張翠翠 趙勝 王越， 張鵬， 常玉曉

（1. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120）

基因組Fosmid文庫(kù)技術(shù)自1992年被創(chuàng)建之后，即廣泛地應(yīng)用于基因組學(xué)研究當(dāng)中［1-12］。1996年，Preston等［13］利用Fosmid文庫(kù)識(shí)別并鑒定了寄生在海綿中的一種嗜冷泉古菌（Cenarchaeum symbiosum）。1997年，F(xiàn)itz-Gibbon等［14］利用Fosmid文庫(kù)構(gòu)建了一種超嗜熱古細(xì)菌（Pyrobaculum aerophilum）的物理圖譜，并預(yù)測(cè)了其基因組含474個(gè)基因。1998年，Deckert等［15］用“鳥槍”測(cè)序法破解超嗜熱菌（Aquifex aeolicus）的基因組時(shí)，借助Fosmid文庫(kù)來(lái)填補(bǔ)重疊群之間的空缺。1999年，Cui等［16］構(gòu)建兩個(gè)自交不親和油菜株系的Fosmid文庫(kù)，通過(guò)對(duì)文庫(kù)中的部分克隆測(cè)序，對(duì)控制蕓苔屬植物的自交不親和性的S位點(diǎn)區(qū)間進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄分析。2004年，國(guó)際人類基因組測(cè)序聯(lián)合會(huì)公布的已完成測(cè)序的人類基因組有341個(gè)空缺，包括位于常染色質(zhì)區(qū)域的250個(gè)空缺，Bovee等［17］利用Fosmid文庫(kù)將常染色質(zhì)區(qū)域的26個(gè)空缺補(bǔ)全，67個(gè)空缺平均每個(gè)都填補(bǔ)約32 kb。

新一代測(cè)序技術(shù)，尤其是讀長(zhǎng)可達(dá)20 kb甚至40 kb以上的單分子測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，使Fosmid文庫(kù)的應(yīng)用日漸式微。但是，F(xiàn)osmid文庫(kù)在當(dāng)前的基因組學(xué)研究中仍然具有其獨(dú)特的價(jià)值。第一，與細(xì)菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）文庫(kù)類似，F(xiàn)osmid文庫(kù)可以用于基因圖位克隆過(guò)程中目標(biāo)區(qū)域序列的精確測(cè)序。目前，雖然有很多物種都已經(jīng)有了參考基因組序列，但同一物種不同品種之間的基因組序列通常存在很大差異［18］。這導(dǎo)致在圖位克隆基因的過(guò)程中，將基因精細(xì)定位后，有時(shí)難以根據(jù)參考基因組序列獲得目標(biāo)區(qū)段的準(zhǔn)確序列。此時(shí)，需要構(gòu)建BAC或Fosmid文庫(kù)，并從中篩選位于目標(biāo)區(qū)域的克隆進(jìn)行測(cè)序，從而獲得候選基因的準(zhǔn)確序列。例如，2016年，Zhao等［19］在通過(guò)圖位克隆法鑒定水稻褐飛虱抗性基因BPH9時(shí)，利用Fosmid文庫(kù)確定了抗性親本Pokkali定位區(qū)間的68 kb DNA序列，從而確認(rèn)了候選基因并獲得其準(zhǔn)確序列，這樣的例子還有很多，如小麥條銹病抗性基因Yr28的克隆等［20］。第二，雖然測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得了相當(dāng)大的發(fā)展，但在全基因組測(cè)序的過(guò)程中，仍然經(jīng)常使用Fosmid文庫(kù)輔助組裝或者驗(yàn)證基因組組裝的準(zhǔn)確度。例如，2014年，松樹和甜菜的基因組組裝研究者都借助了Fosmid文庫(kù)［21-22］。2017年，在水稻蜀恢498基因組的組裝過(guò)程中，研究者利用來(lái)自564個(gè)Fosmid混合池（池容量為1 000-1 500個(gè)單克?。┑暮?jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，將來(lái)自于全基因組的PacBio reads互相區(qū)分并分別組裝，用于降低基因組組裝的復(fù)雜度，開創(chuàng)了Fosmid文庫(kù)在基因組組裝中的應(yīng)用新方向［18］。此外，F(xiàn)osmid文庫(kù)還被用于人類基因組的單倍型組裝［23］。2019年，在糜子的全基因組測(cè)序中，研究者利用Fosmid文庫(kù)單克隆測(cè)序驗(yàn)證基因組組裝的準(zhǔn)確度［24］。第三，在宏基因組學(xué)的研究中，F(xiàn)osmid文庫(kù)也可以被用來(lái)保存環(huán)境樣本中所包含的全部微生物的基因組DNA，并用于后續(xù)的基因功能分析［25-26］。

