高瑞敏，康玲玲，侯防震

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)二科，河北 唐山 063000；2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院心內(nèi)四科，河北 唐山 063000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF) 是指由于心臟結(jié)構(gòu)、心臟功能異常等導(dǎo)致心室充盈、射血能力受損引起的一種復(fù)雜的臨床癥狀群，是絕大多數(shù)心臟疾病患者發(fā)展的終末階段，病死率較高[1-2]。CHF多由心肌疾病、心肌梗死、血流動力學(xué)過度負(fù)荷和炎癥爆發(fā)等原因?qū)е滦募p傷，誘發(fā)心肌結(jié)構(gòu)以及功能變化，使得心室泵血或充盈功能低下[3]。CHF發(fā)生時，心肌細(xì)胞持續(xù)凋亡，而剩余的心肌細(xì)胞功能逐漸退化誘發(fā)心臟功能不斷惡化。因而心肌細(xì)胞的凋亡及心肌纖維化是心衰的主要病理基礎(chǔ)[4]。近年來，越來越多的研究[5-6]顯示：中藥及其提取物在保護(hù)心臟、防止心肌細(xì)胞凋亡及纖維化等方面具有獨特的作用。丹皮酚主要為中藥丹皮或徐長卿等的活性成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、抑制脂質(zhì)過氧化和抗過敏等作用，研究[7-8]顯示：丹皮酚對缺血再灌注大鼠心肌具有保護(hù)作用。有研究者將培養(yǎng)的高血壓病血瘀證患者的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)分別用不同濃度的丹皮酚含藥血清干預(yù)，證實丹皮酚能夠很好調(diào)節(jié)患者免疫功能,對高血壓病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞有很好的保護(hù)作用[9]。但丹皮酚對CHF患者的心肌保護(hù)作用及其藥理機(jī)制少見報道。本研究采用阿霉素尾靜脈注射建立CHF大鼠模型，觀察丹皮酚對CHF大鼠心功能的保護(hù)作用并探討其藥理學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器SPF級Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自河北省實驗動物生產(chǎn)有限公司,動物使用許可證號為SYXK(冀)2012-0002。實驗操作嚴(yán)格按照我國《實驗動物管理條例》進(jìn)行，實驗動物均飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，不限供應(yīng)干凈水并按標(biāo)準(zhǔn)供應(yīng)動物飼料，室內(nèi)環(huán)境控制在日夜交替12 h/12 h，溫度控制在20℃～26℃，濕度控制在 50% ～60%范圍內(nèi)。 大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素6 (interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(美國Biolegend 有限公司)，鼠抗人Bax、B細(xì)胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartic acid protease-3, Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Cysteine aspartic acid protease-8, Caspase-8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Cysteine aspartic acid protease-9, Caspase-9)和細(xì)胞色素C (cytochrome C， Cyt-C)單克隆抗體和鼠抗人GADPH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，阿霉素注射劑(山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號151004) ，丹皮酚片劑(廣西億康藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H45021119)。立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、紫外可見分光光度計、光學(xué)顯微鏡和低溫高速離心機(jī)均由本院中心實驗室提供。

1.2 動物模型建立和分組給藥大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[10]方法復(fù)制大鼠CHF模型。阿霉素總劑量15 mg·kg-1，每次2.5 mg·kg-1(10 mL·kg-1)，1周3次腹腔內(nèi)注射，共進(jìn)行2周。成模標(biāo)準(zhǔn)：首次阿霉素注射5周后行超聲心動圖檢查，大鼠心腔擴(kuò)大且左室短軸縮短率 (left ventricular fractional shortening，LVFS)<30%。成模大鼠共43只，隨機(jī)分為4組：模型組(10只)、卡托普利組(11只)、低劑量丹皮酚組(11只)和高劑量丹皮酚組(11只)?？ㄍ衅绽M大鼠灌胃給予卡托普利25 mg·kg-1，低和高劑量丹皮酚組大鼠分別灌胃給予75和150 mg·kg-1丹皮酚[11]，每日1次，連續(xù)給藥5周。另隨機(jī)選取同批次正常大鼠10只作為對照組，對照組和模型組大鼠灌胃給予等量蒸餾水。每周記錄體質(zhì)量1次。

