馮逸龍 張文利

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095）

鳥嘌呤（G）四聯(lián)體，又稱作G-quadruplex或G4等，廣泛存在于生物體基因組中。它是由富含G串聯(lián)重復(fù)序列的DNA或RNA折疊形成的一種高級結(jié)構(gòu)。相同或不同平面的G主要是以CGC三聯(lián)體形式，通過Hoogsteen氫鍵相互連接形成了一種更加穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)［1］。DNA-G4假設(shè)模型最早于1958年被提出，但直到1962年才由Gellert 等［2］通過X-Ray手段證實(shí)了該模型的真實(shí)性。由于受到當(dāng)時(shí)研究手段的制約，人們對G4結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能認(rèn)識非常有限。直到20世紀(jì)90年代，一系列用于體內(nèi)外檢測G4位點(diǎn)的物理、生化以及免疫學(xué)等相關(guān)檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，G4結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能重新引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，人和動(dòng)物G4研究已成為人類疾病治療和藥物基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

目前已有的研究結(jié)果表明，生物體G4具有一系列重要的生物學(xué)功能，如穩(wěn)定染色質(zhì)狀態(tài)［3-4］、參與細(xì)胞周期［5］、調(diào)節(jié)離子跨膜運(yùn)輸［6］、參與表觀遺傳調(diào)控［7-11］、調(diào)控基因表達(dá)［9，12-13］以及參與DNA損傷和修復(fù)［14］等。尤為重要的是，G4現(xiàn)已作為潛在的靶標(biāo)位點(diǎn)用于人類疾病治療［15-19］。例如，I期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，小分子合物CX-5461用于治療因BRCA1/2缺陷而引起的腫瘤是與它可以穩(wěn)定體內(nèi)G4有關(guān)［20］。與人及動(dòng)物G4研究相比，植物G4的鑒定及其生物學(xué)功能研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后。目前，除G4-seq被首次用于在全基因組水平鑒定擬南芥G4位點(diǎn)外，多數(shù)植物G4的位點(diǎn)還主要依賴于生物信息學(xué)方法，根據(jù)形成G4的核心序列在全基因組水平進(jìn)行預(yù)測［21］，這種預(yù)測的準(zhǔn)確性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

根據(jù)含有預(yù)測G4位點(diǎn)相關(guān)的植物基因功能聚類分析結(jié)果，植物G4也可能具有一系列重要的生物學(xué)功能，如參與基因表達(dá)調(diào)控［22］、脅迫響應(yīng)［23-25］和調(diào)節(jié)植物正常生長發(fā)育［26］等。本文系統(tǒng)總結(jié)了生物體G4研究方法；重點(diǎn)綜述了人和動(dòng)物G4的生物學(xué)功能及其最新研究進(jìn)展；最后對植物G4研究進(jìn)行了總結(jié)和展望。

1 G4的主要研究方法

目前，廣泛用于體內(nèi)外G4研究的方法主要有:物理學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)和基因組學(xué)等。根據(jù)每次檢測G4位點(diǎn)數(shù)量，這些方法可分為每次檢測數(shù)量有限的低通量法和在全基因組水平進(jìn)行研究的高通量法兩大類。

