%以上的病例中均可檢出[15]，本研究中抗真菌實(shí)驗(yàn)選擇的菌種均為皮膚癬菌病的最常見的致病菌。酮康唑是抑制真菌的常用藥物，本實(shí)驗(yàn)顯示，自制軟膏抗真菌活性與市售制劑相當(dāng)，特別是在斷發(fā)毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌活性。

表8 自制復(fù)方酮康唑軟膏對(duì)豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

在抗細(xì)菌方面，常見淺表局限性皮膚及軟組織感染，其引起的病原菌相對(duì)簡(jiǎn)單和明確，主要是金葡菌和化膿性鏈球菌[16]。限于實(shí)驗(yàn)室條件，本實(shí)驗(yàn)僅選取現(xiàn)有的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌兩種細(xì)菌為試驗(yàn)菌種。實(shí)驗(yàn)顯示，銅綠假單胞菌不在莫匹羅星抗菌譜中；而含有莫匹羅星的自制軟膏在抗金黃色葡萄球菌活性上大大優(yōu)于市售酮康唑類產(chǎn)品，說明莫匹羅星是本處方較為理想的選擇。

淺部真菌感染經(jīng)治療后極易復(fù)發(fā)的重要原因之一是合并細(xì)菌感染。有報(bào)道稱將市售的復(fù)方酮康唑乳膏與莫匹羅星軟膏交替使用，可對(duì)真菌性皮膚潰瘍患者有更好的治療作用[17]。本研究表明自制復(fù)方酮康唑軟膏兼具顯著的抗真菌和細(xì)菌作用，優(yōu)于多數(shù)市售制劑，且單次給藥和多次給藥的刺激性試驗(yàn)和皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)表明，自制軟膏具有良好的安全性。

自制復(fù)方酮康唑軟膏的藥物組成為淺部真菌感染提供了一種更加簡(jiǎn)便、有效的治療手段。綜合藥效結(jié)果和安全性結(jié)果，自制軟膏有望成為在皮膚淺部真菌感染疾病中，替代市售制劑成為更加優(yōu)越的選擇。