裴懷弟，林玉紅，李 琦，李淑潔，張艷萍

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070）

蘭州百合（Lilium davidiivar.unicolor）是 百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）川百合的變種，為多年生鱗莖草本植物［1-3］，其鱗莖具有營養(yǎng)和滋補(bǔ)雙重功效，是甘肅省的地方特色農(nóng)產(chǎn)品，也是二陰山旱區(qū)農(nóng)民的支柱產(chǎn)業(yè)。目前，蘭州百合主要以無性繁殖為主，而長期的無性繁殖導(dǎo)致蘭州百合病毒病日趨嚴(yán)重，種性退化，品質(zhì)和產(chǎn)量下降等。解決這一問題目前最有效的方法就是繁育和推廣脫毒種球［4-5］。采用組織培養(yǎng)技術(shù)，建立穩(wěn)定的組培快繁體系，可有效提高種苗繁殖速度［6-7］，在獲得大量幼苗的同時(shí)，還有利于保持親本的優(yōu)良性狀［8］，是蘭州百合進(jìn)行品種改良的基礎(chǔ)。在組織培養(yǎng)中，添加植物生長調(diào)節(jié)劑是比較普遍的現(xiàn)象。植物生長調(diào)節(jié)劑是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵物質(zhì)，盡管用量很少，但在植物組織培養(yǎng)中起著重要和關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［9-11］。關(guān)于蘭州百合組織培養(yǎng)方面的研究已有很多報(bào)道［8，12-14］，大多數(shù)試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)不同濃度、不同激素的配比，以期歸納出最佳組合。然而正交設(shè)計(jì)只是不連續(xù)的點(diǎn)的優(yōu)化組合，響應(yīng)曲面法可以得到連續(xù)的函數(shù)關(guān)系，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)明顯。采用響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基中添加物濃度進(jìn)行合理配比［15］，明確各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，可獲得更優(yōu)、更簡(jiǎn)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。

響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件并且能研究各因素間交互作用的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，能夠精確地研究各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系［16-18］。該方法實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高［19-21］。Box-Behnken響應(yīng)面法作為一種能快速優(yōu)化工藝條件的方法已廣泛用于各領(lǐng)域［22-26］，但通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化蘭州百合組培芽增殖的研究尚未見報(bào)道。我們?cè)谔m州百合組培快繁體系研究中，著重在百合芽增殖環(huán)節(jié)通過減少生長調(diào)節(jié)劑用量和種類，采用響應(yīng)面優(yōu)化法，以最經(jīng)濟(jì)、最有效的方式對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行分析和研究［27］，以期在提高增殖系數(shù)的同時(shí)簡(jiǎn)化培養(yǎng)基配方，為蘭州百合提純復(fù)壯及脫毒種苗種球產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 外植體 選用外形飽滿、顏色潔白、健壯無病斑的3年生蘭州百合。將百合鱗莖剝?nèi)ネ鈱喻[片，取中內(nèi)層鱗片，自來水沖洗干凈，做好標(biāo)記，用濾紙吸干水分后置3～5℃低溫條件下預(yù)處理5～7 d，然后在超凈工作臺(tái)上用無菌水沖洗3～5遍。用75%乙醇消毒30～40 s，放入0.1%升汞溶液中消毒8～10 min，用無菌水沖洗5～6遍，置墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中晾干備用。

1.1.2 試劑 所用植物生長調(diào)節(jié)劑6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopu-rine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）均購自Sigma公司，MS培養(yǎng)基所用試劑藥品各成分均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) 取經(jīng)過消毒處理的蘭州百合鱗莖的中內(nèi)層鱗片于超凈工作臺(tái)上，切成0.3 cm×0.3 cm外植體接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。將鱗片上誘導(dǎo)長出的叢生芽，用解剖刀切取0.3 cm左右的單芽，接種到附加有不同濃度NAA、6-BA組合的芽增殖培養(yǎng)基（表1）中，每處理6瓶，每瓶接5株單芽，3次重復(fù)。增殖30～35 d后統(tǒng)計(jì)有效增殖芽數(shù)。