Fosmid載體由cosmid載體發(fā)展而來(lái)，最初是Kim等［27］將帶有大腸桿菌致育（Fertility，F(xiàn)）因子的pBAC載體與Cosmid載體pUCcos融合后構(gòu)建成pFOS1載體。Cosmid載體是一種最老的高容量載體，可插入28-45 kb的外源DNA；應(yīng)用Cosmid載體構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí)，選擇28-45 kb的DNA片段與載體連接，可保證包裝后的DNA高效進(jìn)入λ噬菌體頭部，從而提高建庫(kù)效率［28］。在連接過(guò)程中，樣品的DNA小片段之間可能相互連接，之后再與載體連接，從而產(chǎn)生包含來(lái)自兩個(gè)或兩個(gè)以上不相鄰基因組區(qū)段的嵌合克?。?8］。另外，由于大腸桿菌攜帶的重組子拷貝數(shù)很高，黏粒中克隆的DNA會(huì)發(fā)生重排［28］。Kim等［27］將F因子引入Cosmid載體構(gòu)成Fosmid載體，保證了構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA在每個(gè)細(xì)胞中只有1-2個(gè)分子，從而極大降低了克隆中外源DNA的重排水平。若要減少Fosmid文庫(kù)中嵌合克隆的數(shù)量，可在建庫(kù)時(shí)盡量降低連接反應(yīng)中小片段DNA的含量。因此，對(duì)外源DNA片段大小進(jìn)行準(zhǔn)確地篩選，可排除小片段DNA從而減少嵌合克?。煌瑫r(shí)，排除超過(guò)45 kb的大片段DNA，可以提高文庫(kù)的制備效率。在Fosmid文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（Epicentre，美國(guó)）的使用說(shuō)明中，建議外源DNA片段大小為40 kb左右。但是，從瓊脂糖凝膠中回收、純化長(zhǎng)度超過(guò)20 kb的DNA片段是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)難點(diǎn)，且長(zhǎng)度越長(zhǎng)，回收效率越低。因此，準(zhǔn)確、高效的回收40 kb的DNA片段是Fosmid文庫(kù)構(gòu)建的一個(gè)重要且難度較高的步驟。

當(dāng)前，雖然有多種方法可以用于分離40 kb范圍內(nèi)的DNA片段，包括磁珠、硅膠膜（Silica membrane）或硅膠顆粒（Silica particles）以及密度梯度離心，但是它們的回收效率都較低。綜合比較不同方法，傳統(tǒng)的切膠并電洗脫至透析袋，仍然是回收40 kb DNA的最好方法［28］。2015年，Sage Science公司開發(fā)出了SageELF儀器，將傳統(tǒng)的切膠并利用透析袋回收DNA的過(guò)程自動(dòng)化，不僅簡(jiǎn)化了利用透析袋回收DNA的操作流程，也提高了DNA的回收效率。目前，在新一代測(cè)序領(lǐng)域，Sage ELF已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于不同長(zhǎng)度的DNA片段回收［29］，如100 bp的miRNA文庫(kù)、400 bp左右的Truseq文庫(kù)、10 kb左右的Mate pair文庫(kù)和1-5 kb的PacBio iso-Seq文庫(kù)。但是，Sage ELF儀器中并未設(shè)置回收40 kb的方法。