1.1 物理學(xué)方法

研究G4結(jié)構(gòu)的物理學(xué)方法主要包括表面離子共振法（Surface plasmon resonance，SPR）、光譜檢測法以及毛細(xì)管電泳法（Capillary electrophoresis，CE）等。其中，光譜法主要有圓二色譜法（Circular dichroism，CD）、熒光光譜法（Fluorescence spectrum，F(xiàn)S）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）、核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）及X-射線晶體衍射（X-ray diffraction by crystals）等［27］。1962 年，Gellert 等［2］通過對DNA片段進(jìn)行高溫變性后緩慢復(fù)性處理在體外重建了G4結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用X-Ray的方法首次拍攝到G4四鏈結(jié)構(gòu)。2002年，Cary 等［28］通過X-射線晶體衍射證實(shí)了染色體端粒的G重復(fù)序列也能形成G4結(jié)構(gòu)。由于G4結(jié)構(gòu)在260 nm處有一個(gè)明顯的吸收峰，Garg等［7，29］利用圓二色譜手段證實(shí)了G4廣泛存在于多種植物基因組中。熒光共振能量轉(zhuǎn)移法主要是利用具有類似激發(fā)波長的外源競爭物引起熒光標(biāo)記的G4序列發(fā)生熒光偏移來鑒定G4結(jié)構(gòu)。Xu等［20］通過該方法鑒定了CX-5461可作一種有前景的藥物用于癌癥的治療；2018年，Chen等［30］利用核磁共振方法證明了DEAH/RHA解旋酶DHX36通過解除G4結(jié)構(gòu)參與調(diào)節(jié)基因組中G4相關(guān)的生物學(xué)功能。有報(bào)道表明，遠(yuǎn)紅外探針方法也可用于G4結(jié)構(gòu)的鑒定［31］。目前，圓二色光譜法廣泛用于驗(yàn)證基因組中預(yù)測的或經(jīng)其它手段鑒定的G4位點(diǎn)［32］。物理學(xué)方法檢測G4具有快速準(zhǔn)確，適用性較大等優(yōu)點(diǎn)；但該方法需要借助一些特殊或較昂貴的儀器設(shè)備，并且每次鑒定的G4數(shù)量有限，不適于大批量的鑒定G4位點(diǎn)。因此物理學(xué)方法檢測G4結(jié)構(gòu)雖可行，但很難在不具備條件的實(shí)驗(yàn)室或科研院所全面推廣。

1.2 生物化學(xué)方法

研究G4結(jié)構(gòu)的生物化學(xué)法主要有硫酸二甲酯印跡法（Dimethylsulfate，DMS）、凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）和 DNA聚合酶終止法（DNA polymerase stop assay）等［33］。

DMS常與EMSA結(jié)合來檢測或驗(yàn)證G4，其原理主要是對含有G4的DNA片段進(jìn)行DMS甲基化處理，DMS可使非G4中的G甲基化，但G4中的G因受Hoogsteen氫鍵保護(hù)而不能被DMS甲基化，然后利用六氫吡啶對DMS處理后的寡核苷酸片段進(jìn)行差異性切割，寡核苷酸片段中甲基化的鳥嘌呤受六氫吡啶特異性化學(xué)切割而發(fā)生斷裂，而六氫吡啶不能化學(xué)切割G4中未被甲基化的G，最后利用變性PAGE分離經(jīng)六氫吡啶處理后的寡核苷酸片段，根據(jù)片段大小推斷寡核苷酸片段中形成G4的位置。Armond等［34］應(yīng)用該方法證實(shí)了缺氧誘導(dǎo)因子1R啟動(dòng)子中存在G4結(jié)構(gòu)。

DNA聚合酶終止法的原理:DNA聚合酶在DNA模板鏈上移動(dòng)過程中，受G4結(jié)構(gòu)的阻礙從模板上脫落而終止反應(yīng)，導(dǎo)致所擴(kuò)增DNA片段長短不一，然后通過PAGE電泳分離目的片段，根據(jù)片段大小推斷DNA模板中形成G4的位置。反應(yīng)中加入K、Na等一價(jià)金屬陽離子及PDS或PEG等小分子化合物可穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu)，以增加反應(yīng)效果［35-39］。該方法已應(yīng)用于部分G4位點(diǎn)的鑒定和驗(yàn)證［21］。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)主要運(yùn)用含有G4的熒光標(biāo)記的序列及探針在PAGE電泳中的遷移速度不同，進(jìn)行目的片段分離，該方法常結(jié)合聚合酶終止法鑒定或驗(yàn)證G4位點(diǎn)［40-42］。另外，G4結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與其loop的長度有關(guān)，正向平行及適當(dāng)?shù)膌oop長度將有助于增加G4穩(wěn)定性［43］。