芽增殖系數(shù)=有效增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-expert11.0.4進(jìn)行中心組合試驗(yàn)（Central Composite Design，CCD）設(shè)計(jì)。根據(jù)CCD中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取中心組合試驗(yàn)因子和響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每處理6瓶，每瓶接5株單芽，3次重復(fù)。定期觀察統(tǒng)計(jì)增殖情況。

1.2.3 培養(yǎng)條件 于2017年3—8月在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有3%蔗糖和0.5%瓊脂的MS培養(yǎng)基，附加激素，pH為5.8～6.0。在2000～3000lx連續(xù)光照、溫度（25±2）℃條件下培養(yǎng)，光照時(shí)間14 h/d，所用設(shè)備為植物組培常用儀器設(shè)備。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPASS7.0軟件進(jìn)行，優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析用Design-expert11.0.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)中不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)蘭州百合芽增殖的影響

從蘭州百合試管苗芽增殖效果（表1）看，5號(hào)培養(yǎng)基（6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L）增殖系數(shù)達(dá)到最高，為3.47，與8號(hào)培養(yǎng)基（6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L） 增殖系數(shù)3.38差異不顯著；其余處理對(duì)百合增殖的效果均較5號(hào)培養(yǎng)基降低，差異達(dá)顯著水平（P＜0.01）。在添加有相同濃度NAA的培養(yǎng)基中，隨著6-BA濃度的增加，芽平均增殖系數(shù)呈現(xiàn)一個(gè)先增后降的趨勢(shì)，6-BA濃度為1.0、1.5 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)較大，說明適量的植物生長調(diào)節(jié)劑配比能顯著提高百合芽增殖系數(shù)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素誘導(dǎo)試驗(yàn)中，6-BA和NAA配合使用對(duì)蘭州百合芽增殖效果最好。根據(jù)CCD中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，采用6-BA和NAA 2因素5水平的響應(yīng)面法，以第5個(gè)配方濃度為中心參考值，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得各水平6-BA為0.19、0.50、1.25、2.00、2.31 mg/L；NAA 為 0.06、0.10、0.20、0.30、0.34 mg/L。

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 對(duì)6-BA濃度X1、NAA濃度X2做如下變換，xi=（Xi-X0）/X。式中，xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實(shí)值；X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值；X為自變量的變化步長。共計(jì)13個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，1～8是析因試驗(yàn)，9～13是中心試驗(yàn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表2。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Design-expert11.0.4回歸分析，以芽增殖系數(shù)（Y）為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得最終的回歸預(yù)測(cè)方程：

Y=-0.259 112＋4.577 90x1＋7.709 206 292 0 x2＋0.633 333x1x2-1.625 56x12－18.437 50x22

式中：Y為增殖系數(shù)；x1為6-BA濃度；x2為NAA濃度。從表3可以看出，回歸方程的失擬檢驗(yàn)差異不顯著（P=0.338 3＞0.05），表明實(shí)驗(yàn)誤差小并且方程式對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況較好?？偦貧w方程F檢驗(yàn)P＜0.000 1，差異達(dá)到極顯著。方程一次項(xiàng)的影響中，x1的P＜0.000 1，差異極顯著；x2的P=0.124 6＞0.01，差異不顯著；二次項(xiàng)x12的P＜0.000 1，差異極顯著，x22的P=0.024 1＜0.05，差異顯著；兩因素間的交互作用x1x2的P=0.592 8＞0.05，差異不顯著，校正決定系數(shù)R2=0.956 8，表明95.68%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用此模型解釋。由此看出，該回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況較好，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析表明，6-BA（x1）對(duì)蘭州百合芽增殖的影響最大，NAA（x2）影響不顯著。

