隋國強 張登云 孔磊 陳玉惠 李靖

（云南省林木生物技術(shù)重點實驗室 西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224）

重寄生現(xiàn)象（Mycoparasitism）是指自然界一種真菌寄生在另一種真菌上并完成生活史的現(xiàn)象。重寄生菌則是一類寄生在另一種真菌上的真菌［1］。重寄生作用作為植物病害的主要生防機制，越來越受到各國植物病理學(xué)家的重視。植物銹病的重寄生現(xiàn)象非常普遍，在生態(tài)自然控病和植物銹病生物防治中占有重要地位。以往研究主要集中在銹菌重寄生菌的篩選、鑒定及生物學(xué)特性等方面［2-4］。對于重寄生的機制目前認為主要包括酶和毒素兩方面［5］。真菌毒素（Mycotoxin）是由植物病原真菌及病原重寄生真菌產(chǎn)生的一類對寄主植物和病原真菌有毒的代謝產(chǎn)物，即真菌與寄主植物，重寄生菌與寄主真菌互作中的重要致病因子［6］。目前對于重寄生菌所產(chǎn)毒素的研究報道較少，多從重寄生菌對植物病原菌能產(chǎn)生很強的拮抗作用來推測其所產(chǎn)毒素的存在［7］。

擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）含有對許多植物內(nèi)生或致病的真菌。Steyaert［8］于1949年首先提出擬盤多毛孢屬，并根據(jù)分生孢子的形態(tài)特征將其與盤多毛孢屬（Pestalotia）分離。自此傳統(tǒng)擬盤多毛孢屬的分類鑒定主要依靠形態(tài)特征。但是依據(jù)形態(tài)特征對擬盤多毛孢進行分類有很大的局限性，無法明確種間界限及親緣關(guān)系；不同學(xué)者對同一物種的形態(tài)特征界定和看法不同，且主要以菌株的寄主植物命名，導(dǎo)致一個菌種多個名字，不利于擬盤多毛孢菌株的開發(fā)及利用［9］。近年來，分子手段被廣泛用于擬盤多毛孢屬的鑒定和分類。Jeewon等［10］基于ITS序列分析評估形態(tài)特征的系統(tǒng)發(fā)育重要性，使用ITS1-5.8S rRNA-ITS2識別物種。建立了一個系統(tǒng)發(fā)育樹，并顯示最終的形態(tài)特征是中性細胞的色素沉著和附肢尖端的形態(tài)。為進一步解決分類學(xué)問題，Liu等［11］使用形態(tài)學(xué)和ITS1-5.8S rRNA-ITS2和β-tubulin 2基因序列描述了一個新物種Pestalotiopsis hainanensis，并構(gòu)建了相似的系統(tǒng)進化樹。Hu等［12］分析了來自ITS區(qū)域和β-微管蛋白基因的組合數(shù)據(jù)集DNA序列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)組合基因更適合于解決分類學(xué)關(guān)系。

石楠銹孢銹菌（Aecidium pourthiaea）是石楠（Photinia prionophylla）葉銹病的病原菌，主要危害3年生以下的石楠幼樹及幼苗［13］。前期研究從患有銹病的球花石楠葉片上分離得到3株重寄生擬盤多毛孢，對3株菌的形態(tài)特征進行了描述并初步確定其為擬盤多毛孢屬，同時發(fā)現(xiàn)它們對石楠銹孢銹菌的銹孢子有很強的破壞作用［14］。本研究利用單基因及多基因復(fù)合分析并結(jié)合形態(tài)特征，對3株擬盤多毛孢進行種的鑒定，旨在為石楠銹病的生物防治提供菌種資源；同時篩選重寄生擬盤多毛孢的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基，為石楠銹孢銹病的重寄生擬盤多毛孢毒素的分離鑒定及生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 3株重寄生擬盤多毛孢PG52、PG53和PG90分離自患有銹病的球花石楠葉片上，并保存于4℃［14］。茶藨生柱銹菌銹孢子采自云南省昆明市東川區(qū)二二二林場；石楠銹病銹菌孢子采自西南林業(yè)大學(xué)苗圃中。

1.1.2 培養(yǎng)基 6種產(chǎn)毒培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基、改良 Fries培養(yǎng)基、查彼（Czapek）培養(yǎng)基、理查（Richard）培養(yǎng)基、PSKA培養(yǎng)基和改良M-1-D培養(yǎng)基［15］。