本研究利用SageELF提供的0.75%瓊脂糖膠盒，嘗試將其內(nèi)置的回收10 kb DNA的程序，改造成回收40 kb DNA的程序。我們對(duì)這一方法進(jìn)行了測(cè)試，并成功建立了高效的40 kb DNA回收方法；同時(shí)，利用改良的方法回收到的DNA樣品構(gòu)建了Fosmid文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)中插入的外源DNA片段大小進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示:高效、準(zhǔn)確的40 kb DNA回收方法大大降低了Fosmid文庫(kù)構(gòu)建的難度。綜上所述，本研究對(duì)Fosmid文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，樣品DNA片段的制備方法進(jìn)行改良，旨在為科學(xué)構(gòu)建Fosmid文庫(kù)提供改進(jìn)方向和實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為生物的基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Fosmid載體質(zhì)粒pFosill-2（Genbank登錄號(hào)JX069762）［30］，由美國(guó) Broad 研究所 Andreas Gnirke博士惠贈(zèng)；所用秈型水稻品種是華占。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 水稻華占基因組DNA，用 CTAB 法提?。?1］。

1.2.2 基因組DNA的定量與打斷 利用Qubit 3.0熒光計(jì)（Invitrogen，美國(guó)）測(cè)定水稻基因組DNA濃度，用無(wú)菌雙蒸水將濃度調(diào)至200 ng/μL；吸取40 μL DNA溶液加入到g-TUBE（Covaris，美國(guó)）中，5 000 r/min離心3 min后，將g-TUBE倒轉(zhuǎn)放入離心機(jī)，5 000 r/min離心3 min，上述步驟重復(fù)5次后，吸出打斷后的DNA樣品于新離心管中備用。重復(fù)上述步驟，直至得到足夠量的打斷DNA，然后利用脈沖電泳檢測(cè)打斷DNA的片段分布，確保主要片段集中在40 kb左右。

1.2.3 基因組DNA片段的分選與回收 打斷后的DNA加入Loading buffer備用，使用全自動(dòng)核酸/蛋白質(zhì)回收儀SageELF（Sage science，美國(guó)）進(jìn)行DNA片段的分選與回收。選用0.75%瓊脂糖膠盒（Agarose Gel cassette，Sage science，美國(guó)），根據(jù)操作說(shuō)明進(jìn)行并有改動(dòng)。主要步驟如下:排除膠盒氣泡并清洗膠盒上的回收孔，然后將膠盒置于儀器上的盒槽中并設(shè)置恰當(dāng)?shù)木彌_液水平。電流測(cè)試通過(guò)后，在膠盒的點(diǎn)樣孔中加入準(zhǔn)備好的DNA樣品，注意上樣量不超過(guò)60 μL，選用“時(shí)間”模式，電泳10 h，為了避免長(zhǎng)時(shí)間電泳過(guò)程中電泳液的蒸發(fā)，每隔3 h暫停一次，補(bǔ)水約3-5 mL并混勻。電泳結(jié)束后，收集每個(gè)回收孔中的DNA于一新離心管中，用Qubit 3.0測(cè)定每孔回收到的DNA濃度，回收的DNA可短期保存于4℃。

1.2.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulse-Field Gel Electrophoresis，PFGE）檢測(cè)DNA片段大小 利用SeaKem?Gold Agarose（Lonza，德國(guó)）及0.5×TBE電泳緩沖液制備1%的瓊脂糖凝膠，使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀（Rotaphor 6.0，Analytik Jena，德國(guó)）檢測(cè)DNA片段大小，操作按照儀器說(shuō)明書進(jìn)行，電泳條件如下:電壓180 V，脈沖夾角120°，間隔時(shí)間60 s，溫度13℃，電泳時(shí)間24 h。電泳結(jié)束后，將膠塊放入GelRed（Vazyme，南京）溶液中染色約30 min，蒸餾水脫色約10 min，然后用凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc XR+，BioRad，美國(guó)）拍攝圖像。

