劉文浩 王瑞豐 劉琬琳 許杰

（上海交通大學生命科學技術(shù)學院，上海 200240）

瞬時表達系統(tǒng)是一種快速將目標基因轉(zhuǎn)入靶細胞、且高效表達蛋白的系統(tǒng)［1］。相對于穩(wěn)定表達系統(tǒng)，瞬時表達無需將外源基因整合到基因組上，消除了外源基因整合過程中位置效應的影響，具有表達周期短，表達量高等優(yōu)勢［2］。因此，瞬時表達系統(tǒng)被廣泛應用于分子生物學研究中，包括啟動子功能分析、轉(zhuǎn)錄因子對下游基因調(diào)控分析及蛋白質(zhì)間互作研究等［3］。但該系統(tǒng)蛋白表達量的穩(wěn)定性受到多種因素（載體自身組件構(gòu)成和轉(zhuǎn)化條件）的影響，如何更加高效和穩(wěn)定的提高瞬時表達系統(tǒng)外源蛋白的表達量，是該系統(tǒng)進一步優(yōu)化和擴大使用的前提和基礎。

植物瞬時表達導入目標外源基因的方法主要包括:基因槍法、農(nóng)桿菌滲透法、聚乙二醇（PEG）法、電擊法及植物病毒載體介導的方法［1］。其中，農(nóng)桿菌滲透法因其操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高且比較穩(wěn)定等特點，是目前最常使用的平臺系統(tǒng)［4］。其外源蛋白表達量的提高可以從以下兩個方面改進:其一是表達載體自身組件構(gòu)成的優(yōu)化，包括表達載體中的作用元件和表達載體骨架等；其二是轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，包括菌株、菌液濃度及轉(zhuǎn)化時間等［5］，最終目的是希望外源蛋白在該瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中能夠快速、高效地表達，從而進一步用于后期功能分析。

目前瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中表達載體自身組件的優(yōu)化方面，主要集中在啟動子、終止子、非編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄后沉默抑制因子等這些主要作用元件上。啟動子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵元件，組成型啟動子可以調(diào)控基因在植物任何組織器官中持續(xù)表達［6］，而組織特異型啟動子引導外源基因在植物特定組織或器官表達，并且大部分組織特異型啟動子在植物特定位置驅(qū)動外源基因表達的能力高于組成型啟動子［7］。表達載體中的5'非編碼區(qū)（5'UTR）能與宿主細胞競爭轉(zhuǎn)錄起始因子和核糖體，還可以減少mRNA降解和轉(zhuǎn)錄后基因沉默，避免與有害蛋白或抑制性RNA二級結(jié)構(gòu)相互作用，延長mRNA半衰期，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物表達［8］。終止子在提高外源基因表達方面同樣發(fā)揮重要作用，正確的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化能提高mRNA跨核運輸效率、維持mRNA穩(wěn)定性、提高蛋白翻譯效率，并能減少基因沉默［9］。Rosenthal等［9］發(fā)現(xiàn)表達載體中插入去掉內(nèi)含子的Extensin終止子（Ext）相較于NOS終止子在煙草葉片和生菜葉片中均能顯著提高外源基因表達。此外，Beyene等［10］發(fā)現(xiàn)相比單個終止子，將不同終止子串聯(lián)可以使基因表達達到更高水平?；|(zhì)附著區(qū)（Matrix attachment regions，MAR）序列是一段與核基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列，能使目的基因定位于核基質(zhì)上而與周圍染色質(zhì)分開，減少基因沉默［11］。Diamos等［12］發(fā)現(xiàn)基質(zhì)附著區(qū)Rb7通過動態(tài)結(jié)合核基質(zhì)調(diào)控臨近基因表達，在表達載體終止子后插入基質(zhì)附著區(qū)Rb7使得報告基因GFP表達增強。轉(zhuǎn)錄后基因沉默是重組蛋白表達低的原因之一，添加RNA沉默抑制因子能減少外源基因轉(zhuǎn)錄后基因沉默從而提高重組蛋白表達［13］。來自葡萄卷葉相關(guān)病毒2（GRLaV2）的p24蛋白被鑒定為一種強沉默抑制因子，能阻止植物中雙鏈反向重復序列誘導沉默［14］。目前關(guān)于表達載體中影響外源基因表達的單個元件研究較多，而多個作用元件組合效應如何影響外源基因表達的研究卻很少。

