黃兆琦， 許 衛(wèi)， 黃炯華， 盧 雄△

（1廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院心內科，廣東廣州510150；2廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院心內科，廣東廣州510800）

心血管疾病是全球范圍內人類死亡的首要原因［1］。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種嚴重的心臟缺血性疾病，治療過程中可發(fā)生心肌缺血再灌注損傷［2］，后者是指心肌缺血缺氧后再恢復血液灌流，引起心肌損傷進一步加劇的過程［3］。目前研究表明，再灌注后大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成是氧化損傷以及心肌細胞凋亡的主要原因之一［4］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種單鏈非編碼RNA，其可通過與目標基因3'端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）結合，在轉錄后水平調控基因表達［5］。當前研究表明，miRNA 在缺血再灌注損傷中具有重要作用［6］。在缺血再灌注損傷中，心肌組織中 miR-499 和 miR-328 表達明顯升高［7-8］。有研究報道，miR-153-3p 高表達可改善肝細胞氧化應激損傷［9］，而其在心肌細胞氧化損傷中的作用卻少見報道。

本研究將通過H2O2誘導H9C2 細胞發(fā)生氧化應激損傷，通過MTT 實驗和RT-qPCR 檢測氧化應激狀態(tài)下H9C2 細胞的活力和miR-153-3p 表達的變化。隨后觀察敲減miR-153-3p表達對H2O2誘導的H9C2細胞損傷的影響，并通過雙螢光素酶報告基因實驗檢測miR-153-3p的作用靶點。

材 料 和 方 法

1 試劑

K1622 逆轉錄試劑盒購自Fermentas；SYBR?Premix Ex Taq? II 購自 TaKaRa；RNeasy 試劑盒和Taq PCR Master Mix 購自 Qiagen；RIPA 裂解液購自Solarbio；BCA 試劑盒購自 Thermo；MTT 溶液購自Amresco；miR-153-3p mimic、miR-153-3p inhibitor、miR-153-3p 陰性對照（negative control，NC）、NFE2L2質粒和NFE2L2-3′-UTR突變質粒由上海吉瑪公司合成；Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；丙二醛（malondialdehyde，MDA）比色試劑盒（TBA 法）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）比色試劑盒（NBT 法）和Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司；核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）轉錄因子檢測試劑盒購自武漢艾美捷公司；螢火蟲螢光素酶報告質粒pMIR-Report購自Ambion；其余試劑均購自Sigma-Aldrich。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) H9C2 細胞購自ATCC，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，并添加1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素。

2.2 細胞轉染與H2O2處理 細胞轉染實驗:取對數期H9C2 細胞接種于6 孔板，待細胞貼壁后，按照轉染說明書步驟采用Lipofectamine 2000試劑進行miR-153-3p mimic、miR-153-3p inhibitor 或 miR-153-3p NC轉染（48 h），構建miR-153-3p NC、miR-153-3p mimic和miR-153-3p inhibitor轉染細胞；取已轉染miR-153-3p NC 或 miR-153-3p inhibitor 的 H9C2 細胞，再次通過Lipofectamine 2000 試劑轉染陰性對照siRNA（negative control siRNA，si-NC）或NrfsiRNA（si-Nrf2）48 h，用于構建 miR-153-3p NC+si-NC、miR-153-3p inhibitor+si-NC 和miR-153-3p inhibitor+si-Nrf2轉染細胞。

H2O2處理:采用多種濃度（0、50、100、200 和400 μmol/L）的 H2O2分別處理 H9C2 細胞 48 h 后，收集細胞用于后續(xù)實驗；或根據實驗要求取已轉染的上述細胞采用200 μmol/L H2O2處理48 h 后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

2.3 MTT 法檢測細胞活力 取H9C2細胞或已轉染的H9C2細胞接種在96孔板中，并按照2.2方法進行H2O2處理細胞 48 h 后，向每孔中加入 50 μL MTT 溶液，在37℃條件下繼續(xù)孵育4 h。再向每孔加入150 μL 二甲基亞砜，待結晶充分溶解后，使用多功能酶標儀測定各孔490 nm處的吸光度（A）值。