DMS、EMSA以及DNA聚合酶終止法有著適用性廣、結(jié)果準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn)，可適用于多數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展G4相關(guān)研究，但每次鑒定G4位點(diǎn)數(shù)量有限，屬于低通量鑒定方法。

1.3 免疫學(xué)方法

檢測G4的免疫學(xué)方法主要是基于D1、1H6、hf2和BG4等特異結(jié)合G4抗體的制備及應(yīng)用［5］。它主要包括免疫熒光檢測法和免疫點(diǎn)雜交法兩種。2013年Biffi 等［5］利用重組BG4抗體鑒定了細(xì)胞分裂時(shí)期G4位點(diǎn)并觀察了其分布。同樣，D1與1H6抗體也被應(yīng)用于細(xì)胞水平識別G4結(jié)構(gòu)［44］。例如，Henderson 等［45］通過基于1H6抗體的熒光染色方法檢測了人和小鼠細(xì)胞G4，同時(shí)證實(shí)了FANCJDNA解旋酶能夠清除基因組G4結(jié)構(gòu)。hf2抗體用于檢測c-kit原癌基因啟動(dòng)子區(qū)平行G4結(jié)構(gòu)［46］。上述幾種抗體均有被用于檢測G4結(jié)構(gòu)的報(bào)道，但是每種抗體識別細(xì)胞核內(nèi)G4結(jié)構(gòu)的特異性方面存在一定的差異。D1抗體對平行性G4結(jié)構(gòu)具有很高的親和性，但不能用于檢測反向平行和雜合G4結(jié)構(gòu)，也不能結(jié)合雙鏈DNA、隨機(jī)單鏈DNA和DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)等［47］；1H6抗體對多數(shù)G4結(jié)構(gòu)具有廣譜親和性，如對分子內(nèi)或分子間G4結(jié)構(gòu)均具有相似的結(jié)合力，但對分子間RNA G4結(jié)構(gòu)和DNA三鏈結(jié)構(gòu)親和力低，不結(jié)合由［AGGG（TTAGGG）3］序列組成的分子內(nèi)G4結(jié)構(gòu)，也不結(jié)合任何不能形成G4的單鏈或雙鏈DNA［45］；hf2抗體對 DNA G4結(jié)構(gòu)的結(jié)合力比對雙鏈DNA的結(jié)合力強(qiáng)1 000倍以上，并且對兩種分子內(nèi)相關(guān)的平行性G4結(jié)構(gòu)的結(jié)合力相差100倍，因此該抗體對不同G4結(jié)構(gòu)具有選擇性識別作用［46］；BG4抗體對分子內(nèi)和分子間DNA G4結(jié)構(gòu)具有高的親和力，包括平行和反平行G4等，但不結(jié)合RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及單鏈或雙鏈DNA［5］。因此，可以針對每種抗體對G4結(jié)構(gòu)的結(jié)合特性，選擇性研究細(xì)胞核內(nèi)某一類或幾類的G4結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能。目前，只有BG4抗體結(jié)合高通量測序被廣泛用于全基因組水平G4的鑒定和相關(guān)生物學(xué)功能研究。其它幾種抗體能否用于在全基因組水平鑒定G4結(jié)構(gòu)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

免疫學(xué)方法能夠識別體內(nèi)生理狀態(tài)下G4位點(diǎn)，相對簡單易操作，也可在全基因組水平鑒定G4位點(diǎn)，但該方法依賴于抗體的特異性，并且不能分辨G4在基因組內(nèi)分布的詳細(xì)信息，相關(guān)抗體在不同物種間的通用性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.4 G4基因組學(xué)方法