農(nóng)桿菌侵染和轉(zhuǎn)化過程中，多種因素可以影響農(nóng)桿菌介導的重組載體轉(zhuǎn)化效率，從而影響外源基因的瞬時表達［15］，例如，Diamos等［12］比較農(nóng)桿菌菌株GV3101、EHA105和LBA4301發(fā)現(xiàn)，EHA105介導的轉(zhuǎn)化可獲得更高的蛋白表達。李曉君等［16］研究pCambia1304載體侵染的最佳注射液濃度OD600在0.3-0.7時均有較高的轉(zhuǎn)化效率，而孫春蓮等［17］發(fā)現(xiàn)pCB302載體的最佳注射液濃度OD600在0.8-1.0之間。因此，不同轉(zhuǎn)化菌株的選擇、不同菌液注射液濃度的選擇，也是提高瞬時轉(zhuǎn)化中外源蛋白表達的一些重要因素。

因此，本研究在前人研究的基礎上，篩選和獲得有效提高外源基因表達的6個作用元件（包括煙草葉片特異型啟動子rbcS、AtPsaK基因上游63 bp的5'UTR、終止子Ext、CaMV35S 3'UTR、基質(zhì)附著區(qū)Rb7和RNA沉默抑制因子p24），在植物雙元表達載體pCambia1300骨架基礎上，來分析不同元件的添加及相互組合，是否可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平有效的提高外源蛋白（eGFP為報告基因）在瞬時表達系統(tǒng)的表達量；并進一步結(jié)合最佳注射液濃度的探索，以期構(gòu)建新的可以快速高效的表達外源基因的植物瞬時表達體系，從而進一步拓寬瞬時表達體系在基因功能探究和重組蛋白表達方面應用，以及為研究載體中能夠有效提高外源基因表達的元件功能及其組合效應提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本氏煙草（Nicotianabenthamiana）、擬南芥（Columbia 0，哥倫比亞生態(tài)型）。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株:EHA105；大腸桿菌（Escherichia coli）菌 株 DH5α。pCambia1300、pCambia1301、pGreen-0000、pGreen0801、pEHQ-HT載體均為本實驗室保存。pEff載體購自Addgene。

1.1.3 試劑和引物 限制性內(nèi)切酶和Gflex高保真酶均購自NEB有限公司；CE重組酶和RNA提取試劑盒購自諾唯贊公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購自天根公司；luciferin和鼠源GFP抗體購自Sigma公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購自雅酶公司。引物合成及測序分別由英濰捷基和上海派森諾公司完成，所用引物序列見表1。

表1 引物序列及信息

1.1.4 儀器 96孔PCR儀（Thermo Fisher）；定量PCR儀（Roche）；凝膠成像儀（Bio-Rad）；激光共聚焦顯微鏡（Leica）；Tanon-5200化學發(fā)光成像儀（Tanon）。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)控元件的篩選和克隆 根據(jù)已報道的煙草葉片組織特異型核酮糖1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶啟動子（rbcS啟動子）基因序列［18］，擬南芥 AtPsaK上 游 63 bp 5' UTR序列［19］以及質(zhì)粒pCambia1301中CaMV35S序列，采用NCBI Primer設計重疊PCR引物（表1）。用CTAB法提取煙草基因組DNA，并以基因組和質(zhì)粒pCambia1301-eGFP為模板克隆獲得rbcS啟動子和CaMV35S啟動子，并合成AtPsaK 5' UTR，后以克隆產(chǎn)物為模板通過重疊PCR獲得PrbcS-35S-UTR融合片段。根據(jù)已報道的煙草細胞壁延伸因子Ext 3' UTR［9］，基質(zhì)附著區(qū)Rb7［20］和 CaMV35S 3' UTR［21］序列，分別以煙草基因組，質(zhì)粒pEHQ-HT為模板，通過表1引物分別克隆獲得Ext 3' UTR，CaMV35S 3' UTR和Rb7，并通過重疊PCR分別獲得Ext-35S 3' UTR（EU）和Ext-35S 3' UTR-Rb7（EUR）。參照 Mardanova等［13］的方法，以pEff載體為模板，采用NCBI Primer設計引物p24-Fw/p24-Rv，PCR擴增獲得35S-p24-NOS片段。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，對大小正確的基因片段用DNA凝膠回收試劑盒進行回收。

1.2.2 重組載體構(gòu)建與鑒定 首先將獲得的EU和EUR連入酶切好的pCambia1300載體，獲得pEU和pEUR中間載體。然后用EcoRI和SpeI酶切載體，通過CE重組酶將PrbcS-35S-UTR連入載體獲得pREU和pREUR載體。在pREUR載體基礎上，將從pEff載體上克隆的35S-p24-NOS連入，獲得pREUR-p24載體。以pCambia1301載體為模板，克隆eGFP標簽并通過CE重組酶連入pGreen0000載體，以此為模板設計引物克隆獲得eGFP標簽和FLAG標簽（eGFP-2×FLAG）。然后將eGFP-2×FLAG連入中間載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并將陽性重組質(zhì)粒送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司進行測序。構(gòu)建成功的重組表達載體命名為pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF。

