陳賽賽 鄭亞婷 郭容利

摘要：高滴度的抗原是制備優(yōu)質(zhì)疫苗的首要條件。對6株偽狂犬病病毒在倉鼠腎（baby hamster kidney，簡稱BHK）細(xì)胞和豬睪丸細(xì)胞（swine testicular，簡稱ST）細(xì)胞上的增殖效率進(jìn)行了比較，同時(shí)測定不同保存溫度和凍融條件對病毒滴度的影響。結(jié)果表明，幾株偽狂犬病病毒在BHK細(xì)胞和ST細(xì)胞上增殖效率均很高，可達(dá)到生產(chǎn)要求。相較于ST細(xì)胞，各毒株在BHK細(xì)胞上出現(xiàn)病變時(shí)間更早。然而，所有毒株在ST細(xì)胞上的病毒滴度都高于同期在BHK細(xì)胞上的滴度。強(qiáng)毒株AH02LA株在2種細(xì)胞上滴度可達(dá)108.0 TCID50/0.1 mL以上，表現(xiàn)為發(fā)生病變早，病毒增殖快，峰值到來早的特性。通過強(qiáng)毒株AH02LA株獲得的基因缺失株LA-A株和自然傳代缺失致弱株LA2017株峰值均達(dá)108.0 TCID50/0.1 mL，展現(xiàn)出優(yōu)良疫苗株的潛質(zhì)。保存條件試驗(yàn)表明，PRV在-70 ℃保存30 d和4 ℃保存12 d內(nèi)滴度相對穩(wěn)定，而-20 ℃保存的病毒滴度下降明顯。多次凍融后，滴度有所下降，相較于-70 ℃，-20 ℃條件下凍融病毒滴度下降更為顯著，建議避免多次凍融。本試驗(yàn)結(jié)果可為PRV疫苗抗原在實(shí)際生產(chǎn)中制備與保存提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：偽狂犬病病毒;豬睪丸細(xì)胞;倉鼠腎細(xì)胞;生長特性;凍融;保存

中圖分類號： S852.65+5 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0148-05

收稿日期：2020-04-23

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（18）3020];江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20181243）。

作者簡介：陳賽賽（1993—），男，山西長治人，研究實(shí)習(xí)員，主要從事豬偽狂犬病疫苗及其防控技術(shù)的研究。E-mail：1304652436@qq.com。

通信作者：王繼春，男，江蘇南京人，博士，研究員，主要從事活載體疫苗和基因工程疫苗研究。E-mail：jcwang@263.net。 ?偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，簡稱PRV）引起的以家畜發(fā)熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為主要特征的烈性傳染病，又稱Aujeszky病[1]。該病毒可感染不同日齡的豬，妊娠母豬感染后引起流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎或死胎，初生仔豬感染死亡率可達(dá)100%，成年豬一般為隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，但長期帶毒和排毒。在我國該病已涉及包括香港、臺灣在內(nèi)幾乎所有地區(qū)[2]。美洲和歐洲許多國家通過應(yīng)用基因缺失弱毒苗免疫，配合鑒別診斷等綜合防控措施，成功將該病從家養(yǎng)豬場根除[3]，我國許多豬場也應(yīng)用類似方法有效控制了該病。但自2011年以來，在我國一些Bartha株疫苗免疫的豬場又有該病的發(fā)生[4-6]，其特征為母豬產(chǎn)弱仔、死胎，流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀等臨床癥狀，且死亡率較高，其地域包括黑龍江省、吉林省、天津市、河北省、湖北省、四川省、江蘇省、廣東省等，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]，分析表明疫情由PRV變異株所引起。

疫苗接種是控制豬偽狂犬病最重要的措施，而免疫效果很大程度取決于抗原滴度。目前市場上所售的豬偽狂犬病疫苗在制備抗原時(shí)所用的細(xì)胞主要是雞胚成纖維細(xì)胞，倉鼠腎（baby hamster kidney，BHK）細(xì)胞和豬睪丸細(xì)胞（swine testicular，簡稱ST）細(xì)胞，后2種細(xì)胞便于利用微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)提高抗原滴度，是制備豬偽狂犬病疫苗的首選。

本試驗(yàn)將6株P(guān)RV在BHK和ST細(xì)胞上的增殖效率進(jìn)行了比較，并且對不同保存條件下PRV的滴度變化進(jìn)行了初步研究，以期為篩選疫苗候選株提供依據(jù)，同時(shí)為豬偽狂犬病疫苗生產(chǎn)工藝的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和主要試劑

病毒：Bartha K61株，購自西班牙海博萊生物大藥廠，產(chǎn)品批次為66HP[7];AH02LA株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離的PRV變異株[6]，保藏號碼為：CGMCC No.10891;B-gD & gCS株是以Bartha K61株為母本，將其gD和gC基因替換為流行變異株AH02LA株的gD和gC基因的重組病毒株[8];LA2017株是以AH02LA株為母本經(jīng)連續(xù)傳代獲得的致弱疫苗株，該毒株缺失了從gI基因第118位核苷酸至28K基因第251位核苷酸的共3 686堿基，包括gI部分基因、gE全部基因、11K全部基因和28K部分基因，保藏號碼為：CGMCC No.18170;LA1206株，是以AH02LA株為母本，人工缺失gE和TK基因，再經(jīng)連續(xù)傳代80代獲得的弱毒疫苗株，保藏號碼為：CGMCC No.14329[9];LA-A株，是以AH02LA株為母本，人工缺失gE而得，用作PRV基因缺失滅活疫苗的種毒[10]。

