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        細(xì)胞特異性核酸適配體的篩選及評(píng)價(jià)策略

        2020-08-04 03:02:30余韓潔鈺朱麗葉陳旭賀曉云許文濤
        生物技術(shù)通報(bào) 2020年7期
        關(guān)鍵詞:文庫(kù)親和力靶標(biāo)

        余韓潔鈺 朱麗葉 陳旭 賀曉云 許文濤

        (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

        生命科學(xué)的許多應(yīng)用研究,如分子診斷和治療等,都需要基于不同細(xì)胞的特性標(biāo)志物進(jìn)行,并使用高親和力和特異性的工具。允許進(jìn)行這些過(guò)程的工具通常稱(chēng)為親和力工具[1],其中主要是抗體和適配體。

        目前,哺乳動(dòng)物的抗體是最成功的提供廣泛分子識(shí)別需求的親和力工具,表征最充分,已經(jīng)存在了40多年[2]??贵w作為生物體免疫系統(tǒng)自身產(chǎn)生的蛋白質(zhì),在當(dāng)今臨床醫(yī)療實(shí)踐中應(yīng)用甚廣,如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和Western blotting。但是抗體也有局限性,包括高生產(chǎn)成本和低穩(wěn)定性。近年來(lái), 一些親和力工具,如工程結(jié)合蛋白[3]、適配體[2]和分子印跡聚合物(Molecular imprinted polymer,MIP)[4]都引起了人們的廣泛關(guān)注。適配體是一類(lèi)新的具有類(lèi)似抗體識(shí)別功能的核酸分子,它作為新興的領(lǐng)域,能以高親和力和特異性識(shí)別靶分子,其特異性可與單克隆抗體的同類(lèi)靶標(biāo)和特異性相媲美。適配體的出現(xiàn)為生物和醫(yī)學(xué)界提供了一種新的高效快速識(shí)別的研究平臺(tái),發(fā)展迅速,具備良好應(yīng)用潛力。

        細(xì)胞特異性核酸適配體是適配體中特殊的一類(lèi),其特異性識(shí)別的靶分子為細(xì)胞。靶標(biāo)未知的內(nèi)源狀態(tài)、細(xì)胞活性及細(xì)胞表面的復(fù)雜性等因素,都對(duì)細(xì)胞特異性核酸適配體的篩選提出了挑戰(zhàn)。該綜述針對(duì)細(xì)胞特異性核酸適配體基于細(xì)胞表面標(biāo)志物、全細(xì)胞、組織和體內(nèi)的篩選,以及細(xì)胞適配體的親和性、特異性、細(xì)胞活力、臨床組織和體內(nèi)可行性等幾方面的評(píng)價(jià)進(jìn)行總結(jié),旨在為未來(lái)細(xì)胞適配體的篩選提供高效的篩選和評(píng)價(jià)方式。

        1 細(xì)胞特異性適配體概述

        1.1 適配體簡(jiǎn)介

        適配體(Aptamer)最早在1990年被發(fā)現(xiàn)和描述[5-6],是長(zhǎng)度一般為20-100個(gè)核苷酸的單鏈DNA或RNA,名稱(chēng)“aptamer”來(lái)源于拉丁語(yǔ)aptus(合適),和希臘語(yǔ)merus(粒子)[7],中文譯名為“核酸適配體”。

        適配體能夠折疊形成特定且穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu),從而以高親和力和特異性結(jié)合靶分子。靶分子類(lèi)型十分廣泛,包括氨基酸、金屬離子、蛋白質(zhì)、病毒、菌和全細(xì)胞等[8]。適配體與抗體相似,被稱(chēng)為“化學(xué)抗體”。但與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)抗體相比,適配體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),包括尺寸小、分子量低、可快速滲透到組織和器官中、特異性強(qiáng)、化學(xué)改性較簡(jiǎn)單、沒(méi)有批次間的變化、穩(wěn)定性高、毒性低和免疫原性低等[9-10]。由于適配體的天然狀態(tài)、構(gòu)象及優(yōu)點(diǎn),使其具備探索臨床運(yùn)用的巨大前景。

        1.2 細(xì)胞特異性適配體

        當(dāng)前,細(xì)胞特異性核酸適配體在疾病成像及診斷[11-12]、藥物遞送[13-15]和免疫治療[16]等方面得到了很大的發(fā)展,所以可用的細(xì)胞特異性適配體庫(kù)的不斷擴(kuò)充尤為重要。