1.2.3 煙草葉片轉(zhuǎn)化［22］將 pCambia1301-eGFP、pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF重組質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，28℃暗培養(yǎng)3 d后，挑取單克隆，在含有卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至菌液OD600達0.8時收集菌體，用含有10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和200 μmol/L乙酰丁香酮的緩沖液重懸菌體，稀釋至OD600值為0.3，室溫靜置3 h后，用去掉針頭的注射器注射4周大的煙草葉片。分別稀釋至OD600值為0.2、0.3、0.4、0.5，注射煙草葉片。

1.2.4 重組蛋白提取及SDS-PAGE電泳 比較農(nóng)桿菌侵染煙草葉片48 h后，取注射部位的葉片進行熒光觀察。收集侵染后48 h的煙草葉片，以液氮處理后于研缽中研磨成粉，取樣品100 mg，加入1 mL蛋白提取液（25 mmol/L磷酸鈉緩沖液pH7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1% TritonX-100，10 mg/mL抗壞血酸鈉，0.3 mg/mL PMSF），顛倒裂解30 min后，12 000×g離心10 min，取上清提取總蛋白粗提液。使用雅酶SDS-PAGE凝膠試劑盒配制10%凝膠，將蛋白粗提液與5×SDS loading按4∶1比例混合沸水煮10 min后，12 000×g離心3 min，取10 μL上清進行SDS-PAGE凝膠電泳，并取1 μL上清用5×SDS loading稀釋至10 μL后進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后進行Western-blot分析，使用鼠源GFP抗體進行檢測。以rbcS小亞基為內(nèi)參，使用Image J軟件對SDS-PAGE凝膠GFP目的條帶進行灰度值分析。

1.2.5 煙草葉片RNA提取與定量PCR分析 取100 mg研磨后的樣品，加入1 mL Trizol室溫裂解5 min，后加入200 μL氯仿充分混勻，室溫靜置3 min后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取400 μL上清至1.5 mL離心管中，加入200 μL無水乙醇，吹打混勻后將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，后續(xù)操作參照諾唯贊植物總RNA提取試劑盒說明書進行。使用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒對獲得的RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，稀釋至100 ng/μL，以此為模板進行定量PCR實驗。定量PCR使用編碼GFP基因上的特異引物（qeGFPFw/qeGFP-Rv），內(nèi)參基因選用延伸因子1a（EF1a），其擴增引物為EF-Fw和EF-Rv，每個樣品進行3次生物學重復實驗。

1.2.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測實驗［23］將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pREUR-eGFP-MYB80和proUNDEAD-Luc轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，28℃暗培養(yǎng)3 d后，挑取單克隆，過夜培養(yǎng)至菌液OD600達0.8時收集菌體，用重懸緩沖液重懸菌體稀釋至OD600值為1。轉(zhuǎn)錄因子和啟動子按4∶1比例混合，室溫靜置3 min后注射煙草葉片。弱光培養(yǎng)36 h后取煙草葉片，在葉片上加100 mmol/L的luciferin，涂布均勻后放置5 min，于Tanon-5200化學發(fā)光成像儀下檢測信號。

2 結(jié)果

2.1 瞬時表達載體元件克隆與構(gòu)建

本研究設計主要從啟動子、5' UTR、終止子、基質(zhì)附著區(qū)和RNA沉默抑制因子五個方面篩選和添加作用元件（圖1-A）。首先通過PCR克隆獲得了煙草葉片組織特異型啟動子rbcS，組成型啟動子CaMV35S，高效終止子元件Ext和CaMV35S 3'UTR，以及能增強外源基因表達的基質(zhì)附著區(qū)Rb7和減少轉(zhuǎn)錄后基因沉默的RNA沉默抑制因子p24（圖1-B）。然后對各個載體元件按照圖1-A進行了組裝，分別獲得pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF載體。用目的片段上特有的SacI酶切位點和載體上的SpeI酶切位點雙酶切重組質(zhì)粒，出現(xiàn)2個與預期值相符的DNA片段（大小約為10 kb和750 bp），證明重組載體構(gòu)建成功（圖1-C）。

2.2 重組表達載體活性分析

根據(jù)1.2.3實驗方法分別將pREU-EF、pREUREF和pREUR-p24-EF 3個重組表達載體轉(zhuǎn)化煙草葉片，48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡分析煙草葉片中報告基因GFP的表達情況。結(jié)果（圖2）表明，在細胞質(zhì)、細胞核、細胞膜中均能觀察到GFP的表達，初步說明構(gòu)建的3個瞬時表達載體都能在煙草葉片中穩(wěn)定工作。