目前，在全基因組水平鑒定G4位點(diǎn)的高通量方法主要有ChIP-Seq和G4-Seq兩種方法。其中，G4-Seq的原理是DNA聚合酶在合成DNA新生鏈過程中，G4結(jié)構(gòu)的存在可阻止聚合酶的移動(dòng)并導(dǎo)致新合成DNA鏈中G4位點(diǎn)處產(chǎn)生錯(cuò)配堿基，結(jié)合二代測序數(shù)據(jù)，在全基因組水平通過鑒定錯(cuò)配堿基來鑒定G4位點(diǎn)［21］。目前，該方法已經(jīng)用于在全基因組水平鑒定了擬南芥等12個(gè)動(dòng)植物G4位點(diǎn)，與之相類似的方法也可以用于鑒定RNA G4位點(diǎn)［48-49］。通過多物種比較分析發(fā)現(xiàn)，G4位點(diǎn)既具有一定的物種特異性，又呈現(xiàn)發(fā)育時(shí)期特異性［21，48-50］。另一類基于特異識別G4抗體的ChIP-Seq 方法也被廣泛用于全基因組水平鑒定G4。與交聯(lián)ChIP-seq方法相似，該方法主要技術(shù)流程包括:首先對受試細(xì)胞系或組織材料進(jìn)行交聯(lián)處理，再將交聯(lián)染色質(zhì)進(jìn)行片段化處理成大小適宜的染色持片段，隨后進(jìn)行基于抗體如BG4的染色質(zhì)免疫共沉淀反應(yīng)，最后將抗體特異結(jié)合的G4 DNA進(jìn)行解交聯(lián)，純化經(jīng)抗體富集的G4 DNA用于高通量測序，經(jīng)生物信息學(xué)分析鑒定全基因組G4位點(diǎn)。目前該方法成功的應(yīng)用于鑒定人體癌癥細(xì)胞系的G4位點(diǎn)［32］，發(fā)現(xiàn)G4位點(diǎn)具有部分調(diào)控染色質(zhì)特性，如與基因組中部分開放性染色質(zhì)位點(diǎn)（ATAC）共分布，并且G4與核小體松緊程度成正相關(guān)［51］。

G4-Seq主要利用G4空間結(jié)構(gòu)所具有特性在DNA水平鑒定G4位點(diǎn)，因此該方法不受物種限制，適用性較廣，但該方法主要用于體外鑒定G4，不能真正反應(yīng)生理狀態(tài)下的G4位點(diǎn)；基于G4抗體的ChIP-Seq方法具有特異性較強(qiáng)，可以用于體內(nèi)外鑒定G4位點(diǎn)，但該方法易受抗體特異性影響，并且抗體在不同物種間的通用性還有待于驗(yàn)證。

2 人和動(dòng)物基因組中G4生物學(xué)功能

現(xiàn)階段人及動(dòng)物的相關(guān)研究結(jié)果表明，G4主要影響染色質(zhì)及基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、調(diào)控基因表達(dá)、調(diào)節(jié)離子跨膜運(yùn)輸及參與表觀互作等方面（圖1）。

2.1 影響染色質(zhì)及基因組穩(wěn)定性

端粒及著絲粒區(qū)域的富G序列能夠形成G4結(jié)構(gòu)［28，52］。G4是端粒DNA中富含G序列形成的一種特殊二級結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定G4可以有效阻止端粒酶與端粒DNA相結(jié)合從而抑制端粒延伸。應(yīng)用促進(jìn)G4的形成或穩(wěn)定的配合體或小分子合物來抑制端粒酶活性，最終可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和繁殖以達(dá)到抗癌目的，這是基于G4的藥物基因組學(xué)和癌癥治療的主要關(guān)注點(diǎn)之一。因此，端粒G4的形成和穩(wěn)定導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性增加。另一方面，由于G4結(jié)構(gòu)具有抵制外切核酸酶對端粒DNA的切割作用，從而有利于維持端粒的穩(wěn)定性。例如，酵母基因組中因缺失一種端粒加帽蛋白復(fù)合體Cdc13導(dǎo)致端粒不穩(wěn)定性增加，但是G4結(jié)構(gòu)的存在可顯著降低這種端粒的不穩(wěn)定性［53］。另外，G4在正常的DNA雙鏈的某一條單鏈上出現(xiàn)會(huì)造成DNA鏈的斷裂，造成基因組的不穩(wěn)定［14］?？傊?，G4對染色質(zhì)及基因組穩(wěn)定性具有雙重調(diào)節(jié)功能。

