何萬輝 簡小兵王文英趙志祥李慧枝*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510504； 2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510130）

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN） 是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致糖尿病患者足部痛覺、溫度覺異?；蛉笔?，因而成為患者發(fā)生足部潰瘍的最常見的危險(xiǎn)因素［1］。氧化應(yīng)激 （Oxidative stress，OS） 是糖尿病各并發(fā)癥發(fā)生的共同病理生理機(jī)制，在包括DPN 在內(nèi)的多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病過程中起重要作用［2］。神經(jīng)生長因子（Nerve Growth Factor，NGF） 是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，也是最早被發(fā)現(xiàn)、具有抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)生長和分化等多重生物學(xué)功能的神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子［3-6］，其水平下降與DPN 發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系［7-8］。

既往研究發(fā)現(xiàn)注射用紅花黃色素能改善DPN 患者臨床癥狀［9-10］。但注射用紅花黃色素對(duì)DPN 的具體作用機(jī)制未明，本研究根據(jù)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和NGF 水平探討注射用紅花黃色素對(duì)DPN 的防治作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量180～220 g，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心東校園，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵） 2016-0029，使用許可證號(hào)SYXK（粵） 2016-0112。

1.2 試劑與藥物 注射用紅花黃色素（浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20050146，批號(hào)1905213）；甲鈷胺注射液 ［衛(wèi)材 （中國） 藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字J20070063，批號(hào)101271］。鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司，批號(hào)050401）；SOD ELISA 試劑盒（美國Biovision 公司，批號(hào)E4584-100）；MDA ELISA 試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號(hào)AD190124）；NGF ELISA 試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號(hào)AD190128）；TRizol ［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司］；RevertAid cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo 公司）；SYBR Green qPCR Kit （日本Toyobo 公司）；DEPC （美國Pierce 公司）。

1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀 （美國Tecan 公司）；Nanodrop2000 紫外微量分光光度計(jì)（美國Thermo 公司）；Mastercycler pro 梯度PCR 儀（德國Eppendorf 公司）；LigthCycler480 熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀（OneTouchR UltraVue，美國強(qiáng)生公司）。

2 方法

2.1 造模 60 只SPF 級(jí)SD 大鼠在自然光線、自由飲食條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。正常組不造模，自由飲食、普通飼料喂養(yǎng)，其余3 組高脂飼料喂養(yǎng)2 個(gè)月后以鏈脲佐菌素造模，臨用前以0.1 mmol／L 枸櫞酸緩沖液（pH ＝4.2，4 ℃） 在避光條件下配成2%溶液。大鼠于高脂飼料喂養(yǎng)第61 天禁食12 h，左下腹腔單次注射鏈脲佐菌素（50 mg／kg），72 h后取尾靜脈血測(cè)隨機(jī)血糖，≥16.7 mmol／L 者為糖尿病造模成功。大鼠自由飲食7 d，第8 天測(cè)定坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（Motor Conduction Velocity，MCV），較造模前下降≥10%為DPN 大鼠模型。

2.2 分組及給藥 分為正常組、模型組、給藥組、陽性對(duì)照組，每組10 只。正常組和模型組大鼠每日自由飲食，不予任何干預(yù)；陽性對(duì)照組大鼠腹腔注射甲鈷胺注射液（250 μg／kg），1 次／d；給藥組大鼠腹腔注射紅花黃色素（40 mg／kg，溶于0.9%氯化鈉注射液中），1 次／d。造模成功后于第1～28 天給藥，干預(yù)4 周。

2.3 血糖測(cè)定 大鼠尾靜脈采血，應(yīng)用穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀及穩(wěn)豪試紙檢測(cè)。

2.4 坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定 使用BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。大鼠腹腔注射水合氯醛（35 mg／kg） 麻醉，俯臥位固定，將刺激雙針電極置于大鼠右側(cè)坐骨切跡處坐骨神經(jīng)傳出部位，于同側(cè)踝關(guān)節(jié)坐骨神經(jīng)經(jīng)過部位用雙針電極記錄，參考電極置于刺激電極與記錄電極之間、距記錄電極1 cm 處。用波寬1 ms 的單刺激，延時(shí)10 000 ms，每2 個(gè)刺激之間間隔5 s 以上，記錄復(fù)合動(dòng)作電位的峰-峰值作為波幅值，嚴(yán)格控制室溫（20±0.5） ℃，保持動(dòng)物體溫37 ℃。計(jì)算機(jī)記錄刺激開始到動(dòng)作電位出現(xiàn)的時(shí)間，即潛伏時(shí)間，將大鼠后足以自然肢體狀態(tài)與脊柱成45 °夾角向斜后方拉直，沿坐骨神經(jīng)經(jīng)過部位和方向，在體表準(zhǔn)確測(cè)定刺激電極到記錄電極之間的距離。MCV ＝刺激電極與記錄電極間的距離／潛伏時(shí)間。

2.5 血清相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 采用ELISA 法。把SOD、MDA、NGF 抗體包被在96 孔微孔板里，做成固相載體，朝微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中SOD、MDA、NGF 與結(jié)合于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的SOD、MDA抗體，把未結(jié)合的生物素化抗體洗凈，再加入HRP 標(biāo)記的親和素，再徹底洗漆1 次后加入TMB 底物顯色；TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并且在酸的作用下轉(zhuǎn)化為最終的黃色，其深淺與SOD、MDA、NGF 呈正相關(guān)。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長處光密度（OD），計(jì)算因子水平，具體操作根據(jù)試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

