趙星月, 陳建斌, 王曙光, 張曉林, 穆 野, 魏 輝, 趙立華, 陳永對, 鄭 雪, 陳 勇, 鄭立敏,*, 張 潔,*

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 昆明 650224; 2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所, 云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650205; 3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 長沙 410125; 4. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部福州作物有害生物科學(xué)觀測試驗(yàn)站, 福州 350003)

番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(tomato zonate spot virus, TZSV)是在云南省發(fā)現(xiàn)的布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus暫定種，該病毒侵染危害煙草Nicotianatabacum、番茄Lycopersiconesculentum、辣椒Capsicumannuum和花卉等重要經(jīng)濟(jì)作物，近年來有向云南周邊地區(qū)擴(kuò)散蔓延的趨勢(Dongetal., 2008)。TZSV侵染寄主植株后，呈現(xiàn)出典型的番茄斑萎病毒屬細(xì)胞病理特征，病毒粒子分布于感染植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈球形，由一層糖蛋白膜包裹，病毒粒子相對較大，直徑約85 nm，單個(gè)或多個(gè)病毒粒子聚集于囊泡內(nèi)。植物感染該病毒后，新葉首先出現(xiàn)黃色同心環(huán)紋或環(huán)形帶狀褪綠斑點(diǎn)，之后由黃斑轉(zhuǎn)變?yōu)榭莅?，葉片出現(xiàn)黃化、凋零，造成整葉或半葉呈紅褐色壞死。感病植株還會(huì)出現(xiàn)矮化、頂芽萎蔫下垂、葉片皺縮褪綠等癥狀(Dongetal., 2008; 趙繞芬和王小兵, 2012)。雖然近年來許多學(xué)者對TZSV的病原生物學(xué)進(jìn)行了廣泛的研究，明確了病毒的地理分布、癥狀、病原性質(zhì)、細(xì)胞病理學(xué)等諸多問題，但對TZSV編碼蛋白與寄主植物和介體昆蟲蛋白互作機(jī)制仍然知之甚少，尤其對該病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制增殖、運(yùn)動(dòng)、致病等作用機(jī)制以及與寄主互作相關(guān)研究欠缺。

TZSV病毒是一種RNA病毒，其基因組由3條RNA鏈組成，即ssRNA-L, ssRNA-M和ssRNA-S(Elliot, 1990; Germanetal., 1992)。其中，ssRNA-L是反向負(fù)義鏈，編碼依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)(de Haanetal., 1991)；早在20世紀(jì)70年代，RdRP就在病毒中被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的RNA病毒都編碼RdRP，主要參與病毒基因組的復(fù)制、mRNA合成、RNA重組等過程。RdRP在病毒復(fù)制中起著至關(guān)重要的作用。ssRNA-M編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSm(Kormelinketal., 1993)；由RNA-M正義鏈編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NSm是唯一一種布尼亞病毒科其他動(dòng)物病毒所不能編碼的蛋白，被認(rèn)為是Orthotospovirus適應(yīng)植物的結(jié)果(Lietal., 2009)。Kormelink等(1994)首次提取和純化了NSm，利用免疫標(biāo)記等方法證明了NSm參與了病毒的胞間運(yùn)動(dòng)(cell-to-cell movement)。ssRNA-S編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs(de Haanetal., 1990)。TZSV主要由薊馬以持久增殖型方式傳播。本課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在TZSV感染作物發(fā)病區(qū)，西花薊馬Franiklinellaocicdentalis為優(yōu)勢種群，此外還發(fā)現(xiàn)有棕櫚薊馬Franiklinellapalmi和梳缺花薊馬Franiklinellashculetzi(尹躍艷等, 2008; 鄭雪等, 2015)。