        近年來(lái),研究者們已進(jìn)行大量的努力來(lái)篩選適配體,并不斷發(fā)展和改進(jìn)篩選方式。適配體一般是通過(guò)體外選擇寡核苷酸文庫(kù)中分離出來(lái)的,這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)。基于SELEX,也有研究者提出了非SELEX(Non-SELEX)的篩選方式,SELEX和非SELEX是通過(guò)篩選過(guò)程中是否有序列的擴(kuò)增富集來(lái)區(qū)分的。Berezovski等[17]首先報(bào)道了非SELEX篩選的適配體,他們運(yùn)用平衡混合物的非平衡毛細(xì)管電泳進(jìn)行分配,僅3個(gè)步驟就將DNA文庫(kù)與靶蛋白的親和力提高4個(gè)數(shù)量級(jí)以上。非SELEX沒(méi)有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增和鏈分離富集的重復(fù)步驟,一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)就是它的速度和簡(jiǎn)單性,與典型SELEX需要的數(shù)天到數(shù)周相比,非SELEX能在1 h內(nèi)完成,且可以為不能被擴(kuò)增的小分子庫(kù)中的篩選提供可能。

        在細(xì)胞特異性適配體的篩選方法中,SELEX是主要的方式,以全細(xì)胞作為靶標(biāo)的方法最為常用, 稱(chēng) 為 細(xì) 胞 SELEX(Cell-SELEX)。1990年,SELEX由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立開(kāi)發(fā)[5-6],它是一個(gè)循環(huán)的過(guò)程,涉及結(jié)合、洗脫、擴(kuò)增等步驟。SELEX過(guò)程從1013-1016單鏈脫氧核糖核酸(Single-stranded deoxyribonucleic acid,ssDNA)或單鏈核糖核酸(Single-stranded ribonucleic acid,ssRNA)分子的隨機(jī)庫(kù)開(kāi)始,每個(gè)序列含有隨機(jī)區(qū)域和側(cè)翼兩個(gè)已知序列的區(qū)域,以便于擴(kuò)增時(shí)的引物結(jié)合。篩選DNA適配體時(shí),將隨機(jī)庫(kù)與靶分子孵育,除去未結(jié)合的序列并分離DNA/靶分子復(fù)合物,PCR擴(kuò)增相應(yīng)DNA序列,并進(jìn)行下一輪篩選,多輪篩選后對(duì)候選適配體進(jìn)行測(cè)序,并評(píng)價(jià)其靶親和力等。篩選RNA適配體的過(guò)程與其類(lèi)似,但需體外轉(zhuǎn)錄得到一個(gè)RNA隨機(jī)庫(kù),且將結(jié)合靶分子的RNA序列進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增。第一次Cell-SELEX是用于非洲布氏錐蟲(chóng)[18],研究者從RNA適配體庫(kù)中篩選高親和力適配體,其結(jié)合到血流階段的非洲錐蟲(chóng)鞭毛袋上。目前Cell-SELEX已經(jīng)應(yīng)用于各類(lèi)腫瘤細(xì)胞[19-20]、病毒感染的細(xì)胞[21]、正常細(xì)胞[22]及寄生蟲(chóng)[23]等特異性適配體的篩選。

        常規(guī)的SELEX成熟且有效,但是有的富集次數(shù)多達(dá)20輪,時(shí)間從數(shù)周到幾個(gè)月,消耗大量的時(shí)間和勞動(dòng)力,所以用于篩選適配體的方法得到了不斷的更新和發(fā)展。包括細(xì)胞表面表達(dá)靶標(biāo)(Target expressed on cell surface,TECS)-SELX、 熒光激活細(xì)胞分選(Fluorescence-activated cell sorting,F(xiàn)ACS)-SELEX、交叉SELEX、配體引導(dǎo)選擇(Ligand-guided selection,LIGS)、3D 細(xì) 胞 SELEX、細(xì)胞內(nèi)化SELEX,以及基于組織載玻片的SELEX和體內(nèi)SELEX等。

