阿孜古麗·阿力木江 買買提·依斯熱依力 王婧 艾克拜爾·艾力 陸萍克力木·阿不都熱依木

前 言

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux diseases，GERD）是一種臨床實踐中常見的慢性上消化道疾病，其發(fā)病率逐年增高［1］。導(dǎo)致GERD的因素較多，如老齡化、自身免疫、焦慮、抑郁及生活方式等均可引起該疾病，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。據(jù)報道，焦慮抑郁狀態(tài)及各種心理應(yīng)激均與GERD的發(fā)生密切相關(guān)［2］。研究結(jié)果表明，女性GERD患者異常的酸反流和食管運動功能障礙均與胃泌素和雌激素水平變化有關(guān)［3］。此外，氧化應(yīng)激和炎癥因子在GERD發(fā)生與發(fā)中的作用逐漸受到重視［4］。本研究通過建立心理應(yīng)激雌性小鼠模型，分析心理應(yīng)激對雌性小鼠胃泌素及雌激素水平的影響，探討其對氧化應(yīng)激和食管炎癥發(fā)生中的作用。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：20只8周齡，SPF級雌性昆明小鼠，購于新疆實驗動物研究中心［SCXK（新）2011‐0001］，飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動物中心。采用Microsoft office excel軟件隨機(jī)分心理應(yīng)激組和正常對照組，每組各10只。兩組小鼠單只飼養(yǎng)在自由進(jìn)食水的鼠籠內(nèi)，每日給予12h/12h晝夜循環(huán)，光照均始于8∶30，止于20∶30。

2.主要試劑與儀器：自制式束縛器和1‐14K型低溫高速離心機(jī)（美國Sigma公司生產(chǎn)）；Eclipse E200型光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司生產(chǎn)）；C1000型梯度PCR擴(kuò)增儀（美國Bio‐Rad公司生產(chǎn)）；PBS緩沖液粉末、檸檬酸及H&E染色相關(guān)試劑均購于北京中杉金橋公司；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司生產(chǎn)）；cDNA合成試劑盒（北京天根有限公司生產(chǎn)）；實時定量RT‐PCR試劑盒（日本TaKaRa公司生產(chǎn)）。

二、慢性束縛應(yīng)激動物模型的建立

束縛應(yīng)激施行時間均在每日上午10∶30～12∶30進(jìn)行，每日限制活動2 h，期間禁食禁水，后放回鼠籠內(nèi)自由活動，連續(xù)束縛應(yīng)激14 d［5］。10只心理應(yīng)激組小鼠置于用50 ml離心管所制的自制式束縛器中（離心管提前燙制出直徑約5 mm的通氣孔若干，分布于左右及上側(cè)管壁）。正常對照組小鼠自由飲水?dāng)z食，其余時間兩組小鼠處理相同。

三、取材與標(biāo)本處理

心理應(yīng)激第14天17∶00開始對各組小鼠禁食，于次日11∶00腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉，150毫克/千克進(jìn)行麻醉并取材。麻醉的小鼠以平臥位固定，從腹部正中至劍突取切口3 cm切口，下腔靜脈取血注入于1.5 ml EP管中，全段食管組織剪斷取材。

四、組織病理學(xué)處理及炎癥評價

兩組小鼠食管組織置于4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片行H&E染色，并觀察分析兩組食管組織形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行炎癥評價［6］。

五、酶聯(lián)免疫吸附法

實驗結(jié)束當(dāng)天取每組小鼠全血標(biāo)本，放入含有15 g/L乙二胺四乙酸的采血管內(nèi)，血液標(biāo)本在采集后的30 min內(nèi)于4℃、3000×g離心10 min，取上清，并置于?80℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清胃泌素、雌二醇等激素的含量以及NADPH 氧化酶‐4（NADPH oxidase，Nox‐4）、白介 素 ‐1β （Interleukin‐1β， IL‐1β）、 白 介 素 ‐6（Interleukin‐6，IL‐6）以及腫瘤壞死因子‐α（Tumor necrosis factor‐α，TNF‐α）等的含量。實驗過程及測量指標(biāo)濃度的計算嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