NSs是ssRNA正鏈編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，最初被認(rèn)為是病毒的致病因子，該蛋白在植物體內(nèi)表達(dá)能夠增強(qiáng)病癥表型(Kormelinketal., 1991)。Takeda等(2002)首次用農(nóng)桿菌共浸潤實(shí)驗(yàn)證實(shí)了番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)NSs蛋白為基因沉默抑制子。近年來的研究顯示NSs可能在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用(Oliveiraetal., 2011; Margariaetal., 2014)。而關(guān)于TZSV NSs在病毒與介體昆蟲互作中發(fā)揮的具體功能和機(jī)制尚不清楚。本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以TZSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSs為誘餌蛋白，篩選西花薊馬體內(nèi)與NSs互作的介體蛋白。通過對互作介體因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，推測其在病毒與介體昆蟲互作過程中可能具有的生物學(xué)功能，為深入了解TZSV致病特征及病原與介體昆蟲的互作機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)室感染TZSV和TSWV毒株采自云南元謀，經(jīng)分離純化獲得的病毒汁液摩擦接種到本氏煙Nicotianabenthamiana，感病植株葉片保存于超低溫冰箱作為毒源。西花薊馬的cDNA文庫由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所饋贈(zèng)。大腸桿菌EscherichiacoliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pEASY-T1、TransStart?TopTaqDNA聚合酶、High Pure dNTPs、10×Taq Buffer和瓊脂糖等試劑購自TransGen Biotech有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒、溶壁酶購自天根生化科技(北京)有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自Vazyme Biotech有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶、營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基、無氨基氮源、YeastmakerTMCarrier DNA Denatured、T4 DNA連接酶、酵母菌株AH109、pGADT7和pGBKT7質(zhì)粒等試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xoid公司；葡萄糖、二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、醋酸鋰(LiAc)、X-α-Gal等試劑購自Sigma公司；瓊脂粉購自Difco公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純(A.R.)。

1.2 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建

將1.1節(jié)約0.1 g感染了TZSV的本氏煙樣品在液氮中充分研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至液氮冷凍過的1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol，劇烈震蕩混勻，然后參考Invitrogen公司Trizol試劑的操作方法提取總RNA；根據(jù)GenBank已登錄的TZSVNSs(GenBank登錄號: KC133530.1)序列設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增TZSVNSs的特異引物，并根據(jù)酵母表達(dá)載體構(gòu)建的要求，在上游引物和下游引物分別加入特定的酶切位點(diǎn)NdeⅠ和BamHⅠ(表1)，引物序列見表1。以提取的總RNA為模板，NSs基因?qū)?yīng)的3′端下游引物NSs-R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系: RNA 2 μg, NSs-R引物(2 μmol/L)1 μL, ddH2O至8 μL。反應(yīng)條件: 65℃加熱5 min，放置于冰上靜置2 min，加入2×RT Mix 10 μL, HiScript? Enzyme Mix 2 μL, 50℃反應(yīng)1 h，85℃滅活5 min，冰上放置即為獲得的cDNA模板。最后以cDNA為模板，利用NSs基因的引物(NSs-F/NSs-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因，反應(yīng)體系(50 μL): 10×buffer 5.0 μL,TopTaqDNA聚合酶 1.0 μL, dNTP Mix 4.0 μL, NSs-F和NSs-R(2 μmol/L)各1.0 μL, cDNA模板5.0 μL, ddH2O 33.0 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min, 共30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，進(jìn)行膠回收并純化。將PCR產(chǎn)物割膠回收后與克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50 μg/mL氨芐青霉素LB平板，菌落PCR及序列測定獲得陽性克隆，命名為pEASY-NSs。用NdeⅠ和BamHⅠ分別消化重組質(zhì)粒pEASY-NSs及pGBKT7載體質(zhì)粒，純化回收后，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性平板篩選誘餌載體陽性克隆，菌落PCR和酶切鑒定獲得誘餌載體的陽性克隆，命名為pGBKT7-NSs。將上述獲得的質(zhì)粒送往擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，并通過NCBI網(wǎng)站的BLAST對測序結(jié)果進(jìn)行比對，將測序結(jié)果完全正確的重組質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酵母雙雜交誘餌載體的毒性和自激活檢測