        2 細(xì)胞表面標(biāo)志物適配體篩選

        針對(duì)細(xì)胞的適配體可以使用純化的蛋白質(zhì)作為靶標(biāo),該種蛋白質(zhì)往往在某種或某類(lèi)細(xì)胞表面特異性表達(dá)。有研究者通過(guò)重組人CD4,從含有2'-F-嘧啶的RNA文庫(kù)中篩選人CD4特異性適配體,將這些適配體與熒光團(tuán)偶聯(lián)用于流式細(xì)胞術(shù),觀察具有不同密度CD4表達(dá)能力的細(xì)胞的染色情況[24]。Hu等[25]篩選出MUC1特異性適配體MA3,MUC1是在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞上過(guò)表達(dá)的跨膜糖蛋白,在正常組織中,MUC1的蛋白質(zhì)核被糖鏈覆蓋,而在腫瘤中,蛋白質(zhì)核心由于糖基化不足而暴露出來(lái),成為抗癌治療的靶點(diǎn)[26]。經(jīng)驗(yàn)證,適配體MA3可特異性地結(jié)合到MUC1陽(yáng)性細(xì)胞上,包括A549和MCF-7[25]。此外,SELEX也可以不針對(duì)純化的蛋白質(zhì),而針對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行,Morris等[27]以人紅細(xì)胞膜為靶物質(zhì)篩選適配體,同時(shí)獲得多個(gè)靶標(biāo)的適配體,且其親和力與針對(duì)純靶標(biāo)篩選出來(lái)的相當(dāng),證明了SELEX在復(fù)雜生物體系中的應(yīng)用。Ababneh等[28]利用人類(lèi)重組全長(zhǎng)CD44蛋白和2’-F-嘧啶修飾的RNA文庫(kù),篩選出RNA適配體。細(xì)胞表面糖蛋白CD44是用于鑒定癌癥干細(xì)胞(Cancer stem cell,CSC)最常見(jiàn)表面標(biāo)記之一。而后使用表達(dá)CD44的代表性乳腺癌細(xì)胞系評(píng)估發(fā)現(xiàn)選定的RNA適配體(Apt1)與此類(lèi)癌細(xì)胞發(fā)生特異性相互作用。

        但是長(zhǎng)期以來(lái)觀察到,篩選自純化蛋白質(zhì)的適配體,有的時(shí)候可能不能以其內(nèi)源狀態(tài)(如細(xì)胞中)結(jié)合相同的蛋白質(zhì)[29-30],Elle等[29]通過(guò) SELEX 分離了針對(duì)CD73的含鎖核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)的DNA適配體,CD73是在實(shí)體瘤中經(jīng)常過(guò)度表達(dá)的蛋白質(zhì)。然而,當(dāng)將適配體與CD73陽(yáng)性的MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞孵育時(shí)發(fā)現(xiàn),沒(méi)有顯示出適配體對(duì)細(xì)胞的結(jié)合。細(xì)胞CD73是一種糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinosi-tol,GPI)錨定的細(xì)胞表面蛋白,而在重組蛋白中適配體顯示與CD73的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合,所以適配體識(shí)別的表位可能不可用于結(jié)合細(xì)胞蛋白。

        使用活細(xì)胞作為靶標(biāo)篩選適配體的方法則可以克服這一缺陷。在Cell-SELEX中,靶分子具有其自身的天然構(gòu)象,也不需要對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行純化或?qū)蟹肿舆M(jìn)行固定,可以在未知靶標(biāo)的情況下對(duì)細(xì)胞的適配體進(jìn)行篩選,能同時(shí)獲得幾條與靶細(xì)胞膜上不同位點(diǎn)結(jié)合的適配體,具備廣泛的優(yōu)勢(shì)[31]。Cell-SELEX為靶向細(xì)胞表面蛋白提供了十分有用的策略,特別是對(duì)于轉(zhuǎn)錄后嚴(yán)重修飾,且不能容易地通過(guò)細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)以其天然修飾和折疊形式獲得的蛋白。

        3 全細(xì)胞適配體SELEX篩選方法

        3.1 細(xì)胞表面表達(dá)靶標(biāo)SELEX(TECS-SELEX)

