鄭曉倩 金傳山 *張亞中劉軍玲李 雷許鳳清

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230012； 2.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點實驗室，安徽合肥 230012；3.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051； 4.金寨森灃農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，安徽六安 237000）

2015 年版《中國藥典》 一部規(guī)定，黃精來源于百合科植物滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黃精P.sibiricumRed.或多花黃精P.cyrtonemaHua 的干燥根莖［1］，其中多花黃精具有極高的藥用價值和經(jīng)濟價值［2］，含有甾體皂苷、黃酮、多糖等成分［3-5］，并且糖類在免疫調(diào)節(jié)［6］、抗菌、抗氧化、抗病毒等方面的活性引起廣泛關(guān)注［6-8］。黃精生品具有刺激性，能“戟人咽喉”，蒸曬后方可入藥，歷代炮制方法以蒸煮為主，本草大多記載九蒸九曬炮制法。黃精在蒸曬的過程中不僅外觀和口感發(fā)生很大的變化，其物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效也有明顯改變［9-11］，已有學(xué)者對其炮制方法進行了優(yōu)化和改進，但對九蒸九曬的機理尚不清楚。

為了初步探討黃精九蒸九曬后糖類變化，本研究以果糖、葡萄糖、蔗糖為對照，采用TLC 法對生品及炮制品中該類成分進行定性研究，紫外-可見分光光度法來探究其含有量總動態(tài)變化，高效液相色譜-電噴霧檢測器 （HPLC-CAD） 法監(jiān)測單糖（果糖、葡萄糖）、雙糖（蔗糖） 含有量動態(tài)變化，以期考證藥材炮制機理，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 UV-2700 紫外可見分光光度計（日本島津公司）；自動TLC 采樣器、TLC 可視化儀（瑞士Camag 公司）；Ultimate 3000 液相色譜儀（配置Corona Ultra 電霧式檢測器，美國Dionex 公司）；ML204 分析天平 （萬分之一）、XP26 分析天平（百萬分之一）（瑞士Mettler-Toledo 公司）；S120H超聲波清洗機（德國Elma 公司）；Simplicity-185超純水儀（美國Millipore 公司）；FD240 電熱恒溫干燥箱（德國Binder 公司）。

1.2 試劑與藥物 果糖（批號100231-201305，純度99.7%）、D-無水葡萄糖（批號110833-200904，純度99.9%）、蔗糖（批號111507-201303，純度99.8%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為質(zhì)譜純；乙醇、正丁醇、乙酸、丙酮、α-萘酚等均為分析純；黃酒（安徽海神黃酒集團有限公司）；水為超純水（自制）。

黃精由安徽省青陽縣森灃農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備 取生品3 份，除去泥土、須根等雜質(zhì)，洗凈，用20% 黃酒拌勻潤透，置蒸鍋中隔水蒸3 h，取出烘至半干，如此反復(fù)9 次，最終60 ℃恒溫干燥，即得。每蒸、烘1 次后，留取3份平行樣品。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取果糖、葡萄糖、蔗糖對照品，50%乙醇稀釋成每1 mL 分別含三者5.006 4、5.128 5、5.448 3 mg，即得。

2.2.2 供試品溶液［12］取各炮制品粉末約1 g，加50%乙醇50 mL，靜置1 h，水浴回流提取1 h，濾過，減壓回收溶劑，加5 mL 50%乙醇溶解殘渣，即得。

2.3 色譜條件［12］吸取對照品、供試品溶液各2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上（含3 mmol／L磷酸二氫鈉），以正丁醇-乙酸-丙酮-水（9∶4∶5∶2） 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 （α-萘酚） -硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