采用醋酸鋰法將誘餌表達(dá)載體pGBKT7-NSs、空載體pGBKT7(陰性對照組)分別轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，并涂布于SD/-Trp上，30℃下倒置培養(yǎng)2～3 d后，觀察菌落生長情況。同樣采用醋酸鋰法將陽性對照(pGBKT7-53/pGADT7-T)、陰性對照(pGBKT7-Lam/pGADT7-T)以及pGBKT7-NSs/pGADT7-T分別轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞AH109內(nèi)，并涂布于SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上，30℃下倒置培養(yǎng)2～3 d后，選取單克隆劃線于SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade/X-α-Gal和SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，30℃下倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察并比較酵母菌落的生長狀態(tài)和顏色變化,判斷NSs蛋白對酵母AH109細(xì)胞是否有毒性和自激活活性。

1.4 酵母雙雜交順序轉(zhuǎn)化篩選與NSs互作的蛋白和生物信息學(xué)分析

采用順序轉(zhuǎn)化法篩選西花薊馬cDNA文庫中與NSs互作的蛋白。將pGBKT7-NSs轉(zhuǎn)化至酵母AH109后，以含有pGBKT7-NSs的AH109酵母菌制備感受態(tài)細(xì)胞。將西花薊馬的cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有pGBKT7-NSs的AH109酵母菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有2.5 mmol/L 3氨基-1,2,4三氮唑(3-AT)的篩選培養(yǎng)基SD/-His/-Leu/-Trp上，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d后，挑取SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT平板上生長的單菌落，接種于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母的生長及顯色情況。

挑取SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上的陽性菌落，加入到含有氨芐青霉素的液體SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基中，置于30℃, 220 r/min搖床培養(yǎng)24 h，參考酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。以質(zhì)粒為模板，pGADT7載體通用引物見表1。進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分析pGADT7載體中插入片段的大小并排除重復(fù)克隆。舍棄插入片段小于500 bp的質(zhì)粒，其余轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，送交公司測序。根據(jù)序列信息分析插入片段序列，參照NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，找到同源序列，統(tǒng)計(jì)序列長度、基因登錄號、基因注釋、讀碼框完整性、讀碼框一致性等信息，初步篩選出與NSs互作的介體蛋白。

1.5 酵母細(xì)胞內(nèi)回轉(zhuǎn)驗(yàn)證TZSV NSs與介體蛋白候選因子的相互作用

將類電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like, VDAC)全長基因序列構(gòu)建至pGADT7載體進(jìn)行互作驗(yàn)證。根據(jù)GenBank已登錄的西花薊馬VDAC(GenBank登錄號: XM_026416489.1)序列設(shè)計(jì)VDAC的特異引物，并根據(jù)酵母表達(dá)載體構(gòu)建的要求，在上游引物和下游引物分別加入特定的酶切位點(diǎn)NdeⅠ和BamHⅠ，引物序列見表1。取約20頭西花薊馬，提取其總RNA，并以VDAC-R為特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得西花薊馬cDNA模板(RNA提取和反轉(zhuǎn)錄過程參考1.2節(jié))。以VDAC-F/VDAC-R為引物，PCR擴(kuò)增VDAC基因，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2節(jié)。將擴(kuò)增并純化的VDAC基因擴(kuò)增序列克隆到pEASY-T1載體上，經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接到酵母表達(dá)載體pGADT7，獲得酵母重組表達(dá)載體pGADT7-VDAC。

將pGBKT7-NSs和候選因子pGADT7-VDAC共轉(zhuǎn)化至酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp/-Leu平板，30℃下倒置培養(yǎng)，直至克隆菌落出現(xiàn)，牙簽蘸取SD/-Trp/-Leu平板上生長的單菌落，置于20 μL ddH2O中，即為初始菌液濃度100，按4個(gè)濃度梯度(10-1, 10-2, 10-3和10-4)對初始菌液進(jìn)行稀釋，分別接種于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板，同時(shí)設(shè)置陽性對照組(pGBKT7-p53/pGADT7-T)、陰性對照組(pGBKT7-Lam/pGADT7-T)、空載體共轉(zhuǎn)化對照組(pGADT7/pGBKT7)以及質(zhì)粒與空載體共轉(zhuǎn)化對照組(pGBKT7-NSs/pGADT7； pGADT7-VDAC/pGBKT7)。30℃倒置培養(yǎng)3～5 d后，觀察酵母的生長情況。