1.2.5 Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建 首先，對(duì)載體質(zhì)粒pFosill-2線性化與去磷酸化:取200 μg pFosill-2 DNA，使用 Plasmid-SafeTMATP-Dependent Dnase（Epicentre，美國(guó)）進(jìn)行消化以去除載體質(zhì)粒提取過(guò)程中發(fā)生斷裂的DNA，使用0.8×磁珠（VAHTS DNA Clean Beads，Vazyme，南京）純化出環(huán)狀載體質(zhì)粒DNA后，利用AatII（Fermentas，美國(guó)）及Eco72I（Fermentas，美國(guó)）對(duì)其雙酶切以獲得兩端的載體臂，0.8×磁珠純化酶切產(chǎn)物，接著使用Calf Intestinal Alkaline Phosphatase（NEB，英國(guó)）進(jìn)行去磷酸化，最后用酚/氯仿抽提兩次純化載體臂。

接著，利用KAPA Library Preparation Kit（KAPA biosystems，美國(guó)）對(duì)基因組DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，0.8×磁珠純化補(bǔ)平產(chǎn)物后，利用KAPA T4 DNA Ligase（KAPA biosystems，美國(guó)）連接載體臂與基因組DNA片段，室溫連接1 h后，70℃處理10 min終止反應(yīng)。然后，使用MaxPlaxTMLambda 噬菌體包裝提取物（Epicentre，美國(guó)）對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行體外包裝，包裝產(chǎn)物侵染大腸桿菌菌株DH10T，然后將侵染反應(yīng)液涂布于含12.5 μg/mL氯霉素的固體LB培養(yǎng)基表面，置于37℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)過(guò)夜。同時(shí)，將包裝產(chǎn)物分別稀釋10倍、100倍、1 000倍3個(gè)梯度侵染DH10T后培養(yǎng)，用于文庫(kù)滴度檢測(cè)。

1.2.6 文庫(kù)重組克隆的分析 從上一步的培養(yǎng)皿中，隨機(jī)挑選10個(gè)單克隆，分別接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基（包含34 μg/mL氯霉素）搖培過(guò)夜，使用堿裂解法提取重組質(zhì)粒后，酶切質(zhì)粒DNA檢測(cè)陽(yáng)性率。隨后，又隨機(jī)挑選25個(gè)單克隆，分別接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基搖培約15 h后，分成兩份:一份送蘇州金唯智生物科技有限公司或者生工生物工程（上海）股份有限公司，利用pFosill-2載體插入位點(diǎn)兩側(cè)的T7和SP6啟動(dòng)子位點(diǎn)對(duì)每個(gè)重組質(zhì)粒的兩端進(jìn)行Sanger測(cè)序，獲得的序列與蜀恢498的基因組序列（http://www.mbkbase.org/）進(jìn)行Blast分析，從而獲知插入片段的大??；另一份進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒，每個(gè)重組質(zhì)粒取1 μg使用NotI（Thermo Fisher，美國(guó)）37℃酶切3 h，隨后PFGE檢測(cè)（電壓130 V，脈沖夾角120°，間隔時(shí)間4 s，溫度10℃，電泳時(shí)間18 h）載體帶以及外源基因組DNA片段的酶切帶型。最后，根據(jù)末端測(cè)序的結(jié)果下載蜀恢498的基因組序列，利用CodonCode Aligner軟件（CodonCode Corporation，美國(guó)）進(jìn)行電子酶切模擬，得到虛擬酶切圖，與PFGE電泳圖進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 改進(jìn)的Sage ELF操作流程可準(zhǔn)確、高效地回收40 kb左右的DNA片段

為回收40 kb的DNA片段，將提取的基因組DNA經(jīng)g-TUBE打斷后，取20 μg利用SageELF儀器進(jìn)行DNA片段的分選與回收。每個(gè)回收孔的DNA，均取50-100 ng進(jìn)行PFGE電泳檢測(cè)。通過(guò)測(cè)試不同的SageELF電泳時(shí)間發(fā)現(xiàn)，10 h的電泳可以有效地將10-50 kb的基因組DNA分開，此時(shí)，40 kb左右的DNA片段位于膠盒的第1-3孔，雖然這3個(gè)孔的DNA呈彌散分布，但仍可看出主帶在40 kb附近，甚至有少量DNA片段稍大于48.5 kb（圖1），這部分DNA可用來(lái)構(gòu)建Fosmid文庫(kù)。此后的回收孔中，DNA片段大小依次降低且沒(méi)有呈彌散分布，第4孔的DNA主帶大小約30 kb，到最后一孔即第13孔，DNA主帶大小在12 kb-15 kb之間（圖1）。