2.2 調(diào)控基因表達(dá)

G4既可以介導(dǎo)全基因組水平基因表達(dá)變化，也可以調(diào)節(jié)單個(gè)基因位點(diǎn)表達(dá)水平。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果顯示，G4穩(wěn)定性配體TMPyP4通過增加人腫瘤細(xì)胞中G4穩(wěn)定性來改變1 200個(gè)基因表達(dá)水平［54］。G4可直接參與調(diào)控基因表達(dá)。在DNA轉(zhuǎn)錄時(shí)，DNA模板鏈上G4通過阻斷RNA聚合酶移動(dòng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄停滯甚至終止，從而降低了基因的表達(dá)量［55-56］；3' UTR區(qū)G4通過阻止RNA聚合酶II移動(dòng)而及時(shí)終止轉(zhuǎn)錄，防止了通讀現(xiàn)象的發(fā)生。mRNA G4可阻礙翻譯機(jī)器核糖體的結(jié)合或移動(dòng)，從而降低或終止mRNA翻譯過程，導(dǎo)致蛋白表達(dá)量降低和基因沉默［48-49，57］。

其次，G4可通過與一些因子互作來間接調(diào)控基因表達(dá)。PPL3C等有機(jī)物質(zhì)通過與c-MYC和BCL-2啟動(dòng)子區(qū)G4結(jié)合，降低這兩個(gè)基因的表達(dá)量［7］；原癌基因MYC和RAS啟動(dòng)子G4可顯著下調(diào)基因表達(dá)，這主要是由于G4區(qū)含有轉(zhuǎn)錄因子SP1結(jié)合位點(diǎn)，G4形成將不利于轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合，從而抑制了該轉(zhuǎn)錄因子對基因表達(dá)的促進(jìn)作用［58］。白屈菜赤堿通過抑制啟動(dòng)子區(qū)G4的形成，降低VEGFA、BCL2和KRAS基因的表達(dá)［12］，不過串聯(lián)的G4仍然影響相關(guān)的基因表達(dá)［13］；另外，在全基因組水平，G4可通過影響其附近染色質(zhì)水平變化來調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)［52］。

最后，microRNA前體中G4結(jié)構(gòu)也可間接參與調(diào)控基因表達(dá)。TmPyP4通過破壞miRNA-149前體中G4結(jié)構(gòu)使癌細(xì)胞中成熟的miRNA-149濃度升高，進(jìn)而降低其靶蛋白蛋白ZBTB2的表達(dá)量，最終抑制癌細(xì)胞增殖［59］。最新研究結(jié)果顯示，在染色質(zhì)三維水平，G4明顯富集于拓?fù)潢P(guān)聯(lián)區(qū)（TAD），并且G4序列富集一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，從而暗示G4既可以調(diào)控附近基因表達(dá)也可以通過染色質(zhì)成環(huán)而遠(yuǎn)程調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)［60］。總之，G4可直接和間接影響基因表達(dá)。目前G4對基因表達(dá)調(diào)控的研究還仍然有限，特別是G4調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)理還有待于深入研究。