1.1.3 引 物 ITS5（5'-GAAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATAT-3'）；LROR（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'）和 LR5（5'-TCCTGAGGGAAACTTCG-3'）；bt2a（5'-GGTAAACCA AATCGGTGCTGCTTTC-3'）和 bt2b（5'-ACCCTCAGTG TAGTGACCCTTGGC-3'）［14］。

1.2 方法

1.2.1 分子序列測定 從已培養(yǎng)8 d的PDA平板菌落邊緣挑取直徑為0.5 cm的擬盤多毛孢菌塊，以3塊/瓶的接種量接入50 mL PD培養(yǎng)液中，于25℃下以120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。每處理設(shè)置3個重復(fù)。發(fā)酵液雙層濾紙抽濾，無菌水清洗菌絲后利用DNA提取試劑盒（上海生工）進行擬盤多毛孢DNA的提取，以ITS5和ITS4為引物擴增ITS基因；以LROR和LR5為引物擴增28S基因；以bt2a和bt2b為引物擴增beta-tubulin基因，對擴增產(chǎn)物依次進行瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、序列測定和GenBank數(shù)據(jù)庫檢索。

1.2.2 三株擬盤多毛孢分類鑒定 篩選合適的對比 序 列［16］， 利 用 PAUP.40b10軟 件， 輸 入 paup程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過前期觀察得到3株擬盤多毛孢菌落形狀、顏色和分生孢子等形態(tài)特征［14］，對比《中國真菌志:擬盤多毛孢屬》［17］和Maharachchikumbura等［16］文章中菌株的形態(tài)特征，通過分子鑒定和形態(tài)特征判斷3株擬盤多毛孢的具體種名。

1.2.3 粗提物的制備 將活化后的3株擬盤多毛孢，從各菌落邊緣挑取直徑0.5 cm的菌塊分別接入6種（PDA培養(yǎng)基、改良Fries培養(yǎng)基、查彼Czapek培養(yǎng)基、理查Richard培養(yǎng)基、PSKA培養(yǎng)基和改良M-1-D培養(yǎng)基）中，25℃培養(yǎng)20 d后提取毒素粗提物。對使用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的3種重寄生擬盤多毛孢菌株及其培養(yǎng)基，分別切成均勻小塊，并放入相應(yīng)標有菌株和培養(yǎng)基的錐形瓶中。然后加入有機溶劑（乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸=80∶15∶5）100 mL浸泡3 d后過濾，重復(fù)3次，過濾后合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下萃取，然后加入12 mL溶解劑二甲亞砜（DMSO）溶解提取物1-2 min既得粗提物，冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 銹孢子活力檢測 生物測定采用凹玻片法，即在滅過菌的凹玻片內(nèi)注入100 μL毒素原液，分別取適量茶藨生柱銹菌和石楠銹孢銹菌銹孢子浸于其中，攪拌使銹孢子與液體充分接觸。處理一段時間后，定時取少許銹孢子分別以蒸餾水和0.4%臺酚藍為浮載劑制片，于顯微鏡下觀察孢子的顏色和形態(tài)變化。以未接種菌塊的培養(yǎng)液處理的銹孢子為對照。

1.2.5 最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基的篩選 按上述方法進行生測，以添加銹孢子壁為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基制得的粗提物處理銹孢子作為平行組，以未接入菌塊的培養(yǎng)液處理銹孢子為陰性對照，每處理設(shè)3個重復(fù)。通過臺盼藍染色法測定銹孢子的活性，利用倒置顯微鏡（LEICA DMi1）拍照紀錄。

2 結(jié)果

2.1 三株擬盤多毛孢的分子鑒定

系統(tǒng)發(fā)育分析采用PAUP. 40b10軟件，以最大簡約（MP）法對3株擬盤多毛孢菌株和來自［14］文章中報道的菌株beta-tubulin（TUB）序列進行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示（圖1）:3株擬盤多毛孢中PG52和PG90聚在同一個分支，支持率為63%，兩者又與菌種Pestalotiopsis kenyana和Pestalotiopsis Oryzae在同一個大的分支，支持率為98%；PG53與PG52、PG90分支相距較遠，且與Pestalotiopsis telopeae在同一個分支，支持率為59%。表明PG52與PG90親緣關(guān)系近，兩者與Pestalotiopsis kenyana和Pestalotiopsis Oryzae的親緣關(guān)系較近，而PG53與Pestalotiopsis telopeae親緣關(guān)系較近。