圖1 重組表達載體構(gòu)建及驗證

圖2 重組表達載體侵染后煙草葉片中GFP表達分析

2.3 作用元件組合與目標蛋白表達相關(guān)性分析

為探究不同作用元件組合對外源蛋白表達的影響，對侵染48 h后的煙草葉片中報告基因表達進行分析。qRT-PCR結(jié)果（圖3-A）顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上PrbcS-35S-UTR和EUR-p24元件組合相比pCambia1301載體中CaMV35S啟動子和NOS終止子組合使GFP表達提高28倍，相比PrbcS-35S-UTR和EU與EUR元件組合分別提高7倍和1.4倍，說明增加的作用元件能在轉(zhuǎn)錄水平上顯著提高報告基因表達，并且在終止子后插入基質(zhì)附著區(qū)Rb7和RNA沉默抑制因子均能提高GFP的轉(zhuǎn)錄能力。

SDS-PAGE凝膠Image J灰度值分析結(jié)果表明，在蛋白水平上pREUR-EF和pREUR-p24-EF相比pREU-EF增強2倍和1.7倍（圖3-B-3-D），說明終止子后Rb7的插入能增強蛋白表達能力，但再增加p24后GFP表達并沒有顯著性變化（圖3-D）。

2.4 菌液注射液濃度對GFP瞬時表達效率的影響

為分析菌液注射濃度對重組載體中外源蛋白表達的影響，對注射不同菌液濃度（載體pREUR-EF，菌液濃度:0.2-0.5，轉(zhuǎn)化48 h）的煙草葉片中報告基因的表達進行了檢測分析。定量PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄水平上報告基因GFP的表達量隨著注射液濃度升高而逐漸增強（圖4-A）。

SDS-PAGE凝膠Image J灰度值結(jié)果（圖4-B-4-D）分析顯示，OD600為0.4時，報告基因的蛋白水平信號相對最強。結(jié)果說明，菌液注射液濃度也是影響外源蛋白表達的重要因素。

2.5 重組表達載體在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中的應用

為驗證改造的瞬時表達系統(tǒng)是否可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控Dual-Luciferase分析，將擬南芥花藥特異表達的轉(zhuǎn)錄因子AtMYB80和AMS（ABORTED MICROSPORES）分別連入pREUR-EF載體，來驗證AtMYB80對其下游基因天冬氨酸蛋白酶UNDEAD轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。Effector和Reporter載體構(gòu)建示意如圖5-A所示。農(nóng)桿菌侵染煙草葉片36 h后，可在細胞核中觀察到AtMYB80的表達（圖5-B）。Tanon-5200化學發(fā)光成像儀信號檢測結(jié)果顯示，只有Effector時只有本底信號，加入pREUR-eGFP-MYB80后引起Luc信號增強，但是加入AMS轉(zhuǎn)錄因子并不能使信號增強（圖5-C），這個結(jié)果與此前報道利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)在植物體內(nèi)研究結(jié)果一致，說明構(gòu)建的表達體系可用于Dual-Luciferase系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。

圖3 對比分析不同元件對報告基因GFP表達的影響

圖4 對比分析不同注射液濃度對pREUR-EF載體中報告基因GFP表達的影響

3 討論

圖5 轉(zhuǎn)錄因子MYB80對UNDEAD的調(diào)控分析

植物瞬時表達系統(tǒng)具有廣泛應用，既可以用于快速研究基因功能，也可以用于獲取重組蛋白。已有研究表明，目的蛋白性質(zhì)、宿主、表達載體系統(tǒng)、密碼子偏好性、轉(zhuǎn)化條件等因素都會影響外源蛋白表達［4］。表達載體系統(tǒng)中各作用元件的優(yōu)化一直是進一步提高外源蛋白的研究熱點。在本研究中，我們挖掘和比較文獻中不同作用元件對外源蛋白表達影響，篩選和克隆獲得可以用于表達載體改造的6個相關(guān)作用元件（包括煙草葉片特異型啟動子rbcS、AtPsaK基因上游63 bp的5' UTR、終止子Ext、CaMV 35S 3' UTR、基質(zhì)附著區(qū)Rb7和RNA沉默抑制因子p24）。其中，煙草葉片特異型啟動子rbcS和組成型啟動子CaMV35S及基質(zhì)附著區(qū)Rb7主要從轉(zhuǎn)錄水平提高外源基因表達，克隆自光系統(tǒng)小亞基K的5' UTR及細胞壁Extensin和煙草花葉病毒35S的3'UTR既能影響外源基因mRNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性，也能影響外源基因的翻譯效率。沉默抑制因子p24主要通過減少RNA沉默從轉(zhuǎn)錄后水平提高外源基因表達［13］。因此，我們組裝的瞬時表達載體可以從多個層次改善外源基因的表達，這為表達載體的改良提供了新的思路。