1.6 pGEX-4T-1-VDAC和pDEST17-NSs原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank已登錄的西花薊馬VDAC(GenBank登錄號: XM_026416489.1)序列設(shè)計(jì)VDAC基因引物，如表1所示。以1.5節(jié)中獲得的西花薊馬cDNA為模板為模板，PCR擴(kuò)增VDAC基因，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2節(jié)。將擴(kuò)增并純化的VDAC基因擴(kuò)增序列克隆到pEASY-T1載體上，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接到pGEX-4T-1(帶有GST標(biāo)簽蛋白)表達(dá)載體，獲得與GST融合的VDAC原核表達(dá)載體pGEX4T-1-VDAC。

利用Gateway技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pDEST17-NSs，設(shè)計(jì)引物如表1所示。以GW-TZSV-NSs-F/GW-TZSV-NSs-R為引物，以1.2節(jié)合成的感染了TZSV的本氏煙樣品cDNA為模板，PCR擴(kuò)增TZSV NSs基因并純化回收，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2節(jié)。根據(jù)TSWV NSs基因序列(GenBank登錄號: JF960235.1)，設(shè)計(jì)TSWV NSs引物，引物見表1。提取感染TSWV植株總RNA，以GW-TSWV-NSs-R為特異性引物，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(方法同1.2節(jié))，以GW-TSWV-NSs-F/GW-TSWV-NSs-R為引物，PCR擴(kuò)增TSWV NSs基因并純化回收， PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2節(jié)。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

將上述TSWV NSs和TZSV NSs基因的PCR回收產(chǎn)物分別與pDONR221混合進(jìn)行BP重組反應(yīng)，反應(yīng)體系: PCR產(chǎn)物1.5 μL, pDONR221質(zhì)粒0.5 μL, BP重組酶0.5 μL，充分混勻后離心，置于25℃金屬浴中反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別獲得來源于TZSV和TSWV的重組入門質(zhì)粒載體pDONR221-NSs，并與原核表達(dá)載體pDEST17(帶有His標(biāo)簽)進(jìn)行LR重組反應(yīng)，反應(yīng)體系: pDONR221-NSs質(zhì)粒0.5 μL, pDEST17質(zhì)粒0.5 μL, BP重組酶0.5 μL, ddH2O 1 μL, 充分混勻后離心， 置于25℃金屬浴中反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別獲得來源于TZSV和TSWV的重組質(zhì)粒pDEST17-NSs。重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確后，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，氨芐霉素培養(yǎng)基篩選，獲得pDEST17-NSs陽性菌落。

1.7 西花薊馬VDAC, TZSV NSs和TSWV NSs融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

pGEX-4T-1-VDAC和分別來源于TZSV和TSWV的pDEST17-NSs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，分別接種于100 mg/L Amp和50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。離心收集菌體，重懸于PBS，超聲破碎后離心，上清、沉淀及對照樣品(pGEX-4T-1空載體，僅表達(dá)GST蛋白)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.8 GST Pull-down技術(shù)驗(yàn)證NSs蛋白與VDAC蛋白的相互作用

