曹冠華張 雪陳月月 俞 捷李澤東趙振宇趙榮華*賀 森*

（1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南昆明 650500； 2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫 214122；3.中國中醫(yī)科學院中藥資源中心，道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700）

陽春砂仁Amomum villosumLour.是姜科豆蔻屬常綠草本植物，其花、果、根、莖、葉均可入藥，主產于廣東、海南、云南等地［1-2］，始載于《本草拾遺》，是四大南藥之一，為歷代常用中藥［3］，在現(xiàn)代臨床上應用廣泛，尤其在治療胃腸道疾病中效果顯著［3］。在陽春砂仁、綠殼砂仁和海南砂仁中，以陽春砂仁的品質最好，產量最大，為市場主流產品［4］。研究顯示，砂仁是一種良好的天然抑菌劑［5］，但目前對于砂仁抑菌的研究大多數(shù)集中在果實上，而對于葉和桿鮮有報道。本研究以陽春砂仁葉和桿為原料，利用濾紙片法［6］研究它們對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用，通過測定抑菌圈直徑和最小抑菌濃度，比較兩者的抑菌效果。本研究變廢為寶，大大提高了砂仁葉和桿的附加值，整體增加砂仁種植的經濟型。同時也為進一步研究砂仁葉和桿的抑菌成分和在食品、藥品工業(yè)中的應用奠定了基礎。

1 材料

1.1 試劑與藥物 砂仁葉和桿采自于云南省紅河金平縣陽春砂仁基地，由云南中醫(yī)藥大學趙榮華教授鑒定確定為陽春砂仁。大腸桿菌 （Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由云南大學微生物重點實驗室提供。氯化鈉（天津市風船化學試劑科技有限公司，批號20180903）；瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20170818）；蛋白胨（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20150522）；酵母粉 （北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20170626）；無水乙醇（天津市致遠化學試劑有限公司，批號2018110116）。

1.2 儀器 SW-CJ-2D 超凈工作臺，購自蘇州凈化設備有限公司；SK7210HP 超聲波清洗器，購自上海科導超聲儀器有限公司；RRV8V 旋轉蒸發(fā)儀，購自德國IKA 公司；MJ 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購自上海一恒科技有限公司；JJ200精密電子天平，購自美國雙杰兄弟 （集團） 有限公司；BioMate 3S 紫外可見分光光度計，購自美國Thermo Fisher公司。

2 方法

2.1 乙醇提取物制備 取砂仁葉和桿洗凈，打粉，過60目篩，按1∶10 料液比于80 ℃、70%乙醇中回流提取3 h，共2 次，合并濾液，即得，保存于4 ℃冰箱中備用［7］。提取率＝ （砂仁葉或桿乙醇提取物質量／原料質量） ×100%。

2.2 抑菌活性測定

2.2.1 LB 培養(yǎng)基制備 取蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g，加水定容至1 L，適度加熱使培養(yǎng)基均勻溶解，調整pH 至7.0～7.2，在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

2.2.2 菌懸液制備 從4 ℃冰箱中取出冷凍保存的菌種，用無菌接種環(huán)挑取單菌落，劃線接種于平板培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，得單菌落。挑取已活化的單菌落于無菌生理鹽水中，制成菌懸液待用［8］。

2.2.3 抑菌圈直徑測定 采用濾紙片法［9］。分別取砂仁葉和桿乙醇提取物，用無菌純水復溶為1 g／mL。打孔器將濾紙打成直徑6 mm 的圓紙片，將滅菌干燥后的濾紙片放入不同濃度的提取液中浸泡2 h，用鑷子取出，置于含菌平板中，各濾紙片距離均等，同時以浸泡在無菌生理鹽水中的濾紙片為空白對照組，每組設3 個重復，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，取出觀察，游標卡尺準確測量其抑菌圈直徑。

2.2.4 作用研究 分別將砂仁葉和桿乙醇提取物稀釋為1、3、10 倍，將直徑6 mm 的圓形濾紙片放不同濃度提取液中浸泡2 h。將滅菌好的LB 培養(yǎng)基靜置凝固后，在無菌狀態(tài)下將0.1 mL 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的菌懸液在平板上涂布均勻，靜置待培養(yǎng)基吸取菌液［10］，以浸泡在無菌生理鹽水中的濾紙片為空白對照，每個平皿重復3 次，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，準確測量其抑菌圈直徑［11］。

2.3 最低抑菌濃度（MIC） 測定 用對倍稀釋法［12］將乙醇提取物稀釋至2、1、0.9、0.8、0.7、0.5、0.1 g／mL，各吸取1 mL 于培養(yǎng)皿中，倒入19 mL LB 培養(yǎng)基，在無菌條件下混勻，靜置至凝固，制作含有抑菌成分的平板。分別吸取0.1 mL 的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的菌懸液于平板中，均勻涂布，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h，以不加乙醇提取物、只加20 mL LB 培養(yǎng)基的平板作為空白組，升高或降低乙醇提取液濃度，通過觀察菌落生長情況來分析細菌MIC，并相應調整濃度。