        Cell-SELEX面臨著許多挑戰(zhàn),其中一個(gè)重要的挑戰(zhàn)是細(xì)胞在其表面上表達(dá)大量的蛋白質(zhì)和其他化學(xué)部分,這些都是適配體的潛在靶標(biāo)。為了解決這一問(wèn)題,TECS-SELEX通過(guò)使用在其表面上過(guò)表達(dá)所需靶蛋白的細(xì)胞進(jìn)行篩選,把正向篩選和不表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞的負(fù)向篩選相互交替。Ohuchi 等[32]在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CHO)表面上異位表達(dá)人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)III型受 體(TbRIII), 在 11輪 TECS-SELEX后, 分 離出針對(duì)TbRIII的RNA適配體,從而無(wú)需純化重組蛋白。Kim等[33]通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的感染,在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM),將過(guò)表達(dá)EpCAM的HepG2細(xì)胞作為正篩細(xì)胞,普通HepG2細(xì)胞作為負(fù)篩細(xì)胞,篩選出的適配體可用于干細(xì)胞和癌癥中的研究。

        3.2 熒光激活細(xì)胞分選SELEX(FACS-SELEX)

        死細(xì)胞的存在是所有類(lèi)型SELEX的主要缺陷,因?yàn)樗兰?xì)胞會(huì)對(duì)適配體產(chǎn)生非特異性攝取,從而出現(xiàn)假陽(yáng)性,導(dǎo)致選擇過(guò)程的失?。?4]。運(yùn)用FACS,通過(guò)流式細(xì)胞儀根據(jù)細(xì)胞不同的光散射特性或?qū)⒓?xì)胞用可滲透染料酶促轉(zhuǎn)化成熒光,將活細(xì)胞和死細(xì)胞分開(kāi),能夠使得篩選更有效,且周期較短。Raddatz等[34]運(yùn)用FACS在選擇過(guò)程中實(shí)施了死細(xì)胞的分離步驟,篩選CD19+Burkitt淋巴瘤的適配體,證明了FACS-SELEX方法適用于細(xì)胞亞群的有效靶向。Kim等[35]在篩選成熟白色脂肪細(xì)胞適配體時(shí),也運(yùn)用FACS細(xì)胞分選富集DNA文庫(kù)結(jié)合的細(xì)胞,并在篩選完成后運(yùn)用其分析適配體對(duì)細(xì)胞的結(jié)合親和力。

        對(duì)于適配體篩選過(guò)程中死細(xì)胞干擾的去除,除了FACS,還有微珠的方法[36],在與DNA文庫(kù)孵育前除去死細(xì)胞,可以減少靶結(jié)合序列的損失和富集的適配體被非特異性結(jié)合的序列污染。

        3.3 交叉SELEX(Cross-over SELEX)

        在交叉SELEX中,純化的蛋白質(zhì)和全細(xì)胞都作為靶標(biāo),Hicke等[37]首先提出和應(yīng)用這樣的方式,從惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和純化的tenascin-C蛋白中篩選了tenascin-C蛋白的特異性RNA適配體。與之對(duì)應(yīng),還存在反向交叉SELEX,即先在蛋白質(zhì)上進(jìn)行篩選,再在活細(xì)胞上篩選。但交叉SELEX由于涉及其他的篩選方式,所以會(huì)相對(duì)耗時(shí)[25]。

        3.4 配體引導(dǎo)選擇(LIGS)

        LIGS利用了SELEX的核心選擇步驟,使用預(yù)先確定好的天然存在的更強(qiáng)和高度特異性的二價(jià)結(jié)合劑,與其同源抗原相互作用的抗體(Ab),從部分富集的SELEX文庫(kù)中競(jìng)爭(zhēng)特定的適配體,從而獲得細(xì)胞表面已知靶標(biāo)的適配體。Zumrut 等[38]在表達(dá)膜結(jié)合的免疫球蛋白M(Membrane-bound immunoglobulin M,mIgM)的Ramos細(xì)胞的適配體篩選中,用mIgM的抗體選擇性地洗脫特異性mIgM的適配體,將其作為分離步驟鑒定出了3種適配體的候選物。

        3.5 細(xì)胞內(nèi)化SELEX

        有的適配體不僅與細(xì)胞表面的靶標(biāo)結(jié)合,還能在與靶標(biāo)結(jié)合之后發(fā)生細(xì)胞內(nèi)化。這樣的適配體介導(dǎo)的siRNA和藥物的遞送對(duì)于癌癥等疾病的治療具有重要意義。Thiel等[39]將Cell-SELEX與高通量測(cè)序(High-throughput sequencing,HTS)和生物信息學(xué)相結(jié)合,富集了能夠選擇性?xún)?nèi)化到血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的RNA適配體。