2.3 影響疾病發(fā)生

目前發(fā)現(xiàn)與G4有關(guān)的神經(jīng)性疾病至少有30種［61］。其中解旋酶功能缺陷相關(guān)的疾病有9種［62］，如解旋酶XPB/XPD作為TFIIH主要組成成份之一，通過與G4結(jié)合參與核酸切除修復(fù)，其功能缺陷導(dǎo)致色性干皮?。╔eroderma pigmentosum）；解旋酶FANCJ通過解除G4結(jié)構(gòu)，它與REV1聚合酶一起參與正常的DNA復(fù)制，其功能缺陷導(dǎo)致范可尼貧血癥（Fanconi anemia，F(xiàn)A）；解旋酶ATRX主要參與G4區(qū)域的染色質(zhì)重排［63］，其功能缺陷導(dǎo)致α地中海貧血伴隨智力低下癥（Alpha thalassemia with mental retardation）等。另外，人FMR1基因中CGG重復(fù)序列大量擴(kuò)增超過200次，擴(kuò)增后的CGG序列通過形成四聯(lián)體結(jié)構(gòu)影響FMR1基因表達(dá)，從而導(dǎo)致脆性X染色體綜合癥（Fragile X syndrome）。同樣，位于人基因組中第9號染色體上C9ORF72位點(diǎn)的一個(gè)基因，其GGGGCC重復(fù)序列的大量擴(kuò)增引起RNA或DNA水平G4結(jié)構(gòu)形成，從而下調(diào)該基因表達(dá)，導(dǎo)致兩種不同的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，一種是肌萎縮側(cè)索硬化（ALS），另一種是額顳癡呆（FTD）。另外，G4也可以通過影響一些癌癥相關(guān)基因的表達(dá)，它與人類一些癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［64-65］，但它也可以作為一種潛在的靶標(biāo)位點(diǎn)用于腫瘤等疾病的診斷和治療，從而為治療腫瘤等疾病藥物開發(fā)提供了契機(jī)。

2.4 影響表觀修飾

人基因組研究結(jié)果顯示，與非G4序列相比，G4對應(yīng)的DNA序列是低甲基化，這主要與G4結(jié)構(gòu)是通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）結(jié)合或向G4周圍序列擴(kuò)散有關(guān)［10］。在染色質(zhì)水平，G4可以作為基因組中表觀調(diào)控的靶標(biāo)位點(diǎn)，說明G4可影響對其附近的染色質(zhì)水平的表觀修飾。例如a-球蛋白基因的數(shù)量可變串聯(lián)重復(fù)區(qū)（VNTR）富含易形成G4結(jié)構(gòu)的G堿基序列，SWI/SNF染色質(zhì)重塑家庭的成員的ATRX可特異結(jié)合該G4序列，進(jìn)而招募有利于基因表達(dá)的激活性染色質(zhì)修飾，從而促進(jìn)a-球蛋白基因的表達(dá)［63］。另外，G4可以作為表觀遺傳調(diào)控元件影響基因啟動(dòng)子區(qū)附近的組蛋白修飾［66］。這樣，G4可以直接或間接影響局部DNA或染色質(zhì)等表觀修飾。

R-Loop即DNA單鏈及其對應(yīng)的DNA和RNA雜合鏈形成的一種三鏈結(jié)構(gòu)，它普遍于生物體基因組中。已有的研究結(jié)果表明，人和植物基因組中存在R-Loop和G4共分布現(xiàn)象［8，67］。基因啟動(dòng)子區(qū)域R-Loop和G4共存顯著抑制基因的轉(zhuǎn)錄，消除R-loop可降低這種抑制作用，從而說明R-loop可增強(qiáng)G4的作用［8］。在細(xì)胞分裂S期時(shí)，R-Loop可通過促進(jìn)G4的形成來抑制基因表達(dá)［68］；另外，G4通過穩(wěn)定R-Loop結(jié)構(gòu)參與DNA損傷修復(fù)［69］。不過，R-loop與G4間相互作用的模式或機(jī)制目前仍不是十分清楚。此外，G4結(jié)構(gòu)也可能參與人體細(xì)胞的離子跨膜運(yùn)輸過程［6］，DNA復(fù)制［70］、免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換和B細(xì)胞高頻突變［71］等重要的生物學(xué)過程。