向裝有谷胱甘肽瓊脂糖4B(glutathione sepharose 4B)的純化柱中加入蛋白結(jié)合緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 100 mmol/L NaCl)，平衡5個(gè)柱體積。加入1.7節(jié)原核表達(dá)的VDAC-GST大腸桿菌裂解液，以表達(dá)GST蛋白的菌裂解液作為對照。放置于4℃水平振蕩儀上充分振蕩2～4 h后，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗5～8次，棄掉非結(jié)合蛋白和雜蛋白。再將1.7節(jié)NSs-His大量誘導(dǎo)的菌裂解液(超聲破碎，離心過濾后)分別加入結(jié)合GST-VDAC蛋白和GST蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖4B懸浮液中。同時(shí)設(shè)TSWV的NSs為對照蛋白，同樣4℃水平振蕩儀上緩慢振蕩2～4 h。PBS沖洗5～8次，棄掉非結(jié)合蛋白，洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 10 mmol/L NaCl, 10 mmol/L還原性谷胱甘肽)洗脫純化柱，收集樣品，用于SDS-PAGE和Pull-down實(shí)驗(yàn)分析。用抗His抗體檢測VDAC-GST和NSs-His的互作情況。抗GST抗體檢測VDAC-GST和GST表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NSs

以TZSV侵染植株總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增TZSVNSs。如圖1所示，獲得1 380 bp的特異性片段，與預(yù)期TZSVNSs片段大小一致。擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建至pEASY-T1克隆載體，獲得pEASY-NSs，經(jīng)NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，得到3 928 bp的載體片段和1 380 bp的TZSVNSs片段，插入片段大小與目的基因大小一致(圖2: A)。通過NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切pEASY-NSs和pGBKT7，將TZSVNSs構(gòu)建至酵母表達(dá)載體pGBKT7上，雙酶切鑒定，得到7 300 bp左右的載體片段和1 380 bp的TZSVNSs片段(圖2: B)，測序結(jié)果分析無誤，表明成功構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pGBKT7-NSs。

圖1 PCR擴(kuò)增TZSV NSsFig. 1 PCR amplification product of TZSV NSs M: Trans2K Plus Ⅱ DNA marker; 1-4: PCR產(chǎn)物PCR products.

圖2 pEASY-NSs克隆質(zhì)粒(A)和pGBKT7-NSs重組質(zhì)粒(B)的雙酶切鑒定Fig. 2 Double enzyme digestion of the cloning plasmid pEASY-NSs (A) and the recombinant plasmid pGBKT7-NSs (B) M: Trans2K Plus Ⅱ DNA marker; 1: pEASY-NSs克隆質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物Restriction enzyme digestion product of the cloning plasmid pEASY-NSs; 2: pEASY-T1克隆質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物Restriction enzyme digestion product of the cloning plasmid pEASY-T1; 3: pGBKT7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物Restriction enzyme digestion product of the plasmid pGBKT7; 4, 5: pGBKT7-NSs重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物Restriction enzyme digestion product of the recombinant plasmid pGBKT7-NSs.

2.2 TZSV NSs蛋白對酵母AH109細(xì)胞毒性和自激活活性

比較轉(zhuǎn)化有誘餌載體pGBKT7-NSs及空載體pGBKT7的酵母AH109細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩組菌落均為白色或棕色，且大小、數(shù)量均勻一致(圖3)，表明NSs蛋白表達(dá)對酵母AH109細(xì)胞無毒性。比較分別轉(zhuǎn)化有pGBKT7-NSs/pGADT7-T，陽性載體pGBKT7-p53/pGADT7-T，以及陰性載體pGBKT7-Lam/pGADT7-T的酵母AH109細(xì)胞在SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade/X-α-Gal、SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上的生長情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化有pGBKT7-NSs/pGADT7-T的酵母AH109細(xì)胞僅在SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上生長(圖4: C)，而陽性質(zhì)粒都能夠在上述3種培養(yǎng)基上生長(圖4: A-C)，并在SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上顯現(xiàn)藍(lán)色(圖4: A)，表明NSs蛋白在AH109細(xì)胞內(nèi)無自激活活性。以上結(jié)果表明可用酵母雙雜交篩選與TZSV NSs蛋白互作的西花薊馬蛋白。

圖3 pGBKT7-NSs誘餌質(zhì)粒對AH109酵母細(xì)胞的毒性Fig. 3 Toxicity of the bait plasmid pGBKT7-NSs to AH109 yeast cellsA: pGBKT7-NSs在SD/-Trp培養(yǎng)基上的生長情況Colony growth of pGBKT7-NSs on the medium SD/-Trp; B: pGBKT7在SD/-Trp培養(yǎng)基上的生長情況Colony growth of pGBKT7 on the medium SD/-Trp.