細(xì)胞：BHK細(xì)胞和ST細(xì)胞，由筆者所在單位細(xì)胞工程組提供。

主要試劑：新生牛血清（newborn bovine serum，簡稱NBS）和DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 病毒的培養(yǎng)與收獲

取PRV各毒株，按0.01感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，簡稱MOI）接種長滿單層的BHK或ST細(xì)胞，吸附1 h后，吸去病毒液，應(yīng)用無菌PBS液洗滌3次，加2% NBS的DMEM培養(yǎng)液37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)80%后，將上清與細(xì)胞混合物收集，在-70 ℃和37 ℃凍融，經(jīng)8 000 r/min離心，取上清分裝置-70 ℃保存。

1.3 病毒含量的測定

BHK和ST細(xì)胞傳至96孔板長滿單層，將PRV各毒株倍比稀釋至10-1～10-9，每一稀釋度接種8孔，每孔100 μL，對照組加100 μL細(xì)胞營養(yǎng)液，37 ℃ 孵育1 h后加入2% NBS的DMEM培養(yǎng)液100 μL，每日觀察細(xì)胞病變，觀察5 d，記錄細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)感染量（median tissue culture infectious dose，簡稱TCID50）。

1.4 病毒蝕斑形成特性

BHK和ST細(xì)胞傳至六孔板長滿單層，接種病毒稀釋液，每孔100 μL，含50～100 TCID50，對照組加100 μL細(xì)胞營養(yǎng)液，37 ℃孵育1 h后加入2% NBS的DMEM培養(yǎng)液100 μL，每隔3～5 h觀察細(xì)胞病變情況。

1.5 生長曲線測定

將PRV各病毒株分別以0.01 MOI接種長滿單層的6孔板上的BHK或ST細(xì)胞，37 ℃孵育1 h，吸去上清，PBS洗滌3次，添加含2% NBS的DMEM培養(yǎng)液，每孔2 mL，37 ℃培養(yǎng)，分別于接種后6、12、24、36、48、72 h測定培養(yǎng)物中病毒含量，統(tǒng)計(jì)所有時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度，繪制生長曲線。

1.6 不同溫度和多次凍融對病毒滴度的影響

將相同滴度的Bartha K61株和AH02LA株分別放置在37、4、-20、-70 ℃一段時(shí)間后，檢測其病毒的滴度，如“1.3”節(jié)所述。并且在-20 ℃和-70 ℃條件下，短時(shí)間內(nèi)（72 h完成7次凍融）反復(fù)凍融，檢測其病毒的滴度，如“1.3”節(jié)所述。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒含量

從表1可以看出，各毒株在ST和BHK細(xì)胞上適應(yīng)性良好，滴度達(dá)106.57 TCID50/0.1 mL以上，可滿足生產(chǎn)需要。

2.2 病毒蝕斑特性

6種PRV毒株在ST和BHK細(xì)胞上病變明顯。接種相同劑量的病毒，病變發(fā)生的進(jìn)度不完全一致，Bartha K61和B-gD & gCS在ST細(xì)胞上的病變時(shí)間明顯滯后于其他毒株，且病變形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞堆積，顆粒增多。AH02LA強(qiáng)毒株以及由AH02LA株衍生出來的LA2017株、LA1206株和LA-A株，在ST細(xì)胞上產(chǎn)生病變的形態(tài)基本一致，空斑明顯，出現(xiàn)多數(shù)大小不一的融合細(xì)胞，AH02LA強(qiáng)毒株病變進(jìn)展最快，大小空斑連成一片，融合細(xì)胞多且大。AH02LA強(qiáng)毒株在BHK細(xì)胞上也出現(xiàn)明顯的融合細(xì)胞，而其他毒株在BHK上的融合細(xì)胞不明顯，主要出現(xiàn)空斑和細(xì)胞變圓等現(xiàn)象（圖1）。相對于ST細(xì)胞，所有PRV在BHK細(xì)胞上出現(xiàn)病變的時(shí)間更早。

2.3 生長動力學(xué)測定

從圖2、圖3可以看出，各毒株滴度峰值出現(xiàn)在36～48 h之間。對于BHK細(xì)胞，大多數(shù)毒株的峰值出現(xiàn)在36 h。而在ST細(xì)胞上，除AH02LA毒株的峰值出現(xiàn)在36 h外，其余毒株的峰值都出現(xiàn)在48 h。Bartha K61株、基因缺失株LA-A以及由強(qiáng)毒株AH02LA自然傳代致弱的LA2017株其滴度峰值都能達(dá)到108.0 TCID50/0.1 mL，這十分有利于疫苗的研發(fā)。綜上所述，強(qiáng)毒株在2種細(xì)胞上增殖滴度均能達(dá)到108.0 TCID50/0.1 mL以上，表現(xiàn)為發(fā)生病變早，病毒增殖快，峰值到來早。各毒株在ST細(xì)胞上的滴度峰值均大于同期在BHK細(xì)胞上的值。