六、實時定量RT‐PCR

采用實時定量RT‐PCR方法檢測Nox‐4、IL‐1β、IL‐8及TNF‐α等指標(biāo)的mRNA的相對表達(dá)。取兩組每只小鼠食管組織40 mg，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用天根公司Fast Quant RT試劑盒合成第一鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成引物，各指標(biāo)及β‐肌動蛋白（actin）引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。實時定量RT‐PCR，反應(yīng)體系為 20 μl，按照 94 ℃ 3 min，95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，共40循環(huán)設(shè)置反應(yīng)條件。反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動得出熒光曲線及Ct值，采用2—△△Ct計算出目標(biāo)基因的相對表達(dá)倍數(shù)。

表1 實時定量RT‐PCR引物序列及產(chǎn)物長度

七、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS22.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料均以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、心理應(yīng)激對激素水平的影響

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實驗結(jié)果顯示，14d的束縛應(yīng)激后，小鼠血液中胃泌素（圖1A）和雌二醇（圖1B）激素水平顯著降低，較對照組比較，兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.265，5.622；P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠血清激素水平比較（每組n=10，aP＜0.05 vs正常組）

二、心理應(yīng)激對食管組織的影響

心理應(yīng)激組小食管粘膜層可見基底細(xì)胞增生，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤反應(yīng)和炎癥性改變，提示食管上皮受到外界因素?fù)p傷后的表現(xiàn)及增生修復(fù)反應(yīng)（圖2A）。心理應(yīng)激組小鼠食管粘膜炎癥細(xì)胞評分明顯高于對照組（圖2B），兩組比較的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.512，P＜0.05）。

圖2 兩組食管粘膜組織H&E染色

三、心理應(yīng)激引起氧化應(yīng)激水平上升

RT‐PCR和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實驗結(jié)果顯示，心理應(yīng)激組小鼠食管粘膜組織NADPH氧化酶‐4（NADPH oxidase，Nox‐4）的mRNA相對表達(dá)（圖3A）及其血液中（圖3B）的表達(dá)水平顯著上升，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.546，6.013；P＜0.05）。

圖3 兩組食管組織Nox‐4的表達(dá)水平比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

四、慢性束縛應(yīng)激引起炎癥因子表達(dá)上升

心理應(yīng)激組食管粘膜組織IL‐1β、IL‐6及TNF‐α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組（圖4），兩組比較的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.124，5.876，6.832；P＜0.05）。酶聯(lián)免疫吸附結(jié)果顯示，血液中心理應(yīng)激組炎癥因子IL‐1β、IL‐6、TNF‐α的釋放水平明顯上升（圖5），與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.317，4.681，8.105；P＜0.05）。

圖4 兩組食管組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平的比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

圖5 兩組血清炎癥因子水平比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

討 論

CERD的病理生理機(jī)制有多種因素參與，包括遺傳、環(huán)境、解剖、激素、神經(jīng)因素等，但其詳細(xì)機(jī)制目前尚不清楚。胃食管反流是一種生理現(xiàn)象，只有出現(xiàn)反流癥狀或并發(fā)癥時才稱作反流性疾?。?］。胃酸是食管黏膜的主要損傷因素。食管黏膜與酸接觸后，局部血流和組織內(nèi)胃泌素分泌異常，從而黏膜對酸的易感性增強(qiáng)。反復(fù)的酸刺激使黏膜發(fā)生炎癥，最終導(dǎo)致食管炎。食管內(nèi)酸化會影響吞咽頻率、食管黏膜完整性和食管原發(fā)性蠕動［8］。研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素與GERD的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，胃泌素分泌不足可以導(dǎo)致下食管括約肌（Lower esophageal sphincter，LES）功能不全，進(jìn)而增加GERD發(fā)病風(fēng)險。因此，若血清胃泌素水平較低，可以初步提示GERD，特別是內(nèi)鏡陽性的反流性食管炎［9］。但由于各研究納入的病例組不同，特別是NERD是否納入，血清對GERD診斷界限值和診斷效能參差不齊。