2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0 軟件進行分析，GraphPad Prism 5 軟件進行作圖，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 提取率 由表1 可知，砂仁葉的提取率比桿高15.78%，可能是由于桿中纖維太多，不溶于水，用乙醇提取時會產生大量雜質沉淀，使提取率大大下降。

表1 砂仁葉和桿乙醇提取率（%）

3.2 抑菌作用

3.2.1 不同部位 由圖1～2 可知，與空白組比較，砂仁葉和桿乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用（P＜0.01），葉優(yōu)于桿。砂仁葉乙醇提取物對于金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為13.12 mm；其次為大腸桿菌，抑菌圈直徑為12.42 mm；最弱的為枯草芽孢桿菌，抑菌圈直徑為11.54 mm。砂仁桿乙醇提取物對于枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為10.82 mm；其次為大腸桿菌，抑菌圈直徑為10.36 mm；金黃色葡萄球菌，抑菌圈直徑為9.99 mm。與空白組相比，砂仁葉或桿乙醇提取物抑菌圈直徑增大（P＜0.01），但3 種菌之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 砂仁葉和桿乙醇提取物抑菌作用

3.2.2 不同濃度 如表2 所示，砂仁葉和桿乙醇提取物1、3 倍稀釋液對3 種菌均有抑制作用，10 倍稀釋液則無任何效果，而且葉的抑菌圈直徑均大于桿。1 倍稀釋時，砂仁葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為11.02 mm；其次為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，抑菌圈直徑分別為10.60、9.08 mm，而砂仁桿提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為9.49 mm；其次為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌，抑菌圈直徑分別為8.20、8.79 mm。3 倍稀釋時，砂仁葉提取物對大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為9.45 mm；其次為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，抑菌圈直徑分別為7.99、7.45 mm，而砂仁桿提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為8.25 mm；其次為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，抑菌圈直徑分別為6.98、7.40 mm。

圖2 砂仁葉和桿乙醇提取物抑菌作用

如圖3 所示，隨著稀釋倍數(shù)的增大，砂仁葉乙醇提取物對3 種菌的抑菌效果逐漸變差，1 倍稀釋液依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌，而3 倍稀釋液依次為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌，當稀釋至10倍時無抑菌效果。與空白組相比，1、3 倍稀釋液抑菌圈直徑變大（P＜0.05）。

表2 不同濃度砂仁葉和桿乙醇提取物抑菌圈直徑（mm，， n＝3）

表2 不同濃度砂仁葉和桿乙醇提取物抑菌圈直徑（mm，， n＝3）

圖3 不同濃度砂仁葉提取物抑菌作用

如圖4 所示，隨著稀釋倍數(shù)的增大，砂仁桿乙醇提取物對3 種菌的抑菌效果逐漸變差，1 倍稀釋液依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌，而3 倍稀釋液依次為金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌，當稀釋至10倍時無抑菌效果。與空白組相比，1、3 倍稀釋液抑菌圈直徑變大（P＜0.05）。

3.2.3 最小抑菌濃度測定 如表3 所示，砂仁葉乙醇提取物對3 種菌的MIC 均低于桿，故前者抑菌效果優(yōu)于后者。此外，砂仁葉、桿乙醇提取物均對金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用。

表3 砂仁葉和桿乙醇提取物MIC （g／mL）

4 討論

圖4 不同濃度砂仁桿提取物菌抑菌作用

砂仁葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳，砂仁桿乙醇提取物對枯草芽孢桿菌的抑制效果最佳。總體來看，砂仁葉乙醇提取物對3 種菌的抑菌效果均優(yōu)于砂仁桿乙醇提取物。植物源食品防腐劑安全、天然、抑菌效果好，但其研究與開發(fā)還可以進一步加深，如抑菌活性成分或化合物的鑒定和檢測、抑菌的機理、量效關系以及食用安全性等方面仍需進一步深入探討和研究。植物的抑菌等活性成分與植物所生長和分布的情況都有密切的關系，這會導致植物提取液的質量有所差別［13］。本研究以陽春砂仁的葉和桿粗提物進行抑菌效果比較，在提取過程中會導致活性成分損失，因而未表現(xiàn)較強的活性。與另一重要藥食兩用資源——黃精的抑菌效果相比，效果稍差，這是由于砂仁葉和桿中的成分大部分為揮發(fā)油，在提取時容易大量揮發(fā)散失，而在黃精中起主要抑菌作用的多糖則相對穩(wěn)定［14］。砂仁為傳統(tǒng)藥食兩用食材，但其葉和桿在食品領域的利用尚未見報道。云南紅河金平砂仁近年來在產量和品質方面遠超廣東，成為當?shù)剞r民脫貧致富的主要渠道［15］。但砂仁葉和桿常被遺棄，頗為浪費，若能利用其開發(fā)天然抑菌防腐劑，滿足食品生產需求，對增加產品附加值具有重要意義。