2.6 RT-PCR 檢測(cè)坐骨神經(jīng)組織NGFmRNA 表達(dá) 取大鼠坐骨神經(jīng)（長度不小于5 mm），以液氮研磨組織粉末，氯仿-異丙醇法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 純度和有無降解。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作合成cDNA。以cDNA為模板，按照ABI Prism 7000 實(shí)時(shí)定量PCR 儀操作規(guī)程檢測(cè)，進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)mRNA 表達(dá)用儀器配套的SDS1.1 軟件分析，內(nèi)參選擇GAPDH。引物序列：NGF正向5′-CAACAGGACTCACAGGAGCAAGC-3′，反向 5′-GATGTCCGTGGCTGTGGTCTTATC -3′；GAPDH正向 5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′，反向 5′-TGAACTTGCCGTGGGTAGAG-3′。每個(gè)樣本、指標(biāo)重復(fù)3 次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，滿足正態(tài)性和方差齊性，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)分布，采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅花黃色素對(duì)DPN 大鼠坐骨神經(jīng)MCV 的影響 在藥物干預(yù)前與正常組比較，DPN 大鼠MCV 降低（P＜0.05）。在藥物干預(yù)后，模型組MCV 較正常組下降（P＜0.01）；與模型組比較，紅花黃色素給藥組大鼠MCV 升高（P＜0.01），提示注射用紅花黃色素可能具有延緩DPN 大鼠MCV 下降的作用，見表1。

表1 紅花黃色素對(duì)DPN 大鼠坐骨神經(jīng)MCV 的影響（m／s，， n＝10）

表1 紅花黃色素對(duì)DPN 大鼠坐骨神經(jīng)MCV 的影響（m／s，， n＝10）

注：與正常組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 紅花黃色素對(duì)DPN 大鼠SOD、MDA、NGF 的影響DPN 大鼠SOD 水平低于正常大鼠（P＜0.01），MDA 水平高于正常大鼠（P＜0.01），提示DPN 的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激有關(guān)。與模型組比較，給藥組及陽性對(duì)照組SOD、NGF 水平升高，MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見表2。與正常組比較，模型組NGFmRNA 表達(dá)降低 （P＜0.01）；與模型組比較，給藥組NGFmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），見圖1。

表2 紅花黃色素對(duì)DPN 大鼠血清SOD、MDA、NGF 水平的影響（， n＝10）

表2 紅花黃色素對(duì)DPN 大鼠血清SOD、MDA、NGF 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 討論

DPN 與OS 關(guān)系密切，國外內(nèi)的研究均發(fā)現(xiàn)DPN 患者體內(nèi)的MDA 顯著升高、SOD 顯著下降［11-12］，提示DPN 的發(fā)生、發(fā)展與SOD 水平下降、MDA 水平上升有關(guān)。OS 可導(dǎo)致雪旺細(xì)胞損傷［13-14］，從而引起內(nèi)源性NGF 合成和分泌障礙。NGF 表達(dá)下降與DPN 的發(fā)生和發(fā)展存在密切聯(lián)系。

圖1 紅花黃色素對(duì)DPN 大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF mRNA表達(dá)的影響

糖尿病的臨床表現(xiàn)為口干多飲、多食易饑、多尿、消瘦，屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇。DPN 的臨床表現(xiàn)為肢體麻木、疼痛、冰涼、乏力等各種感覺異常，屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”范疇。由于其與消渴病關(guān)系密切，是患消渴病日久、病情遷延所致的“變證”，故現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)將DPN 稱為“消渴病痹癥”。消渴病痹癥之候輕者表現(xiàn)為肢端麻木不仁，重者表現(xiàn)為痛如針刺、痛有定處，其特點(diǎn)與瘀血內(nèi)生、經(jīng)絡(luò)不通所致之疼痛特點(diǎn)相符。因此，運(yùn)用中醫(yī)藥治療DPN應(yīng)以活血化瘀為基本治法。中藥紅花首載于《新修本草》，性溫，味辛，具活血通經(jīng)、祛瘀止痛之功［15］。注射用紅花黃色素是紅花的主要活性成分［16］。既往研究發(fā)現(xiàn)紅花黃色素具有擴(kuò)張動(dòng)脈、抗凝、抗氧化等作用［17-19］。

本研究發(fā)現(xiàn)，接受注射用紅花黃色素腹腔注射4 周后，糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)MCV 有上升，但與給藥前對(duì)比，差異未存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未能證實(shí)注射用紅花黃色素具有逆轉(zhuǎn)高血糖引起神經(jīng)功能損傷。但在干預(yù)后，給藥組MCV 優(yōu)于模型組，提示注射用紅花黃色素能延緩DPN 進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)注射用紅花黃色素具有抗氧化應(yīng)激、上調(diào)NGF 表達(dá)的作用；與模型組相比，注射用紅花黃色素組SOD、NGF 水平升高。本研究結(jié)果顯示，紅花黃色素可減輕高血糖引起的氧化應(yīng)激，延緩神經(jīng)組織中NGF 表達(dá)下降，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)組織的作用。