周 寧，武 睿，馬振凱，陳微微，李雪琳，宮凱凱，楊麗娟，代娟娟，武 艷

(1. 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，山東 濱州 256600；2. 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤研究實驗室，山東 濱州 256600；3. 山東省濱州市人民醫(yī)院神經外科，山東 濱州 256600)

肺癌的發(fā)生發(fā)展與異常的基因表達調控有密切關聯(lián)，RNA編輯是一種重要的基因轉錄后修飾方式，在調控基因表達中發(fā)揮重要作用。作用于RNA的腺苷酸脫氫酶1(adenosine deaminase acting on RNA enzyme 1，ADAR1)能夠催化RNA上腺嘌呤轉化為次黃嘌呤(A-I)，并將次黃嘌呤識別為鳥嘌呤，與胞嘧啶進行配對，最后導致蛋白質中氨基酸的改變，是一種重要的RNA編輯酶[1]。ADAR1的主要功能是編輯內源的雙鏈核糖核酸(double-stranded RNA，dsRNA)使之與病毒來源的dsRNA區(qū)分開來[2]。研究[3-4]表明：缺失ADAR1的造血干細胞導致干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)表達上調，ADAR1在免疫應答中起重要作用。ADAR1還具有非依賴編輯的功能，例如能夠防止轉錄本的降解。雙鏈RNA結合蛋白staufen1和staufen2與mRNA的結合能招募上游移碼突變體(up-frameshift mutant 1，UPF1)，并能激活staufen進而促進RNA降解(SMD)[5-6]。ADAR1表達水平變化還與黑色素瘤[7]、食道癌[8]、慢性白血病[9]和宮頸癌[10]等的發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián)。有文獻[11]報道：ADAR1通過增強局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)mRNA的穩(wěn)定性促進肺腺癌細胞的遷移和浸潤。但敲低ADAR1對肺癌細胞增殖和上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的調控機制尚無報道。本研究利用RNA干擾技術敲低細胞中ADAR1表達水平，建立了穩(wěn)定表達shADAR1的H1299和H520細胞系，并通過細胞增殖、克隆形成、細胞劃痕實驗及Western blotting法評價ADAR1對細胞增殖、遷移和EMT的調節(jié)作用，以期為研究ADAR1在肺癌發(fā)展中的作用機制奠定基礎，同時為以ADAR1為靶點的抗癌藥物設計提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人肺癌H1299和H520細胞購自美國模式培養(yǎng)物研究所(ATCC)。胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)和RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，shADAR1和對照質粒(negative shRNA)購自上海吉凱基因化學技術有限公司，Lipofectamine 2000 購于美國Invitrogen公司，TRIzol試劑和PCR所需引物購于上海生物工程有限公司，逆轉錄試劑購于Thermo公司，ADAR1單克隆抗體、Tubulin抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體購于美國Proteintech公司，波形蛋白(vimentin)抗體和E鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購自美國Abcam公司，CCK-8 試劑購于上海碧云天公司。CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，激光共聚焦顯微鏡(美國Leica公司)，酶標儀(美國Bio-Tek公司)。

1.2 細胞轉染和穩(wěn)定細胞系的構建細胞用含10%胎牛血清和1%(V/V)青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H1299和H520細胞均分為對照組和shADAR1組，分別將1.5 μg negative shRNA質?；騭hADAR1質粒與Lipofectamine 2000 4 μL 混合后，加入培養(yǎng)基100 μL，室溫孵育25 min，分別加入到生長密度為60%～80%的H1299和H520細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后，以野生型細胞為平行對照進行嘌呤霉素篩選，藥物濃度為2 mg·L-1，2周后平行對照細胞全部死亡，并且熒光顯微鏡下轉染后細胞全部發(fā)出綠色熒光，即穩(wěn)定細胞系構建成功，后續(xù)改為嘌呤霉素半量維持培養(yǎng)。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測細胞中ADAR1 mRNA表達水平收集各組細胞，TRIzol 法提取細胞總RNA，將提取的RNA應用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，應用TransStart Green qPCR SuperMix進行PCR 驗證。qRT-PCR的反應條件：95 ℃、30 s 預變性；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)。引物序列：ADAR1，上游引物為5′-CCCTTCAGCCACATCCTTC-3′，下游引物為5′-GCCATCTGCTTTGCCACTT-3′；GAPDH，上游引物為5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物為 5′- GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。進行3次重復實驗，以GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCt法計算ADAR1 mRNA相對表達水平。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性將各組細胞以5×103/孔接種于96 孔板，每組設置3個平行孔，每過12 h 加入CCK-8 繼續(xù)培養(yǎng)3 h，采用酶標儀測定各孔在450 nm 波長處的吸光度(A)值，共測定至72 h，實驗重復3次，取平均A值，以A值代表細胞增殖活性，對0 h平均A值進行均一化處理后，采用GraphPad Prism 7.0軟件繪制各組細胞隨時間變化的增殖曲線。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成能力將各組細胞以1×103個/孔的密度接種于6孔板中，每組設2個復孔。培養(yǎng)14 d后，吸盡培養(yǎng)基并用PBS清洗細胞，加入4%多聚甲醛固定5 min，再用0.1%結晶紫染液染色15 min，用PBS清洗后拍照并計算克隆形成數(shù)，代表細胞的克隆形成能力。實驗重復3次。