        3.6 3D細(xì)胞SELEX

        3D細(xì)胞SELEX運(yùn)用基于磁懸浮技術(shù)的磁化噬菌體水凝膠來(lái)進(jìn)行3D細(xì)胞培養(yǎng),從而模擬自然狀態(tài)下的細(xì)胞環(huán)境[40],在此基礎(chǔ)上與Cell-SELEX相結(jié)合的方法。Souza等[41]對(duì)PC-3前列腺癌細(xì)胞系進(jìn)行3D培養(yǎng),形成球形細(xì)胞模擬腫瘤微環(huán)境,結(jié)合Cell-SELEX篩選出了8個(gè)PC-3特異性RNA適體。

        3.7 消減SELEX(Subtractive SELEX)

        減法SELEX在每輪選擇之前將文庫(kù)與正常細(xì)胞孵育,分化的細(xì)胞作為靶標(biāo),從而能夠區(qū)分同源來(lái)源和不同亞型等兩個(gè)密切相關(guān)的細(xì)胞的適配體。Wang等[42]用分化的PC12細(xì)胞作為靶標(biāo),每輪選擇之前,使用未分化的PC12細(xì)胞減去SELEX文庫(kù)。經(jīng)過(guò)6輪選拔,獲得了僅對(duì)分化的PC12細(xì)胞具有特異性結(jié)合能力的高親和力適配體。

        3.8 SWCNTs輔助細(xì)胞SELEX(SWCNTs-assisted cell-SELEX)

        將特異性與非特異性結(jié)合的單鏈DNA(ssDNA)分離是提高篩選效率的重要步驟。為了克服大多數(shù)細(xì)胞SELEX僅使用洗滌導(dǎo)致分離不完全的問(wèn)題,運(yùn)用單壁碳納米管(Single-walled carbon nanotubes,SWCNT)吸附ssDNA的性質(zhì),將其結(jié)合到細(xì)胞SELEX方法中。分離時(shí),SWCNT吸附未結(jié)合或非特異性ssDNA,再對(duì)細(xì)胞上特異性結(jié)合的適配體進(jìn)行富集。Tan等[43]將兩個(gè)鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)細(xì)胞系CNE2細(xì)胞和HONE細(xì)胞分別用作靶細(xì)胞和陰性細(xì)胞,在SWCNTs輔助下,僅6個(gè)循環(huán)就篩選出了對(duì)CNE2細(xì)胞顯示出高特異性和親和力的適配體,有效提高了篩選效率。

        3.9 高效的SELEX

        在磁珠(Magnetic bead,MB)上固定靶分子的SELEX方法由Bruno等[44]在1997年提出,磁珠-SELEX(MB-based SELEX)主要針對(duì)的靶標(biāo)是蛋白質(zhì),通過(guò)磁分離將結(jié)合的適配體分離出來(lái)。Stoltenburg等[45]在 2005年提出了 FluMag-SELEX,結(jié)合了DNA熒光標(biāo)記和磁分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),每輪選擇后通過(guò)熒光素標(biāo)記進(jìn)行DNA定量。針對(duì)不適合固定在固體表面的靶分子,在FluMag-SELEX的基礎(chǔ)上發(fā)展了Capture-SELEX[46],創(chuàng)建特殊的DNA文庫(kù),將其通過(guò)對(duì)接序列固定在磁珠上。磁珠-SELEX也與微流體應(yīng)用相結(jié)合,開(kāi)發(fā)了微流體-SELEX,Gopinathan等[47]研發(fā)了一種能夠自動(dòng)識(shí)別膽管癌細(xì)胞特異性適配體的集成微流體系統(tǒng),通過(guò)微流控芯片,顯著提高了篩選速度,只需6輪即成功篩選出了3種特異性結(jié)合膽管癌細(xì)胞的適配體。

        高通量測(cè)序目前也已成為一種相對(duì)便宜且用戶(hù)友好的方法,可以運(yùn)用其鑒定功能和稀有基序,比較每個(gè)寡核苷酸群體中的功能基序并定量其豐度。高通量測(cè)序輔助SELEX(HTS-SELEX)[39]也能夠使得篩選過(guò)程更加高效。單克隆表面展示(Monoclonal surface display,MSD)SELEX(MSD-SELEX)[48]也是一種發(fā)展起來(lái)的高效的SELEX技術(shù)。