2.4 樣品分析 取各炮制品粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下檢測。

2.5 多糖含有量測定

2.5.1 對照品溶液制備 取經(jīng)105 ℃干燥至恒定質(zhì)量的無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL 含無水葡萄糖0.331 02 mg）。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于10 mL 具塞試管中，加水至2.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，搖勻，放冷后置于水浴中保溫10 min，取出，立即置于冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在582 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（A），濃度為橫坐標（X） 進行回歸，得方程為A＝41.016X＋0.146 5 （R2＝0.999 5），在3.31～19.68 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 多糖提取液制備 取各炮制品粉末約0.25 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，置于水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，殘渣用80%熱乙醇洗滌3 次，每次10 mL，將殘渣及濾紙置于燒瓶中，加150 mL 水，置于沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，濾液放冷至室溫，轉(zhuǎn)移至250 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.5.4 樣品含有量測定 精密量取多糖提取液1 mL，置于10 mL 具塞干燥試管中，按“2.5.2”項下方法計算。

2.6 單糖（果糖、葡萄糖）、雙糖（蔗糖） 含有量測定

2.6.1 對照品溶液制備 取果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖對照品適量，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得（四者質(zhì)量濃度分別為5.731 8、5.003 0、5.616 8 mg／mL）。

2.6.2 供試品溶液制備 取各炮制品粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加30 mL 80%乙醇超聲（500 W、30 kHz） 處理60 min，濾過，減壓回收溶劑，75% 乙腈溶解殘渣，定容至100 mL 量瓶中，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得，進樣3 μL 測定。

2.6.3 色譜條件 Shodex Asahipak NH2P-50 4E 色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -水（B） （75∶25）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃。CAD 檢測器，數(shù)據(jù)采集頻率5 Hz；濾光片3.6 F；霧化器溫度35 ℃；氣源N2；壓力4.328×105Pa。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.6.1”項下對照品溶液，在“2.6.3”項色譜條件下進樣。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.5 檢測限與定量限 取“2.6.1”項下對照品溶液逐步稀釋，在“2.6.3”項色譜條件下進樣。結(jié)果，當信噪比為3∶1 時，果糖、葡萄糖、蔗糖檢測限分別為4.984 × 10-3、1.137 × 10-2、8.776×10-3mg／mL；為10∶1 時，三者定量限分別為1.415×10-2、3.521×10-2、2.617×10-2mg／mL。

2.6.6 精密度試驗 取同一份生品，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，取3 μL，在“2.6.3”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，測得3 種糖類峰面積RSD 分別為0.3%、1.2%、0.8%，表明儀器精密度良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份生品，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.6.3”項色譜條件下于0、2、4、8、16、24 h 進樣測定，每次3 μL，測得3 種糖類峰面積RSD 分別為0.6%、1.3%、1.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.8 重復(fù)性試驗 取同一份生品，按“2.6.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.6.3”項色譜條件下進樣3 μL，測得3 種糖類含有量RSD 分別為0.5%、1.9%、1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.9 加樣回收率試驗 取各糖類含有量已知的同一批生品約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，平行6 份，分別精密加入8.120 2 mg／mL 果糖對照品溶液、2.826 3 mg／mL 葡萄糖對照品溶液、3.214 6 mg／mL蔗糖對照品溶液2.5、2、5 mL，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.6.3”項色譜條件下進樣3 μL 測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

2.6.10 樣品含有量測定 取各炮制品粉末，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.6.3”項色譜條件下進樣3 μL 測定，計算含有量。

2.7 結(jié)果

2.7.1 TLC 鑒別 見圖2。

由此可知，在單糖部位（以果糖、葡萄糖對照品為參考，主斑點向上Rf較大的區(qū)域） 九蒸九曬品斑點比生品多且大，即生品經(jīng)炮制后生成了較多的單糖；在低聚糖位置（以蔗糖對照品為參考，主斑點向下Rf較大的區(qū)域） 與生品相比，一蒸一曬、二蒸二曬品斑點明顯增多變大，而三蒸三曬后明顯減小，說明九蒸九曬對單糖、低聚糖成分影響較大。