1.6 劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率各組細胞培養(yǎng)過夜后，用200 μL槍頭進行劃痕，PBS洗滌后，加入新鮮無血清培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0 和48 h進行拍照。實驗重復3次，應用Image J 軟件對劃痕距離進行統(tǒng)計學分析，并采用Graph Pad Prism 7.0軟件繪制各組細胞的劃痕愈合率圖。細胞劃痕愈合率=(0 h劃痕間距-48 h劃痕間距)/0 h劃痕間距×100%。

1.7 Western blotting法檢測細胞中ADAR1、E-cadherin和vimentin蛋白表達水平收集各組H1299和H520細胞，NP-40 裂解液裂解細胞，BCA法測定濃度后，通過10% SDS-PAGE進行電泳，轉膜，封閉后分別孵育抗ADAR1(1∶1 000)、抗Tubulin(1∶1 000)、抗vimentin(1∶1 000)和抗E-cadherin(1∶1 000)抗體過夜，次日PBST洗滌3次，孵育HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG 抗體(1∶1 000)，加入ECL顯色底物，應用成像系統(tǒng)進行成像拍照，實驗重復3次。利用Image J分析軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/Tubulin蛋白條帶灰度值比值作為目的蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 敲低ADAR1穩(wěn)定細胞系的構建和鑒定將攜帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的shADAR1載體和對照質粒分別瞬時轉染H1299及H520細胞后，應用熒光顯微鏡檢測GFP的表達情況，以此檢測脂質體的轉染效率。結果顯示:H1299和H520細胞中轉染對照質粒和shADAR1后，90%以上細胞中均可見綠色熒光。見圖1(插頁一)。

與對照組(1.000±0.081和1.000±0.040)比較，shADAR1組H1299和H520細胞中ADAR1 mRNA表達水平(0.530±0.040和0.405±0.045)均明顯降低(t=5.255，P<0.05；t=9.882，P<0.01)。Western blotting法檢測結果顯示：shADAR1組H1299和H520細胞中ADAR1蛋白表達水平(0.296±0.014和0.371±0.052)明顯低于對照組(1.000±0.126和1.000±0.043)(P<0.05)。見圖2。

2.2 各組細胞增殖活性與對照組比較，shADAR1組H1299和H520細胞增殖活性明顯降低(H1299：t=3.106，P<0.05；H520：t=3.255，P<0.01)。見圖3。

2.3 各組細胞克隆形成數(shù)與對照組(172.500±10.607和213.500±6.364)比較，shADAR1組H1299和H520細胞克隆形成數(shù)(38.500±6.364和59.500±4.950)明顯降低(t=14.58，P<0.01；t=16.75，P<0.01)，即克隆形成能力降低。見圖4。

A:H1299 cells;B:H520 cells;Lane 1: Control group; Lane 2: shADAR1 group.

2.4 各組細胞劃痕愈合率與對照組(59.1%±8.7%和57.7%±1.7%)比較，shADAR1組H1299和H520細胞劃痕愈合率(43.6%±8.9%和45.1%±5.0%)明顯降低(t=3.043，P<0.01；t=4.149，P<0.01)。見圖5。

A: H1299 cells; B: H520 cells. *P<0.05, **P<0.01 compared with control group.

A, B:Control group; C, D: shADAR1 group; A, C: H1299 cells; B, D: H520 cells.