啟動子是影響外源基因表達的關(guān)鍵作用元件，孫家利等［18］發(fā)現(xiàn)煙草葉片特異型啟動子rbcS驅(qū)動外源基因表達能力強于組成型啟動子CaMV35S。表達載體中5' UTR被用作翻譯增強子［8］，像苜蓿花葉病毒（AMV）的5' UTR［24］，煙草花葉病毒的Ω序列等［25］，Diamos等［8］發(fā)現(xiàn)將來源擬南芥基因組AtPsaK 5' UTR插入CaMV35S啟動子后能增強GFP翻譯效率。雙終止子串聯(lián)能在瞬時表達系統(tǒng)中有效提高基因表達［21］，Beyene等［10］發(fā)現(xiàn)將CaMV35S和NOS終止子串聯(lián)使用能顯著提高基因表達，Yamamoto等［21］也發(fā)現(xiàn)將Ext終止子和HSP終止子串聯(lián)使用可以獲得更多的GFP蛋白。在本研究中，通過轉(zhuǎn)錄水平（qRT-PCR）和蛋白水平（SDS-PAGE）分析表明，我們發(fā)現(xiàn)相比于常用的以CaMV35S啟動子驅(qū)動，以NOS為終止子的載體，采用組織特異型rbcS啟動子和CaMV 35S組成型啟動子及AtPsaK 5'UTR串聯(lián)驅(qū)動，輔以Ext和35S 3' UTR作為終止子元件的載體能顯著提高外源基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究表明，基質(zhì)附著區(qū)能減少轉(zhuǎn)基因沉默［26］，Ji等［27］發(fā)現(xiàn)TM6能減少臨近基因啟動子區(qū)的甲基化從而提高煙草中重組蛋白表達。我們的定量結(jié)果表明，在雙終止子之后插入基質(zhì)附著區(qū)Rb7后，GFP轉(zhuǎn)錄顯著增強，蛋白表達提高。轉(zhuǎn)錄后基因沉默是影響外源蛋白積累的常見因素，Mardanova等［13］研究發(fā)現(xiàn)，將RNA沉默抑制因子p24插入pEff載體后，相對不添加p24的載體，GFP表達提高3倍。我們的結(jié)果表明，p24插入載體后，GFP在轉(zhuǎn)錄水平上提高1.4倍，但是蛋白水平上GFP表達沒有顯著性差異，我們認為這可能與我們?nèi)〔臅r間較早有關(guān)，隨著體內(nèi)表達時間的延長，含有RNA沉默抑制因子的pREUR-p24-EF載體可能會獲得更高的蛋白積累。我們的研究結(jié)果表明，外源基因表達水平與高效作用元件的組合具有正相關(guān)性。Sheludko認為農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化中適合的注射液濃度OD600在0.1-1.5之間［4］，我們的結(jié)果顯示菌液注射液濃度OD600為0.4左右時，可以獲得更高的外源基因表達。

Phan等［28］利用體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)證明，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtMYB80能結(jié)合到天冬氨酸蛋白酶UNDEAD基因的啟動子區(qū)從而正向調(diào)控該基因表達。本研究將AtMYB80轉(zhuǎn)錄因子插入pREUR-EF瞬時表達系統(tǒng)進行Dual-Luciferase實驗，其結(jié)果與該ChIP-PCR結(jié)果一致。該系統(tǒng)相比其他用于Dual-Luciferase實驗的瞬時表達載體的優(yōu)勢在于在轉(zhuǎn)化過程中不需要與含有RNA沉默抑制因子的pSoup-p19載體共轉(zhuǎn)化，并且增加eGFP標簽后可實時監(jiān)測轉(zhuǎn)錄因子表達情況。此外，由于該瞬時表達載體具有更高的表達效率，可縮短體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的實驗進程。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了含有eGFP和FLAG標簽的高效的瞬時表達載體pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF，定量實驗證實了影響載體表達的作用元件組合與外源基因表達具有正相關(guān)性，高效作用元件的組合使用可以提高瞬時表達載體的穩(wěn)定性和外源基因表達。此外，對菌液注射液濃度的探索進一步完善了瞬時表達體系研究。采用上述優(yōu)化載體和最佳注射濃度可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。