圖4 pGBKT7-NSs誘餌質(zhì)粒對AH109酵母細(xì)胞的自激活Fig. 4 Autoactivation of the bait plasmid pGBKT7-NSs to AH109 yeast cellsA: SD/-His-Leu-Trp-Ade/X-α-Gal; B: SD/-His-Leu-Trp-Ade; C: SD/-Leu-Trp. +: 陽性對照Positive control pGBKT7-53/pGADT7-T; -: 陰性對照Negative control pGBKT7-Lam/pGADT7-T;A: pGBKT7-NSs/pGADT7-T.

2.3 酵母雙雜交篩選與TZSV NSs互作的西花薊馬蛋白

將西花薊馬cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NSs的AH109感受態(tài)細(xì)胞，觀察菌落生長及變藍(lán)情況(圖5)。挑取菌落生長狀況變藍(lán)的菌落，接種至加有氨芐青霉素的SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁并提取酵母質(zhì)粒，PCR鑒定cDNA插入片段的大小。將擴(kuò)增大于500 bp的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞，測序并進(jìn)行BLAST分析。 通過序列比對發(fā)現(xiàn)陽性克隆主要為VDAC(約1 000 bp)(GenBank登錄號: XM_026416489.1)和缺失突變5′端序列突變體VDAC-M基因(約600 bp)(圖6)。

圖5 西花薊馬cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-NSs的AH109酵母細(xì)胞的培養(yǎng)物Fig. 5 Culture of the transformation of cDNA library plasmid of Franiklinella ocicdentalis into AH109 yeast cells containing the bait plasmid pGBKT7-NSs

圖6 酵母雙雜交篩選西花薊馬cDNA文庫中陽性克隆質(zhì)粒的PCR鑒定Fig. 6 PCR identification of positive clones in cDNA library of Franiklinella ocicdentalis obtained by yeast two-hybrid screening VDAC: 類電壓依賴性陰離子通道Voltage-dependent anion-selective channel-like. VDAC-M: 缺失突變5′端序列的VDAC突變體The 5′terminal deletion mutant of VDAC. M: Trans2K Plus Ⅱ DNA marker; 1-5, 7, 9-11, 13-15: VDAC-M; 6, 8, 12: VDAC.

2.4 酵母細(xì)胞內(nèi)TZSV NSs與西花薊馬VDAC的相互作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TZSV NSs和西花薊馬蛋白VDAC的相互作用，本研究將pGBKT7-NSs和pGADT7-VDAC重新共轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板，發(fā)現(xiàn)pGBKT7-NSs/pGADT7-VDAC實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組的酵母生長情況較好(圖7: A, C)，其他對照組酵母沒有生長跡象(圖7: B, D-F)。這表明了西花薊馬VDAC蛋白和TZSV NSs在酵母中存在相互作用。

圖7 pGBKT7-NSs和pGADT7-VDAC共轉(zhuǎn)化AH109 酵母細(xì)胞的培養(yǎng)物Fig. 7 Culture of the cotransformation of pGBKT7-NSs and pGADT7-VDAC into AH109 yeast cellsA: 陽性對照Positive control (pGBKT7-p53/pGADT7-T); B: 陰性對照Negative control (pGBKT7-Lam/pGADT7-T); C: pGBKT7-NSs/pGADT7-VDAC; D: pGBKT7/pGADT7-VDAC; E: pGBKT7-NSs/pGADT7; F: pGBKT7/pGADT7. VDAC: 類電壓依賴性陰離子通道Voltage-dependent anion-selective channel-like.