1.3 各組大鼠心功能指標(biāo)檢測各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉 (50 mg·kg-1)麻醉，仰位固定，頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，將充滿1%肝素的導(dǎo)管自右頸總動脈徐緩進(jìn)入，另一端連接PowerLab生物信號采集與分析系統(tǒng)，密切觀察壓力曲線，待導(dǎo)管進(jìn)入左心室，即示波顯示為左心室壓力曲線后，穩(wěn)定5 min，記錄心功能指標(biāo)。檢測指標(biāo)包括平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)、心率(heart rate, HR)、左室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室收縮壓(1eft ventricular systolic pressure，LVSP)、左室內(nèi)壓最大下降速率(1eft ventricular maximal rates of pressure fall，-dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大上升速率(1eft ventricular maximal rates of pressure rise，+dp/dtmax)。連續(xù)測量5次，每次間隔3 min，以平均值作為結(jié)果。

1.4 ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α和IL-6水平末次給藥后，麻醉大鼠，取眼眶外周血分離血清，采用 ELISA 試劑盒檢測大鼠血清中血清中 TNF-α和IL-6水平，單位為ng·L-1。

1.5 Western blotting法檢測各組大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平末次給藥后，隨機(jī)選取5只大鼠頸椎脫臼處死，在無菌操作下取出心臟組織于蛋白裂解緩沖液中勻漿, 按照參考文獻(xiàn)[12-13]的方法，分離提取各個大鼠心臟總蛋白，蛋白于SDS-PAGE 膠上進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶(5%)封閉， 于4 °C搖床中用稀釋1 000倍的一抗(Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Cyt-C和GADPH)孵育過夜，PBS洗膜3次，稀釋5 000倍的二抗孵育 1.5 h, PBS洗膜3次，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像。利用化學(xué)發(fā)光熒光成像儀的圖像分析功能對條帶灰度進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.6 HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)末次給藥后，隨機(jī)選取5只大鼠麻醉后，在無菌操作下取出心臟，取一部分組織塊置于10%甲醛溶液中固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，厚度為4 μm，HE染色，中性樹膠封片后于LEICA DMLB型光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心臟組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量造模前各組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后，與對照組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)；給藥后，與模型組比較，卡托普利組和低、高劑量丹皮酚組大鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)，其中以高劑量丹皮酚組大鼠體質(zhì)量增加更明顯。見表1。

2.2 各組大鼠心功能指標(biāo)與對照組比較，模型組大鼠HR降低(P<0.05)，MAP明顯升高(P<0.05); 與模型組比較，卡托普利組和高劑量丹皮酚組大鼠HR升高(P<0.05)，MAP明顯降低(P<0.05) ；與卡托普利組比較，低和高劑量丹皮酚組大鼠HR和MAP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，模型組大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組及低、高劑量丹皮酚組大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均不同程度升高(P<0.05)，LVEDP不同程度降低(P<0.05)，其中以高劑量丹皮酚組效果較好。見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量

表2 各組大鼠大鼠心功能指標(biāo)

2.3 各組大鼠血清中 TNF-α和IL-6水平給藥5 d 后,與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組和低、高劑量丹皮酚組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平明顯降低 (P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6水平

2.4 各組大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，卡托普利及各劑量丹皮酚組大鼠心肌組織中Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖1和表4。