利用Qubit 3.0測(cè)定每個(gè)孔回收到的DNA濃度發(fā)現(xiàn)，第1孔至第13孔依次回收得到275 ng、2 266 ng、4 576 ng、1 452ng、831 ng、649 ng、466 ng、451 ng、329 ng、311 ng、119 ng、243 ng DNA。打斷的DNA片段大小峰值在40 kb。因此，回收量最高的DNA片段也集中在40 kb附近，這與預(yù)期的結(jié)果一致。以上DNA長(zhǎng)度和濃度檢測(cè)說(shuō)明，利用改進(jìn)的SageELF的電泳回收程序，可以高效地回收長(zhǎng)度達(dá)40 kb的DNA片段，且操作流程簡(jiǎn)單易掌握。高濃度40 kb DNA片段的獲得為Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.2 Fosmid文庫(kù)滴度及重組質(zhì)粒的插入片段大小分析

為檢測(cè)文庫(kù)容量以及覆蓋率，包裝產(chǎn)物用Phage Dilution Buffer稀釋10倍、100倍、1 000倍3個(gè)梯度，混勻后分別取20 μL加入200 μL的大腸桿菌DH10T細(xì)胞中，37℃孵育30 min后涂氯霉素平板，倒置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。稀釋100倍的平板上，平均每個(gè)平板長(zhǎng)出12個(gè)單克隆，那么文庫(kù)的總滴度約為12×100×1 000 / 20 = 6×104CFU/mL。

由于28-45 kb的外源DNA片段包裝后可高效進(jìn)入λ噬菌體頭部，本研究將第1至3孔的DNA混合，按照Williams等［30］的方法成功地構(gòu)建了Fosmid文庫(kù)。為了初步檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，隨機(jī)挑選文庫(kù)的10個(gè)單克隆，提取少量質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶AatII和Eco72I作雙酶切后進(jìn)行PFGE分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)質(zhì)粒均有外源DNA插入，文庫(kù)陽(yáng)性率為100%。但是，質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物條帶過(guò)多，難以推測(cè)準(zhǔn)確的外源DNA長(zhǎng)度（數(shù)據(jù)未展示）。為了檢測(cè)文庫(kù)中外源DNA片段的準(zhǔn)確大小，我們又隨機(jī)挑選了25個(gè)單克隆進(jìn)行雙末端Sanger測(cè)序并成功獲得了24個(gè)克隆的雙末端序列，這些序列與蜀恢498的基因組序列［18］比對(duì)結(jié)果如表1所示，插入的外源DNA片段大小在23 kb-52 kb之間，每個(gè)克隆的平均插入片段大小約為37.9 kb，標(biāo)準(zhǔn)差為5.2 kb，片段大小比較集中。

圖1 Sage ELF回收的DNA片段的PFGE分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)測(cè)序克隆中插入的外源DNA片段大小，對(duì)表1中的25個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，用NotI酶切（可以切出完整的載體片段）后，進(jìn)行PFGE檢測(cè)。如圖2-A所示，酶切后的每個(gè)質(zhì)粒都包含一條約7 kb的載體帶（箭頭所指）。為了便于分析外源DNA片段的酶切帶型，我們根據(jù)表1中蜀恢498的基因組位置信息，將對(duì)應(yīng)的DNA序列提取出來(lái)，然后分析其中的NotI識(shí)別位點(diǎn)的位置和數(shù)量，最后根據(jù)此結(jié)果預(yù)測(cè)外源片段的酶切帶型（圖2-B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除6號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、14號(hào)和20號(hào)克隆外，其他18個(gè)克隆的酶切帶型都與預(yù)測(cè)的帶型一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了外源DNA片段的大小。