2.5 各組細胞中轉移相關基因E-cadherin 和vimentin蛋白表達水平shADAR1組H1299和H520細胞中E-cadherin蛋白表達水平(1.700±0.018和2.481±0.152)明顯高于對照組(1.000±0.070和1.000±0.084)(t=13.8，P<0.01；t=12.02，P<0.01)。

shADAR1組H1299和H520細胞中vimentin蛋白表達水平(0.160±0.009和0.336±0.049)明顯低于對照組(1.000±0.056和1.000±0.056)(t=20.68，P<0.01；t=12.49，P<0.01)。見圖6。

3 討 論

化療在非小細胞肺癌治療中占重要地位，但是多數(shù)的治療效果并不理想，主要原因是癌細胞在治療過程中產生了抗藥性。因此，研究肺癌發(fā)生發(fā)展中的關鍵調控因子，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點對肺癌的治療具有重要意義。

RNA編輯主要指在轉錄本上堿基的插入、缺失或者替換，是一種重要的轉錄后修飾[12]，其中A-to-I(也稱為A-to-G編輯)是哺乳動物中最常見的RNA編輯方式。ADAR1是一種重要RNA編輯酶，存在2種單體形式，分別為ADAR1p110和ADAR1p150[13]。ADAR1 相互作用的蛋白主要分為兩類，一類是早期發(fā)現(xiàn)能被ADAR1編輯的相互作用蛋白，如丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKR)[14]；另一類是不依賴編輯功能，直接與ADAR1 相互作用的蛋白，如核因子(nuclear factor，NF)45[15]和NF90[16]，隨后還發(fā)現(xiàn)移碼突變蛋白1(Upf1)[17]和Dice 酶[18]，均可與ADAR1相互作用，在機體內發(fā)揮重要的生物學功能。

A-D:0 h;E-H:48 h;A,B,E,F:H1299 cells;C,D,G,H:H520 cells;A,C,E,G:Control group;B,D,F,H:shADAR1 group.

A：H1299 cells；B：H520 cells; Lane 1: Control group;Lane 2: shADAR1 group.

ADAR1除在免疫應答中的重要作用之外，在多種腫瘤中存在過表達的現(xiàn)象，并在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調控作用，例如在肝癌中，ADAR1 的表達水平上調后能穩(wěn)定抗酶抑制因子1(antizyme inhibitor 1，AZIN1)的水平，導致下游原癌基因表達上調[19]。在結直腸癌中，Ras同源基因家族成員Q(ras homolog family member Q，RHOQ)的A-to-Ⅰ的編輯能夠增加腫瘤細胞的侵襲潛能[20]。異常表達的ADAR1通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)/p70S6K信號通絡調控胃癌的發(fā)生發(fā)展[21]。本研究通過RNA干擾技術并通過抗生素篩選獲得穩(wěn)定低表達ADAR1細胞系，并通過CCK-8實驗、克隆形成及劃痕實驗證明：敲低ADAR1能夠抑制H1299和H520細胞的增殖和遷移能力。本研究結果與文獻[22]報道的異常表達的ADAR1促進肺癌的發(fā)生發(fā)展過程的結果一致。最近研究[23]顯示：異常表達的ADAR1通過提高c-myc的穩(wěn)定性介導了胰腺癌細胞對布羅莫結構域和外末端基元蛋白(bromodomain and extraterminal motif，BET)的抵抗性。上述結果說明：ADAR1作為一種促癌基因在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，也可能參與了腫瘤耐藥性的產生。

EMT是腫瘤細胞遷移浸潤的重要途徑，E-cadherin表達下調、vimentin表達上調是EMT的特征之一[24]。E盒結合鋅指蛋白1(zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1)[25]、鋅指轉錄因子2(zinc finger transcription factor 2，snail2)[26]等在轉錄水平上抑制E-cadherin的表達，促進細胞的EMT轉化。EMT能夠促進癌細胞的轉移、浸潤和藥物抵抗。本研究結果表明：敲低ADAR1可激活E-cadherin，并抑制vimentin的表達，抑制H1299和H520細胞的EMT過程，但ADAR1調控EMT的具體作用機制還需進一步深入研究。

綜上所述，本研究首先通過RNA干擾技術抑制細胞中ADAR1表達，并進一步驗證敲低ADAR1后可抑制肺癌H1299和H520細胞的增殖、遷移和EMT。本研究結果為肺癌的發(fā)病機制和治療靶點的研究提供了理論依據(jù)。