2.7.2 含有量測定 以干燥品計算，見表3、圖3。

表3、圖3A 顯示，果糖含有量隨著蒸曬次數(shù)增加而升高，在第五蒸達到峰值后呈下降趨勢；葡萄糖含有量隨著炮制蒸曬次數(shù)增加而先升后降，在第七蒸到達峰值后下降；蔗糖含有量隨著炮制時間延長先呈升高趨勢，在第二蒸達到峰值后逐漸下降，在六蒸六曬品中已無法檢出。

表3、圖3B 顯示，生品中多糖含有量為11.82%，經(jīng)九蒸九曬后總體呈下降趨勢，從生品到五蒸五曬品更明顯，之后趨于穩(wěn)定；單糖總量及單糖、雙糖總量隨蒸曬次數(shù)增加總體呈升高趨勢，從生品到五蒸五曬品更明顯，之后逐漸下降。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

圖2 生品、炮制品TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of raw product and processing products

表3 糖類含有量測定結(jié)果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of saccharides（%， n＝3）

圖3 生品（A）、炮制品（B） 糖類含有量變化Fig.3 Content changes of saccharides in raw product（A） and processing products （B）

3 討論

3.1 檢測器選擇 曾林燕等［13］采用HPLC-ELSD法，對黃精炮制前后小分子糖的種類和含有量進行了研究。但ELSD 因其結(jié)構(gòu)的特點，在耐用性和穩(wěn)定性上存在不足；CAD 屬于通用性檢測器，其靈敏度、穩(wěn)定性、耐用性均較良好，檢測限較低，動態(tài)監(jiān)測范圍較寬。糖類化合物具有強極性且無紫外吸收，故本研究選擇CAD 為檢測器，并選用耐用性較好的聚合物氨基色譜柱對黃精中的單糖、雙糖進行分離測定。

3.2 結(jié)果分析 通過TLC 法初步判斷，黃精經(jīng)九蒸九曬后單糖含有量升高，低聚糖含有量降低。再進一步建立HPLC -CAD 法來監(jiān)測炮制過程中單糖（果糖、葡萄糖）、雙糖 （蔗糖） 含有量的動態(tài)變化。

結(jié)果顯示，雙糖含有量先下降后趨于穩(wěn)定，單糖、雙糖總量先增后減，可能是炮制初期多糖會大量水解成低聚糖、單糖，而低聚糖會進一步水解成單糖；但隨著炮制時間延長，果糖、葡萄糖會與氨基酸發(fā)生Maillard 反應(yīng)，導(dǎo)致其含有量也下降［14］。

3.3 合理性分析 九蒸九曬是一種歷史悠久的炮制珍貴滋補中藥的傳統(tǒng)方法，但目前我國對其研究較少，黃精為“四大九蒸貨”之一［15］，經(jīng)反復(fù)蒸曬增強了補養(yǎng)滋腎的作用，可能是由于多糖在炮制過程中大量水解成低聚糖和單糖，有利于成分煎出及藥效充分發(fā)揮，從而增強其補益作用［16-17］。黃精經(jīng)過五蒸五曬后已達到傳統(tǒng)外觀質(zhì)量要求，也符合《中國藥典》 性狀；多糖趨于穩(wěn)定，說明具有刺激性的黏多糖已經(jīng)被破壞降解［18］，同時單糖、雙糖含有量達到峰值后有下降趨勢，說明炮制后期羰基化合物與氨基化合物發(fā)生Maillard 反應(yīng)，造成單糖損失。

4 結(jié)論

本研究建立的HPLC-CAD 法可在30 min 內(nèi)完成對黃精生品及九蒸九曬品中果糖、葡萄糖、蔗糖含有量的同時測定，可為相關(guān)質(zhì)量控制提供依據(jù)。并從外觀、性味、糖類成分變化及其之間的關(guān)系角度研究，表明五蒸五曬有望作為九蒸九曬的改良，但該方法所得炮制品與黃精生品、九蒸九曬品在藥效、臨床作用方面是否存在差異尚不明確，還需要結(jié)合藥效學(xué)實驗進行更深入的研究。