以最大簡約（MP）法對3株擬盤多毛孢菌株的ITS、LSU和TUB復(fù)合序列進行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示（圖2）:3株擬盤多毛孢中PG52與PG90聚在同一個分支，支持率為61%，又與Pestalotiopsis kenyana和Pestalotiopsis Oryza在同一個大分支，支持率為98%；PG53與PG52、PG90分支相距較遠，且與Pestalotiopsis telopeae在同一個分支，支持率為61%。表明PG52與PG90親緣關(guān)系近，兩者與Pestalotiopsis kenyana和Pestalotiopsis Oryzae的親緣關(guān)系較近，而PG53與Pestalotiopsis telopeae親緣關(guān)系較近。

對比發(fā)現(xiàn)ITS、LSU和TUB復(fù)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果與TUB序列系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果相同，又根據(jù)3株擬盤多毛孢的菌落形態(tài)、分生孢子基附肢的數(shù)量、孢子顏色和長度等形態(tài)特征對比結(jié)果，可知PG53菌株的形態(tài)與Pestalotiopsis telopea的形態(tài)描述基本一致；PG52和PG90菌株的形態(tài)特征與Pestalotiopsis kenyana的形態(tài)描述一致。

2.2 三株擬盤多毛孢對石楠銹病銹菌孢子的作用

3 株擬盤多毛孢均能在銹孢子堆上生長，取處理后的銹孢子（圖3-B-D）用倒置顯微鏡觀察，與未處理的銹孢子（圖3-A）對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后的銹孢子內(nèi)含物濃縮，有的銹孢子內(nèi)含物釋放到孢子壁外，形成空殼，但銹孢子壁基本完整，初步判定其為毒素的作用。

2.3 三株擬盤多毛孢產(chǎn)毒培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

2.3.1 石楠銹病銹菌孢子 PG52菌株:改良Fries培養(yǎng)基（圖4-B）和改良M-1-D培養(yǎng)基（圖4-F）的粗提物效果最好，處理染色后，銹孢子內(nèi)和銹孢子壁都能染上深藍色。理查培養(yǎng)基（圖4-D）和PDA培養(yǎng)基（圖4-A）的粗提物效果稍次，PSKA培養(yǎng)基（圖4-E）和查彼培養(yǎng)基（圖4-C）最次。

圖1 三株擬盤多毛孢PG52、PG53和PG90的TUB序列建樹結(jié)果

圖2 三株擬盤多毛孢PG52、PG53、PG90的三段序列組合建樹結(jié)果

PG53菌株:改良Fries培養(yǎng)基和改良M-1-D培養(yǎng)基的粗提物效果最好，處理染色后，銹孢子內(nèi)和銹孢子壁都能染上深藍色。理查培養(yǎng)基和PSKA培養(yǎng)基稍次，PDA培養(yǎng)基和查彼培養(yǎng)基最次。

圖3 三株擬盤多毛孢對石楠銹病銹菌孢子的作用

PG90菌株:改良Fries培養(yǎng)基、理查培養(yǎng)基、查彼培養(yǎng)基和改良M-1-D培養(yǎng)基的粗提物效果最好，處理染色后，銹孢子內(nèi)和銹孢子壁都能染上深藍色。PDA培養(yǎng)基和PSKA培養(yǎng)基效果稍次。

2.3.2 茶藨生柱銹菌孢子 PG52菌株:理查培養(yǎng)基（圖5-D）和改良Fries培養(yǎng)基（圖5-B）的粗提物效果最好，處理染色后，銹孢子內(nèi)和銹孢子壁都能染上深藍色。PSKA培養(yǎng)基（圖5-E）和改良M-1-D培養(yǎng)基（圖5-F）的粗提物效果稍次。而PDA培養(yǎng)基（圖5-A）和查彼培養(yǎng)基（圖5-C）的粗提物則沒有效果，銹孢子仍然呈現(xiàn)黃色。

PG53菌株:理查培養(yǎng)基、改良Fries培養(yǎng)基和改良M-1-D培養(yǎng)基的粗提物效果最好，處理染色后，銹孢子內(nèi)和銹孢子壁都能染上深藍色。PDA培養(yǎng)基的粗提物效果稍次，染色顏色不深。而PSKA培養(yǎng)基和查彼培養(yǎng)基的粗提物則沒有效果，銹孢子仍然呈現(xiàn)黃色。

PG90菌株:理查培養(yǎng)基、查彼培養(yǎng)基、改良Fries培養(yǎng)基和改良M-1-D培養(yǎng)基的粗提物效果最好，處理染色后，銹孢子內(nèi)和銹孢子壁都能染上深藍色。PDA培養(yǎng)基和PSKA培養(yǎng)基的粗提物效果稍次，染色顏色不深。該菌株沒有無效果的粗提物。