2.4 不同保存溫度對病毒滴度的影響

將相同滴度（106.0 TCID50/0.1 mL）的Bartha K61株和AH02LA株樣品分別放置在 37、4、-20、

-70 ℃，一段時(shí)間后檢測病毒滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒液在37 ℃保存3～12 d，其滴度下降趨勢十分明顯。-70 ℃保存30 d，滴度變化不大;4 ℃保存3～12 d，滴度基本無變化;而-20 ℃保存7 d，病毒滴度下降非常明顯（表2）。說明Bartha K61株和AH02LA株在 -70 ℃ 和4 ℃保存12 d內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5 多次凍融對病毒滴度的影響

將相同滴度的Bartha K61株和AH02LA株樣品分別放置在-20、-70 ℃， 短時(shí)間內(nèi)（72 h完成7次）反復(fù)凍融，檢測滴度變化。結(jié)果表明，Bartha K61株與AH02LA株-20、-70 ℃凍融多次后滴度有降低趨勢。-20 ℃凍融7次后滴度下降接近90%，-70 ℃ 條件下，3次凍融滴度下降較低。多次凍融后，效價(jià)有所下降，-20 ℃條件下凍融比 -70 ℃ 條件下凍融滴度下降趨勢明顯（表3）。

3 討論與結(jié)論

PRV可在多種細(xì)胞上增殖，如豬腎細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、ST細(xì)胞、BHK細(xì)胞、牛腎細(xì)胞和雞成纖維細(xì)胞[11-15]?；趯RV的敏感性和增殖效率

以及規(guī)模化生產(chǎn)等因素，通常選取BHK細(xì)胞與ST細(xì)胞作為最終的生產(chǎn)用細(xì)胞。本試驗(yàn)將6株P(guān)RV在BHK和ST細(xì)胞上的增殖效率進(jìn)行了比較。試驗(yàn)中所有毒株均能在BHK和ST細(xì)胞上產(chǎn)生明顯病變，強(qiáng)弱毒株病變的形態(tài)存在明顯差異，強(qiáng)毒株表現(xiàn)出巨融合細(xì)胞的出現(xiàn)以及病變時(shí)間超前等特性，本結(jié)論與程曉霞等報(bào)道的結(jié)果[13]一致。觀察體外生長特性發(fā)現(xiàn)病毒增殖的整個(gè)過程經(jīng)歷增殖期和高峰期，而后出現(xiàn)下滑期。對于BHK細(xì)胞，多數(shù)毒株的峰值出現(xiàn)在36 h，而在ST細(xì)胞上峰值出現(xiàn)在48 h（強(qiáng)毒株AH02LA除外），說明PRV在BHK細(xì)胞上增殖速度較快。此外，研究發(fā)現(xiàn)基因缺失株 LA-A 株、由強(qiáng)毒株AH02LA自然傳代致弱的LA2017株和經(jīng)典的弱毒株Bartha K61株在BHK和ST細(xì)胞上的滴度峰值都能達(dá)到108.0 TCID50/0.1 mL以上，這十分有利于PRV疫苗抗原的制備。在實(shí)際的生產(chǎn)中，ST細(xì)胞可用于活疫苗與滅活疫苗的生產(chǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)PRV在BHK細(xì)胞上出現(xiàn)病變的時(shí)間較早，病毒含量較高，在節(jié)省時(shí)間的同時(shí)，又能獲得較高的抗原濃度，因此，BHK細(xì)胞也可作為PRV增殖的理想細(xì)胞，考慮到其致瘤性的隱患，一般用于滅活疫苗抗原的制備。

此外，在PRV抗原實(shí)際的生產(chǎn)中，在抗原收獲后需要進(jìn)行短時(shí)間保存，并且需要凍融離心去除細(xì)胞碎片，因此，本試驗(yàn)研究了抗原在-70、-20、4、37 ℃ 溫度條件下短期保存對病毒滴度的影響。結(jié)果表明，病毒不宜-20 ℃保存，-70 ℃是理想的保存溫度，但是實(shí)際生產(chǎn)中抗原產(chǎn)量較大，-70 ℃保存需要消耗大量能源，因此可選擇4 ℃短期保存（不超過12 d）。病毒凍融試驗(yàn)結(jié)果顯示，PRV抗原-20、-70 ℃條件下凍融多次后滴度均有所下降，為維持抗原穩(wěn)定，應(yīng)避免多次凍融，必要時(shí)可選擇-70 ℃條件下凍融3次以內(nèi)。

綜上所述，本研究從實(shí)際生產(chǎn)出發(fā)，開展的PRV生長特性以及不同保存溫度和反復(fù)凍融對病毒滴度的影響，其目的是提高抗原滴度，保護(hù)抗原活力，為疫苗的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

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