        4 基于組織載玻片的SELEX

        基于組織載玻片的SELEX是把適配體文庫(kù)和癌組織切片孵育,從載玻片上刮下癌組織和結(jié)合序列的復(fù)合物,并擴(kuò)增結(jié)合序列,再與正常組織切片的孵育作為負(fù)篩步驟。Li 等[49]使用乳腺導(dǎo)管癌的石蠟組織切片作為靶標(biāo),相同病例或鄰近組織作為對(duì)照,篩選驗(yàn)證了特異性識(shí)別來(lái)自不同病理類(lèi)型的臨床組織切片的乳腺癌細(xì)胞和具有異質(zhì)性核糖核蛋白 A1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1,hnRNP A1)的細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的乳腺癌細(xì)胞系的適配體,是一種具備優(yōu)勢(shì)的原位篩選策略。

        5 體內(nèi)SELEX

        體內(nèi)SELEX與傳統(tǒng)SELEX非常相似,但是使用活的生物體進(jìn)行選擇,一般通過(guò)尾靜脈注射將文庫(kù)注入特定小鼠體內(nèi),再將瘤體或組織取出,分離適配體并擴(kuò)增,再進(jìn)入下一輪注射篩選。由于機(jī)體內(nèi)的生理環(huán)境復(fù)雜多變,所以體內(nèi)SELEX可以克服體外篩選的一些缺陷,實(shí)現(xiàn)活體生物體腫瘤的特異性定位。Wang等[50]在非小細(xì)胞肺癌異種移植的小鼠模型中,從聚乙二醇化的RNA文庫(kù)中篩選出適配體RA16,且該適配體劑量依賴(lài)性地抑制小鼠體內(nèi)NCI-H460腫瘤的增殖。目前,通過(guò)體內(nèi)SELEX篩選適配體已經(jīng)應(yīng)用在小鼠模型的多種組織或器官,包括大腦[51]、骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌[52]、雄性激素非依賴(lài)性前列腺腫瘤[53]及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌[54]等。

        6 細(xì)胞適配體的評(píng)價(jià)策略

        6.1 適配體的親和力評(píng)價(jià)

        親和力表征是確定適配體篩選成功與否、評(píng)價(jià)其可用性的關(guān)鍵步驟。適配體與靶標(biāo)的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程,所以通常用平衡解離常數(shù)Kd值來(lái)衡量適配體與靶標(biāo)的結(jié)合親和力,Kd值的定義如式(1)所示,其中c指濃度,Kd值越小,表明二者相互作用越強(qiáng),即親和力越高。

        細(xì)胞特異性適配體最常用的親和力表征方法是流式細(xì)胞術(shù)。通過(guò)配制一系列不同濃度的帶熒光標(biāo)記的適配體與細(xì)胞孵育,將孵育混合物通過(guò)流式細(xì)胞儀并檢測(cè)每組的平均熒光強(qiáng)度,流式細(xì)胞儀可以將細(xì)胞-適配體復(fù)合物與游離的適配體或細(xì)胞分離,并測(cè)定帶有熒光標(biāo)記的復(fù)合物的數(shù)量。按照式(2)并運(yùn)用軟件(如Origin)即可進(jìn)行非線性擬合并計(jì)算得到Kd值。其中適配體的濃度X為自變量,各組平均熒光強(qiáng)度值與對(duì)照組熒光強(qiáng)度值之差Y為因變量,Bmax指飽和熒光強(qiáng)度。

        Li等[55]為了確定所選適體的結(jié)合親和力,將LoVo細(xì)胞(1 × 106)與不同濃度的FITC標(biāo)記的適體在BB中于4℃ 溫育20 min,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。ssDNA文庫(kù)用作陰性對(duì)照。然后通過(guò)Sigma Plot軟件(Jandel,San Rafael,CA)獲得適配體-細(xì)胞相互作用的平衡解離常數(shù)(Kd)。Aptaker等[56]將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞與不同濃度的Cy3標(biāo)記的適配體SA43和SA44分別孵育,PBS洗滌并重懸于PBS中以進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,最終非線性回歸分析得出,SA43和SA44適配體都以納摩爾范圍的高親和力結(jié)合U87MG靶細(xì)胞。