從食管的解剖學(xué)來看食管下段完全由平滑肌構(gòu)成，GERD患者的食管動力學(xué)改變特點與食管平滑肌的分布特點和平滑肌的收縮功能密切相關(guān)［10］。胃泌素是一種重要的胃腸激素，它主要由G細(xì)胞分泌，具有刺激胃酸分泌、促進(jìn)胃腸道細(xì)胞增殖和分化等生理功能。體內(nèi)胃泌素分泌水平主要受G細(xì)胞數(shù)量、胃內(nèi)pH值、刺激迷走神經(jīng)、胃竇牽拉、服用抑酸藥和促胃泌素激素藥物等諸多因素影響。胃泌素可以維持食管下括約肌壓力，防止胃食管反流。研究結(jié)果表明，胃泌素通過結(jié)合LES平滑肌上的CCK‐2受體，促進(jìn)LES的收縮，促進(jìn)食管平滑肌推進(jìn)性蠕動，從而防止酸反流［11］。胃泌素不全或水平降低是引起LES功能不全的重要因素。Suzuki等［12］發(fā)現(xiàn)，GERD患者血液中胃泌素水平及LES收縮能力顯著低于健康對照組。血清胃泌素低值是胃食管反流病的預(yù)測指標(biāo)其原理可以概括為兩點。其一，低胃泌素血癥是GERD發(fā)生機(jī)制之一。其二，GERD是一種酸相關(guān)性疾病，多數(shù)患者處于高胃酸狀態(tài)，基礎(chǔ)胃酸分泌量較高；由于胃酸的反饋性抑制作用，胃竇G細(xì)胞分泌胃泌素減少，血清胃泌素相應(yīng)降低。既然GERD是一種酸相關(guān)性、動力障礙性疾病，因此胃泌素與其發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，為臨床診斷提供一種可能。因此，胃泌素分泌異?？赡苁荊ERD發(fā)生的機(jī)制之一。此外，絕經(jīng)后老年婦女因卵巢萎縮，血清雌二醇含量減低，導(dǎo)致食管胃粘膜屏障功能削弱，粘液分泌減少，微循環(huán)障礙，對胃酸反流、膽汁酸和外源性刺激敏感性增強(qiáng)，進(jìn)而引起GERD的發(fā)生［13］。對老年女性GERD防治，除使用促動力劑、抑酸劑外加用雌激素補充療法可望改善癥狀，提高療效。Naik等［14］的研究結(jié)果表明，雌、孕激素對LES壓力具有松弛效應(yīng)，在妊娠期女性中可引起LES功能降低，而出現(xiàn)GERD相關(guān)癥狀的加重。

過量產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在GERD發(fā)生與發(fā)展中的作用逐漸受到重視。氧化應(yīng)激‐炎癥‐衰老，三者的形成機(jī)制互為因果關(guān)系；當(dāng)機(jī)體氧化、抗氧化能力出現(xiàn)紊亂時，可使炎癥反應(yīng)和促炎癥因子的大量釋放，最終導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)處在過度炎癥狀態(tài)［15］。炎性細(xì)胞因子在GERD發(fā)生中的作用逐漸成為學(xué)者們關(guān)注的焦點。氧化應(yīng)激是由活性氧過量生成或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損導(dǎo)致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，從而對機(jī)體造成損害的病理狀態(tài)［16］。既往研究顯示，心理應(yīng)激反應(yīng)是誘導(dǎo)活性氧過量產(chǎn)生的的重要機(jī)制，在GERD的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用［17‐19］。近年來，焦慮、抑郁等精神心理異常因素常發(fā)現(xiàn)與下丘腦‐垂體‐卵巢軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)，性激素（雌二醇、促黃體生成素）分泌異常、排卵功能障礙等有關(guān)［20‐21］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，心理應(yīng)激小鼠血液中胃泌素、雌二醇等激素水平更低；食管粘膜組織炎癥評分更高；氧化應(yīng)激和炎癥因子水平增高，這結(jié)果提示心理應(yīng)激誘導(dǎo)激素水平的異常分泌，促進(jìn)食管氧化應(yīng)激和炎癥損傷。

綜上所述，胃泌素以及雌二醇與GERD的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。心理應(yīng)激增加罹患GERD的風(fēng)險，會導(dǎo)致GERD癥狀的加重。本研究結(jié)果顯示，心理應(yīng)激誘導(dǎo)雌性小鼠胃泌素和雌二醇水平降低，促進(jìn)食管氧化應(yīng)激產(chǎn)生及其炎癥發(fā)生，可能是心理壓力相關(guān)GERD的發(fā)病機(jī)制之一，但其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。