2.5 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)對左心室進(jìn)行橫切，HE 染色后觀察：對照組大鼠心肌纖維排列整齊，未見破壞，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻，橫紋規(guī)律，細(xì)胞間隙正常；模型組大鼠心肌組織受損明顯，心肌細(xì)胞廣泛水腫，并且出現(xiàn)空泡變性，受損嚴(yán)重的心肌細(xì)胞可見小灶狀或片狀壞死，部分心肌纖維斷裂，肌原纖維溶解，心肌細(xì)胞間隙明顯增寬；卡托普利組和低、高劑量丹皮酚組大鼠心肌組織可見輕度心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維排列和心肌間質(zhì)水腫等現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)。見圖2(插頁五)。

Lane 1: Control group; Lane 2:Model group; Lane 3: High dose of paeonol group; Lane 4: Low dose of paeonol group; Lane 5: Captopril group.

表4 各組大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討 論

CHF發(fā)生發(fā)展的基本病理過程是心肌重構(gòu)，其病理過程包括病理性心肌細(xì)胞肥大伴胚胎性基因再表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡與壞死、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和降解增加、心肌細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)的改變等[14]，其中心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化是CHF的主要病理基礎(chǔ)。臨床治療中降低心肌細(xì)胞凋亡水平是CHF治療的有效策略[15]。因為在CHF發(fā)生發(fā)展過程中，心肌細(xì)胞的凋亡可由氧化應(yīng)激、容量或壓力過度負(fù)荷及腎上腺素、血管緊張素Ⅱ和致炎細(xì)胞因子的過度釋放以及缺血、缺氧等誘導(dǎo)發(fā)生。心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量丟失，而剩余的心肌細(xì)胞常發(fā)生功能下降，當(dāng)心肌細(xì)胞數(shù)量降低到一定程度后，會使得CHF進(jìn)行性惡化，形成一個惡性循環(huán)的病理過程[16]。

本研究通過阿霉素腹腔注射構(gòu)建CHF大鼠模型，結(jié)果顯示：對照組大鼠外觀和行為均正常，造模大鼠阿霉素注射5周后超聲心動圖檢查顯示心腔擴(kuò)大，LVFS<30%，且造模大鼠毛發(fā)改變、皮膚紫紺、四肢水腫、呼吸頻率加快和行動遲緩等均符合CHF的特征，證明成功建立CHF模型。 HR、MAP、LVEDP、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax是動物實驗評價心臟功能的關(guān)鍵指標(biāo)[17-18]。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠MAP、LVEDP升高而HR、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低，表明大鼠心臟功能明顯下降，而經(jīng)丹皮酚治療后, 模型大鼠心功能指標(biāo)明顯改善，大鼠心肌組織中Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2明顯升高。本研究中組織形態(tài)學(xué)觀察顯示：丹皮酚能明顯減輕CHF大鼠心肌損傷，改善心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞水腫和結(jié)構(gòu)破壞等，且高劑量丹皮酚組效果更好。有研究[19-20]表明：丹皮酚可增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)，激活Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9等抗細(xì)胞凋亡信號通路因子，從而起到保護(hù)心肌的作用。臨床研究[21-22]顯示：CHF患者血清中炎癥因子 IL-6和TNF-α水平隨著心功能的惡化而逐漸升高， IL-6和TNF-α 水平是CHF嚴(yán)重程度的重要預(yù)測指標(biāo)，細(xì)胞因子系統(tǒng)的持續(xù)激活是導(dǎo)致心室重塑和心衰惡化的重要原因。本研究選用經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利作為陽性對照藥，結(jié)果顯示：卡托普利對CHF大鼠體征及一般狀態(tài)的改善效果較高劑量丹皮酚組差，對血清IL-6和TNF-α的抑制作用較不同劑量丹皮酚組作用強(qiáng)，提示卡托普利在抗炎和抗細(xì)胞損傷方面比較有優(yōu)勢，但是在心功能改善和抑制心肌纖維化方面，卡托普利與丹皮酚比較無明顯差異，且高劑量丹皮酚在大鼠心功能保護(hù)及抗心肌細(xì)胞凋亡方面效果更好。