圖4 PG52菌株不同培養(yǎng)基粗提物處理石楠銹病銹菌孢子效果圖

圖5 PG52菌株不同培養(yǎng)基粗提物處理茶藨生柱銹菌銹孢子效果圖

3 討論

近年將分子系統(tǒng)學(xué)方法用于擬盤多毛孢分類中，用多個基因片段分別或共同建立分子系統(tǒng)樹，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可以在一定程度上解決目前在形態(tài)分類上所遇到的問題。擬盤多毛孢屬的分生孢子在形態(tài)上是多種多樣的，基于單基因和多基因系統(tǒng)發(fā)育，以及形態(tài)特征，宿主關(guān)聯(lián)和地理分布等更加準確的鑒定出物種［18］。Jeewon等［19］在對擬盤多毛孢的第一個包容性系統(tǒng)發(fā)育研究中利用ITS序列數(shù)據(jù)，以評估分類學(xué)中擬盤多毛孢的形態(tài)學(xué)特征的系統(tǒng)發(fā)生意義。Hu等［12］在區(qū)分華山松和Ribesspp. 中的內(nèi)生擬盤多毛孢種類時指出，TUB基因更好地解決了擬盤多毛孢的系統(tǒng)發(fā)育。TUB和ITS基因的組合可提供更好的系統(tǒng)發(fā)育分辨率，并建議將它們用于解決擬盤多毛孢的系統(tǒng)發(fā)育。Maharachchikumbura等［16］在擬盤多毛孢菌中測試了肌動蛋白、鈣調(diào)蛋白、谷氨酰胺合酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、ITS、LSU、18S nrDNA、RNA聚合酶II、TEF和TUB等，通過比較發(fā)現(xiàn)，分子鑒定效果優(yōu)于形態(tài)學(xué)方法。在本研究中，基于ITS、TUB和LSU基因區(qū)域組合的系統(tǒng)發(fā)育物種識別在末端進化枝上提供了強力支持，為更好的鑒定擬盤多毛孢菌株奠定理論基礎(chǔ)。

銹菌是一類重要的植物病原菌，每年都給農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失［20-21］。防治銹病的方法包括化學(xué)防治、物理防治、生物防治和采用轉(zhuǎn)基因的手段，這些方法各有利弊［22］。近年來，對擬盤多毛孢致病機理的研究包括對其侵入寄主植物產(chǎn)生的相關(guān)酶的研究，及其所產(chǎn)毒素及在生產(chǎn)上的應(yīng)用的前景等方面的研究［23-25］。目前，由石楠銹孢銹菌（Aecidium pourthiaeasyd.）引起的石楠葉銹病發(fā)病逐年加重，能引起石楠葉片、嫩梢的失綠和枯萎死亡，進而引起一些次生病蟲害的發(fā)生，昆明因氣候溫暖，該病害全年都有發(fā)生，嚴重影響了石楠的綠化和觀賞價值。從石楠銹孢銹菌孢子分離得到的3株重寄生擬盤多毛孢，通過研究證明，對石楠銹病銹菌孢子和茶藨生柱銹菌孢子均有強寄生作用，結(jié)合茶藨生柱銹菌孢子和石楠銹病銹菌孢子的實驗結(jié)果確定了3株擬盤多毛孢的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基。研究結(jié)果為重寄生擬盤多毛孢在銹病生物防治中的應(yīng)用及其次生代謝產(chǎn)物的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究分別利用ITS、LSU、TUB以及三者組合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，PG52、PG90與Pestalotiopsis kenyana和Pestalotiopsis Oryza菌株在同一個分支，PG53為Pestalotiopsis telopeae菌株；同時結(jié)合形態(tài)特征，最終鑒定PG52、PG90為Pestalotiopsis kenyana菌 株，PG53為Pestalotiopsis telopeae菌株。分離得到的3株石楠銹孢銹菌重寄生擬盤多毛孢，其不僅能破壞石楠葉銹菌的銹孢子，也能破壞茶藨生柱銹菌的銹孢子，均使銹孢子的內(nèi)含物溢出，導(dǎo)致銹孢子死亡。但因孢子壁基本完整，初步判定其為毒素的作用。PG52菌株的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基為改良Fries培養(yǎng)基；PG53菌株的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基為改良M-1-D培養(yǎng)基；PG90菌株的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基為改良M-1-D培養(yǎng)基。