3 討論

Fosmid文庫(kù)在基因克隆、物理圖譜構(gòu)建及基因組測(cè)序等工作中被廣泛應(yīng)用［1-12］。最近幾年，F(xiàn)osmid文庫(kù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，如在人類單倍型測(cè)序［23，30］、輔助基因組de novo組裝［18］及宏基因組學(xué)研究［25-26］等方面，發(fā)揮了其獨(dú)特的作用，使Fosmid文庫(kù)在基因組學(xué)研究中的地位更加重要。但常規(guī)的Fosmid文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程，尤其是40 kb DNA片段的回收，操作難度很大，限制了Fosmid文庫(kù)構(gòu)建的成功率，因此改良Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建方法很有必要。

表1 測(cè)序克隆中插入的外源DNA位置信息

圖2 重組質(zhì)粒的Not I酶切分析

自Kim等［27］于1992年創(chuàng)建第一個(gè)Fosmid文庫(kù)以來(lái)，構(gòu)建Fosmid文庫(kù)的方法就一直被改進(jìn)。但目前看來(lái)，改進(jìn)Fosmid載體的情況較多，外源基因組DNA片段的分選和回收方法，還是依賴傳統(tǒng)的切膠并用透析袋回收或者密度梯度離心回收。切膠回收DNA，需經(jīng)過(guò)PFGE、切膠、透析袋回收3步，流程比較麻煩；而密度梯度離心回收DNA，需經(jīng)過(guò)超速離心、穿刺取樣、透析純化等步驟，流程更加繁瑣。這兩種方法，實(shí)驗(yàn)操作難度很大，技巧性也高，研究者往往難以快速掌握，且這些方法的DNA回收率也很低。利用我們改進(jìn)的方法，只需將打斷后的基因組DNA加到SageELF膠盒點(diǎn)樣孔中，中間步驟完全由機(jī)器操作，最后從膠盒回收孔中吸取不同區(qū)段的DNA即可直接進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)操作，流程簡(jiǎn)單、便捷。

全自動(dòng)核酸/蛋白質(zhì)回收系統(tǒng)SageELF是Sage Science公司2015年推出的儀器，將傳統(tǒng)的切膠并利用透析袋回收DNA的過(guò)程自動(dòng)化，不僅簡(jiǎn)化了利用透析袋回收DNA的操作流程，也提高了DNA的回收效率。目前，SageELF被廣泛應(yīng)用于新一代測(cè)序領(lǐng)域中，小至100 bp、大至20 kb左右的不同長(zhǎng)度的DNA片段回收［29］。但是，SageELF儀器的中沒(méi)有設(shè)置回收40 kb的方法，顯然，F(xiàn)osmid文庫(kù)的構(gòu)建，不是廠家考慮到的應(yīng)用。與常規(guī)的Biorad的箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)系統(tǒng)（CHEF）不同，SageELF使用的是橫向交變電泳（TAFE），其電泳液的體積只有大約20 mL，如果用于40 kb片段的分離，需要長(zhǎng)時(shí)間、高電流電泳。但是，在如此小的體積中長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行高電流電泳，極易導(dǎo)致電泳液溫度過(guò)高和蒸發(fā)，因此，我們做了一系列的電流、脈沖時(shí)間的測(cè)試，并調(diào)整了儀器相應(yīng)的運(yùn)行監(jiān)控參數(shù)，最終成功的從20 μg的input DNA中回收到約8 μg的40 kb左右的DNA。而實(shí)際上，使用Epicentre和Lucigen等公司的試劑盒，只需要100 ng-1 μg的40 kb DNA用于Fosmid文庫(kù)構(gòu)建。因此，我們建立的方法，可以很容易地回收到足夠的40 kb DNA片段，大大降低了Fosmid文庫(kù)構(gòu)建的難度。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)改進(jìn)全自動(dòng)核酸/蛋白質(zhì)回收系統(tǒng)SageELF的操作流程，實(shí)現(xiàn)了40 kb DNA片段的高效回收。利用我們改良的SageELF法回收40 kb左右的基因組DNA大片段，操作便捷，回收率高，片段大小精準(zhǔn)，且文庫(kù)插入片段集中，顯著提高了Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建質(zhì)量。