2.5 GST Pull-down體外驗(yàn)證NSs與西花薊馬VDAC的相互作用

GST Pull-down結(jié)果顯示，在VDAC-GST和NSs-His共同沉淀組中檢測到條帶，與預(yù)計(jì)蛋白大小一致；而陰性對照組未檢測到條帶(圖8)，說明TZSV的NSs-His能夠與VDAC-GST在體外結(jié)合，而不能與陰性對照GST結(jié)合，同時(shí)證明VDAC-GST不能夠與陰性對照TSWV的NSs-His結(jié)合。 由此得出西花薊馬VDAC與TZSV的NSs存在體外特異性相互作用。

圖8 GST Pull-down驗(yàn)證TZSV NSs與西花薊馬VDAC的體外互作關(guān)系Fig. 8 Interaction in vitro between TZSV NSs and VDAC of Franiklinella ocicdentalis verified by GST Pull-down Pull-down: Pull-down蛋白Pull-down protein; Input: 大腸桿菌總蛋白Total protein from cell extracts of Escherichia coli. +: 互作Interactive; -: 非互作Non-interactive.

3 討論

本研究成功構(gòu)建了NSs蛋白的酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7-NSs，用酵母雙雜交系統(tǒng)從西花薊馬cDNA文庫中初步篩選到與NSs互作的介體蛋白類電壓依賴性陰離子通道(VDAC)。為了進(jìn)一步確定NSs和VDAC之間相互作用，本研究通過GST Pull-down技術(shù)對TZSV NSs與VDAC的相互作用進(jìn)行了體外驗(yàn)證。大腸桿菌內(nèi)IPTG誘導(dǎo)VDAC-GST和對照GST蛋白，并純化后捕獲NSs-His蛋白，洗脫后經(jīng)SDS-PAGE和Pull-down分析結(jié)果表明，TZSV NSs與VDAC蛋白在體外存在相互作用。VDAC是一種具有高度保守性的線粒體外膜孔狀蛋白，也是一種具有電壓依賴性和陰離子選擇性的嵌入蛋白，通常具有β-折疊構(gòu)成的跨膜結(jié)構(gòu)，由10個(gè)氨基酸組成，廣泛地存在于真核生物中(Schulz, 2000; Godboleetal., 2003)。VDAC位于線粒體的外膜，是線粒體代謝物進(jìn)出的屏障，控制線粒體與其他部分的交互作用，在線粒體膜上形成親水性通道，控制著線粒體內(nèi)物質(zhì)的進(jìn)出，維持線粒體的穩(wěn)態(tài)，VDAC的異常則會(huì)引起線粒體功能的紊亂(Bay and Court, 2002)。VDAC的表達(dá)水平升高或是降低均可使線粒體功能受到影響，在細(xì)胞生存中起著重要作用(Abu-Hamadetal., 2006; Shoshan-Barmatzetal., 2010)。例如，Vander-Heiden等(2000)在心衰動(dòng)物模型和心衰患者的心臟中均發(fā)現(xiàn)了心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)檢測到VDAC表達(dá)的下降。Sampson等(2001)研究發(fā)現(xiàn)，敲除了VDAC基因的雄性小鼠的精子細(xì)胞活力明顯下降。VDAC下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚，推測可能原因是VDAC的減少抑制線粒體功能，導(dǎo)致線粒體膜通透性發(fā)生改變，釋放蛋白如細(xì)胞色素C、Smac/Diablo、細(xì)胞凋亡因子等最終導(dǎo)致凋亡(Green and Kroemer, 2004)。

除了調(diào)節(jié)線粒體的代謝和能量功能外，VDAC似乎是各種細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡信號的匯聚點(diǎn)，這些信號由其與各種配體和蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)介導(dǎo)(戴瓊艷和段滿林, 2015)。例如，腦神經(jīng)藥物多巴胺可使神經(jīng)細(xì)胞線粒體VDAC的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平降低，ATP水平也降低，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生(Premkuar and Simantov, 2002)。因此推測，VDAC與TZSV NSs的互作關(guān)系成正相關(guān)關(guān)系，VDAC的下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。故VDAC與TZSV NSs互作機(jī)制有待進(jìn)一步研究，這不但有助于揭示TZSV NSs的分子作用機(jī)制，也能為研究VDAC的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。