圖1 G4在人和植物中的主要生物學(xué)功能

3 植物G4生物學(xué)功能

與人、動(dòng)物和酵母等基因組中G4研究相比，植物G4研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后。植物G4研究主要集中在基于生物信息學(xué)的預(yù)測分析上［72］。目前，利用生物信息手段預(yù)測了水稻、玉米和擬南芥等16種已測序的單雙子葉植物基因組中G4位點(diǎn)，并且利用CD和DNA聚合酶終止實(shí)驗(yàn)，在體外初步驗(yàn)證了水稻和擬南芥等4種植物基因組中部分G4序列［73-74］。另外，利用生物信息手段構(gòu)建了196種植物的G4數(shù)據(jù)庫，從而方便查詢相關(guān)植物基因組中可能存在的G4位點(diǎn)［72］。序列分析結(jié)果顯示，基因組中 G4的loop長度具有一定亞基因組分布傾向性，如G3L1-3和G3L1-7的G4結(jié)構(gòu)傾向于富集在啟動(dòng)子區(qū)。通過對單雙子葉植物基因組中含有G4序列的直系同源基因進(jìn)行功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因主要參與了基因表達(dá)調(diào)控、生殖發(fā)育、離子等跨膜運(yùn)輸、能量代謝以及體內(nèi)外脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程［73-74］，說明G4同樣參與了植物一些基本生物學(xué)過程。Marsico等［21］利用G4-seq在全基因組水平鑒定了擬南芥G4位點(diǎn)，并對其序列特征進(jìn)行了初步分析，但并未涉及G4相關(guān)的生物學(xué)功能研究。因此，植物基因組中DNA G4的生物學(xué)功能以及相關(guān)的作用機(jī)制研究還有待于深入開展。

同樣，RNA G4具有調(diào)控植物基因表達(dá)和正常生長發(fā)育等生物學(xué)功能。例如，SMXL4/5基因mRNA未形成G4時(shí)，SMXL4/5蛋白能夠正常表達(dá)參與了韌皮部細(xì)胞的分化與生長，其mRNA G4可抑制該基因表達(dá)并影響韌皮部細(xì)胞的分化［26］。

SHR mRNA及其突變體相關(guān)的研究表明，SHR mRNA G4結(jié)構(gòu)能夠調(diào)節(jié)植物根細(xì)胞液-液分離［75］，說明RNA G4可能在植物生理調(diào)節(jié)方面起到了重要的作用。光對G4結(jié)構(gòu)的建成與消失具有一定的催化作用，推測G4也可能參與了植物光合作用，但需要進(jìn)一步研究提供相關(guān)證據(jù)［76-77］。與動(dòng)物不同，目前未發(fā)現(xiàn)植物microRNA前體上的G4具有調(diào)控其靶基因表達(dá)的作用［78］。

4 總結(jié)與展望

G4是普遍存在于生物體基因組中一種高級結(jié)構(gòu)。它廣泛參與了動(dòng)植物體生長發(fā)育、基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、基因表達(dá)調(diào)控和DNA損傷及修復(fù)等一系列重要的生物學(xué)過程。隨著全基因組水平鑒定G4方法的發(fā)展和應(yīng)用，將大力推進(jìn)動(dòng)植物體G4生物學(xué)功能研究。特別是G4在動(dòng)植物體作用的分子機(jī)制還有待于深入研究，例如，G4是如何通過招募或排斥一些反式作用因子來實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能；G4是如何通過影響表觀修飾或與表觀修飾因子互作來參與一些生物學(xué)過程的調(diào)控等。

深入解析G4對人類疾病發(fā)生的機(jī)制將有助于加深人們對癌癥發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識。目前，G4作為靶標(biāo)位點(diǎn)用于抗癌藥物設(shè)計(jì)［79］，癌癥和神經(jīng)性疾病的診斷和治療［16-18］，從而加速了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展。例如，肝癌細(xì)胞中G4分布增加，因此 G4可用于肝癌早期輔助診斷［64］。G4作為潛在的藥物靶標(biāo)用于治療精神類疾病等［19］。

同樣，闡明植物G4生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，將為基于基因表達(dá)調(diào)控的作物表觀遺傳育種提供理論參考。逆境脅迫特異的G4可作為分子標(biāo)記用于作物抗逆分子育種，加速其育種進(jìn)程。總之，隨著研究的深入，G4在人類疾病診斷和治療，農(nóng)用物分子育種等方面將具有更加廣闊的應(yīng)用前景。