        6.2 適配體的特異性評(píng)價(jià)

        在評(píng)價(jià)適配體的特異性時(shí),通常用到流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測(cè)。將熒光修飾的隨機(jī)文庫(kù)和適配體與靶細(xì)胞及各類(lèi)非靶細(xì)胞孵育,并用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面的平均熒光強(qiáng)度,分析適配體與靶細(xì)胞和各類(lèi)非靶細(xì)胞的結(jié)合情況,從而評(píng)價(jià)其特異性。為了使結(jié)果更加清晰明了,研究者們通常對(duì)流式檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行處理,設(shè)置熒光強(qiáng)度的閾值。

        Li等[55]為了確定所篩選適配體的細(xì)胞選擇性,用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各類(lèi)細(xì)胞系進(jìn)行了適配體結(jié)合測(cè)定,并設(shè)定了流式細(xì)胞術(shù)分析的熒光強(qiáng)度的閾值,使得與FITC標(biāo)記的ssDNA文庫(kù)一起孵育的95%的細(xì)胞具有低于其的熒光強(qiáng)度。具有高于設(shè)定熒光閾值的細(xì)胞的百分比用于評(píng)價(jià)適配體與細(xì)胞的結(jié)合能力,并用不同符號(hào)加以清晰表示(-,<10%;+,11%-35%;++,36%-60% ;+++,61%-85% ;++++,>85%)。

        此外,還可以通過(guò)細(xì)胞熒光成像評(píng)價(jià)適配體的特異性。一般把FAM熒光修飾的隨機(jī)文庫(kù)和適配體分別與靶細(xì)胞孵育,在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度。Ababneh等[28]利用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡分析,發(fā)現(xiàn)體外篩選的適配體RNA適配體Apt1與CD44陽(yáng)性的腫瘤干細(xì)胞發(fā)生特異性相互作用,不同的熒光強(qiáng)度反映了細(xì)胞表面CD44的表達(dá)水平。

        6.3 細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)

        評(píng)價(jià)所篩適配體對(duì)細(xì)胞活力的影響,對(duì)于適配體的后續(xù)應(yīng)用是十分關(guān)鍵的。可以用篩選得到的適配體對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行處理,測(cè)定細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率[56],同時(shí)設(shè)置隨機(jī)文庫(kù)的對(duì)照組。Aptaker等[57]在用適配體處理細(xì)胞后,運(yùn)用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并分別在并在24 h、48 h和72 h下評(píng)估了細(xì)胞的增殖活性。判斷所篩適配體是否對(duì)靶細(xì)胞有明顯促凋亡作用,能夠指導(dǎo)適配體的可用性。當(dāng)所篩適配體對(duì)靶細(xì)胞有適度抑制作用時(shí),可能用于腫瘤細(xì)胞的抑制[58],而當(dāng)適配體具有最小細(xì)胞毒性時(shí),則可以被應(yīng)用于藥物、siRNA等的靶向遞送。

        6.4 臨床組織和體內(nèi)可行性評(píng)價(jià)

        對(duì)于體外篩選的細(xì)胞特異性適配體,為了更符合實(shí)際醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,體內(nèi)可行性評(píng)價(jià)也是比較重要的。Huang等[59]為了考察篩選所得適配體能否與實(shí)體瘤特異性結(jié)合,在裸鼠體內(nèi)種植移植瘤,而后取出腫瘤做成冰凍切片。核酸適配體apt-A和apt-B與組織切片孵育和清洗后,熒光顯微鏡下出現(xiàn)明顯綠色熒光,而隨機(jī)文庫(kù)則沒(méi)有,證明了適配體與實(shí)體瘤的結(jié)合,為體內(nèi)靶向奠定了一定基礎(chǔ)。Wu等[60]為了測(cè)試適配體XQ-2d是否在體內(nèi)保持其識(shí)別能力,將其用Cy5標(biāo)記,并通過(guò)尾靜脈注射到胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreaticductal adenocarcinoma,PDAC)荷瘤小鼠中,小鼠的腫瘤位點(diǎn)比隨機(jī)文庫(kù)的對(duì)照組顯示出更高的熒光信號(hào),且腫瘤中的積累也比心臟、脾、肺中更多,表明了適配體XQ-2d具有體內(nèi) PDAC靶向能力,為PDAC的診斷和治療提供了潛在的分子探針。