表1 不同激素濃度對(duì)蘭州百合芽增殖的影響

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 響應(yīng)曲面和等高線圖可以解釋自變量之間的相互關(guān)系，還可以反映變量間的相互作用。響應(yīng)曲面圖形是特定的響應(yīng)值y所對(duì)應(yīng)的自變量構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖，從響應(yīng)面圖中可看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用關(guān)系。當(dāng)特征值為正值時(shí)響應(yīng)面分析圖為山丘形曲面，可以得到極大值；當(dāng)所有特征值為負(fù)值時(shí)，則為山谷曲面，有極小值存在；當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無極值存在［28］。而等高線形成的圖形顯示了兩因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱［27］。根據(jù)擬合方程，繪制出2個(gè)因素對(duì)蘭州百合芽增殖系數(shù)的響應(yīng)曲面（圖1）和等高線（圖2）。從圖1可以看出，6-BA和NAA存在極點(diǎn)值，6-BA對(duì)百合芽增殖系數(shù)的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；NAA對(duì)增殖系數(shù)的影響不顯著，表現(xiàn)為曲線比較平緩。因此，培養(yǎng)基中6-BA的濃度變化對(duì)蘭州百合芽增殖影響敏感，而NAA相對(duì)不敏感。由圖2可以看出，6-BA、NAA兩因素交互作用不顯著。

表3 回歸模型各項(xiàng)的方差分析

2.2.3 最佳配方驗(yàn)證 基于以上試驗(yàn)，回歸模型預(yù)測(cè)的蘭州百合芽增殖最佳培養(yǎng)基配方為6-BA濃度為1.25 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L。用所得最佳值進(jìn)行響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性驗(yàn)證試驗(yàn)，每次10瓶，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)有效芽增殖系數(shù)。實(shí)際得到的芽增殖系數(shù)為3.82，為理論預(yù)測(cè)值3.87的98.71%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合，證實(shí)了該模型的有效性?？梢?，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）優(yōu)化得到的蘭州百合芽增殖培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，蘭州百合有效芽增殖階段細(xì)胞分裂素6-BA不可缺少，而生長素NAA和分裂素6-BA的組合比例不宜過高，太高會(huì)影響芽的增殖系數(shù)，只有二者優(yōu)化組合，才能有效提高組培苗芽增殖系數(shù)。從前期單因素試驗(yàn)結(jié)果來看，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS中附加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L的增殖效果較好，這與從響應(yīng)面法優(yōu)化出的蘭州百合芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA（1.25 mg/L）＋I(xiàn)BA（0.2 mg/L）基本一致，優(yōu)化后的培養(yǎng)基增殖系數(shù)從之前單因素試驗(yàn)所得最高3.47提高到3.82。

蘭州百合人工栽培條件下種球繁殖速度較慢，繁殖系數(shù)低，組織培養(yǎng)技術(shù)是繁殖種苗種球的有效手段之一。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，可以在短時(shí)間內(nèi)大批量的培育出所需要的植物新個(gè)體，還可以防止植物病毒的危害，極大的提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率。尤其是通過組織培養(yǎng)手段獲得脫毒的原始材料以后，對(duì)進(jìn)行百合種球的培育和生產(chǎn)具有重要的意義。關(guān)于蘭州百合組培快繁技術(shù)的研究較多，同時(shí)添加的激素種類較多、激素濃度較高。龍春林等［29］的研究表明，蘭州百合增殖培養(yǎng)以MS+NAA0.2 mg/L＋6-BA 2.0 mg/L為宜，但其6-BA激素濃度較高，增加了成本，降低了產(chǎn)投比。另外，張紅巖等［30］采用 MS+6-BA 1.5 mg/L＋2，4-D 1.0 mg/L＋GA3 0.8 mg/L培養(yǎng)基，盡管出芽較多，但激素種類偏多，所用6-BA濃度比本試驗(yàn)優(yōu)化后的還高。本試驗(yàn)應(yīng)用的響應(yīng)面分析法與傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法相比，求得的各參數(shù)組合更加精確，同時(shí)用量更經(jīng)濟(jì)有效，可以大大降低生產(chǎn)過程中造成的原料浪費(fèi)［25］。

本研究主要從基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS中添加最適宜濃度的6-BA和NAA2個(gè)因素入手，采用響應(yīng)面法對(duì)蘭州百合芽增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期提高蘭州百合組培快速繁殖過程中增殖系數(shù)，同時(shí)篩選出最簡(jiǎn)化激素組合。在相同條件下，優(yōu)化后的培養(yǎng)基盡可能地減少了添加植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和降低了其用量，最終降低生產(chǎn)成本。