        7 總結(jié)與展望

        近年來(lái),核酸適配體的篩選方法得到了不斷的發(fā)展,其中,細(xì)胞特異性適配體的篩選方法也結(jié)合細(xì)胞本身的特點(diǎn)而不斷改進(jìn)。本文綜述了細(xì)胞特異性適配體的篩選方式,以及評(píng)價(jià)適配體的特異性、親和力、體內(nèi)可行性等的策略。細(xì)胞特異性適配體的篩選方式包括基于細(xì)胞標(biāo)志物的篩選、全細(xì)胞篩選和組織及體內(nèi)篩選等?,F(xiàn)列出目前常見(jiàn)的細(xì)胞特異性適配體,如表1所示。

        相較于其他靶標(biāo),在細(xì)胞適配體的篩選過(guò)程中,細(xì)胞活力的保持及死細(xì)胞的去除都十分關(guān)鍵。在整個(gè)篩選過(guò)程中,要防止吹打和過(guò)度酶處理對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷,多種死細(xì)胞的去除方法也被結(jié)合到細(xì)胞適配體的篩選中,包括熒光激活細(xì)胞分選和微珠處理等。相較于特定靶標(biāo)分子,細(xì)胞特異性適配體的篩選可以在未知靶標(biāo)的前提下進(jìn)行,并且能夠一次性獲得多條結(jié)合不同靶標(biāo)的適配體,但同時(shí)細(xì)胞表面的復(fù)雜性又會(huì)對(duì)篩選成功率產(chǎn)生不利影響。

        針對(duì)現(xiàn)有的篩選方法,篩選所得適配體,及其相應(yīng)評(píng)價(jià)策略,從3個(gè)方面展開(kāi)如下討論。

        首先,從細(xì)胞適配體的篩選方法角度分析。目前的篩選方法仍有很大的進(jìn)步空間。雖然篩選細(xì)胞適配體的方法有很多,但針對(duì)這些篩選方法還沒(méi)有一個(gè)合理且普遍通用的標(biāo)準(zhǔn),仍需要一些研究來(lái)彌補(bǔ)空白。而且,在篩選過(guò)程中往往只采用一種細(xì)胞作為負(fù)篩細(xì)胞,這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)置是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹A硗?,隨著計(jì)算機(jī)模擬和高通量測(cè)序方法在細(xì)胞適配體篩選中的應(yīng)用,核酸適配體的篩選周期被大大縮短。

        其次,從篩選得到的細(xì)胞適配體的評(píng)價(jià)角度分析。目前得到的細(xì)胞適配體還存在以下不足:針對(duì)篩選得到的核酸適配體的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍不明確;關(guān)于適配體在細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)及與細(xì)胞的作用力、作用方式的探究是缺乏的;現(xiàn)有研究大多是將篩選得到細(xì)胞適配體,與經(jīng)由胰蛋白酶或蛋白酶K處理的細(xì)胞樣品結(jié)合,從而判定適配體的結(jié)合位點(diǎn)是否為膜蛋白,對(duì)于非膜蛋白的結(jié)合位點(diǎn)鮮有進(jìn)一步的探索。

        再者,從篩選得到的核酸適配體的應(yīng)用角度分析。人工堿基對(duì)的應(yīng)用、計(jì)算機(jī)的應(yīng)用及文庫(kù)修飾等都迫使適配體的文庫(kù)設(shè)計(jì)不斷改進(jìn),其可能會(huì)增加適配體篩選過(guò)程的成本,但文庫(kù)的改善對(duì)于篩選具備重要意義。經(jīng)系列篩選后,適配體的修飾、定點(diǎn)誘變、截短等增強(qiáng)其特性的手段也在不斷發(fā)展,使篩選得到的適配體在應(yīng)用性上可以大大加強(qiáng)。

        表1 常見(jiàn)的細(xì)胞特異性適配體

        此外,當(dāng)前細(xì)胞特異性適配體的篩選大多集中在癌細(xì)胞上。而針對(duì)人源正常細(xì)胞的適配體篩選還存在很大的空白。希望廣大研究者能夠進(jìn)一步努力,繼續(xù)發(fā)展高效省時(shí)的適配體篩選方法,逐步豐富和完善適配體庫(kù)。

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