2.4 RT-qPCR 實驗 取2.2 中處理的細胞，使用RNeasy 試劑盒提取細胞中總RNA。將提取的RNA通過K1622 試劑盒逆轉錄成cDNA。然后在Taq PCR Master Mix 體系中將 cDNA 作 qPCR 模板并添加引物和SYBR?Premix Ex Taq? II 進行RT-qPCR。本實驗所用miR-153-3p 的正向引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTTGCATAGTCACAAA-3′，反向引物序列為 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6 的正向引物序列為5′-CCCTTCGGGGACATCCGATA-3′，反向引物序列為 5′-TTTGTGCGTGTCATCCTTGC-3′。miR-153-3p相對于U6的表達量采用2-ΔΔCt法進行量化分析。

2.5 抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）活性的測定 ARE 活性通過Nrf2 轉錄因子檢測試劑盒測定。采用多種濃度（0、50、100、200 和400 μmol/L）的 H2O2分別處理 H9C2 細胞 48 h 后，收集細胞。按照說明書步驟，采用核蛋白萃取液裂解細胞，并采用 100 000×g離心 10 min 收集上清液；取樣品 100 μL 加入 96 孔板，然后加入 Nrf2 轉錄因子結合分析液孵育25 min，加入反應終止液孵育10 min。利用多功能酶標儀檢測各孔450 nm處的A值。

2.6 MDA 含量的測定 取2.2 中處理的細胞，使用100 μL RIPA 裂解液裂解細胞，并采用 100 000×g離心10 min 收集上清液。按照說明書步驟，取樣品和標準品各 100 μL 加入 EP 管，再分別加入 200 μL MDA 檢測工作液，混勻，沸水浴15 min，并冷卻至室溫。1 000×g離心10 min 收集上清液，每樣品取100 μL 加入96 孔板，利用多功能酶標儀檢測各孔530 nm處的A值。

2.7 SOD 活性的測定 取2.2 中處理的細胞，使用0.1 mL RIPA 裂解液裂解細胞，并采用 100 000×g離心10 min 收集上清液。按照說明書步驟，各取樣品20 μL 加入 96 孔板，再加入 180 μL NBT 工作液并在37℃條件下繼續(xù)孵育30 min，利用多功能酶標儀檢測各孔560 nm處的A值。

2.8 細胞凋亡的測定 取2.2 中處理的細胞，PBS重懸細胞2 次，按照說明書步驟，避光加入200 μL Annexin V-FITC工作液混勻，并孵育5 min，再加入PI工作液混勻染色15 min。通過流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。

2.9 雙螢光素酶報告基因分析 根據說明書步驟，將 NFE2L2-3′UTR 野 生 型（WT）質 粒 和 NFE2L2-3′UTR 突變型（Mut）質粒克隆至pMIR-Report。取已轉染 miR-153-3p NC 或 miR-153-3p mimic 的 H9C2 細胞采用Lipofectamine 2000 分別將NFE2L2 WT/Mut質粒轉染至細胞，轉染48 h 后，加入反應底物采用Dual-Glo?螢光素酶測定系統（Promega）測定螢光素酶相對活性。

2.10 Western blot 檢測蛋白水平 取2.2 中處理的細胞，采用RIPA 裂解細胞后取全蛋白，通過BCA 試劑盒進行定量，各取50 μg 蛋白樣品進行10% SDSPAGE 分離。將分離的蛋白轉移到活化的PVDF 膜上。用脫脂奶粉封閉PVDF 膜后，加入I 抗（鼠抗Nrf2，1∶1 000；β-actin，1∶5 000）4℃孵育過夜，第2天用PBST洗PVDF膜后，HRP偶聯的II抗（1∶1 000）室溫孵育 1.5 h。PBST 洗 PVDF 膜后，通過 ECL 法顯影，膠片掃描后利用ImageJ軟件掃描灰度值。

3 統計學處理

采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析。計量資料均表示為均數±標準差（mean±SD）。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析及Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 H2O2處理對H9C2 細胞活性和miR-153-3p 表達的影響

MTT實驗結果顯示，H2O2濃度依賴性抑制H9C2細胞的活力（P＜0.05）；RT-qPCR 結果顯示，H2O2濃度依賴性促進H9C2 細胞中miR-153-3p 的表達（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Effects of different concentrations of H2O2 on cell viability and miR-153-3p expression in H9C2 cells.Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖1 不同濃度H2O2對H9C2細胞活力和miR-153-3p表達的影響

2 抑制miR-153-3p 表達對H2O2誘導的H9C2 細胞損傷的影響

MTT 實驗結果顯示，與轉染miR-153-3p NC 比較，轉染miR-153-3p inhibitor 可顯著增強H2O2處理后H9C2 細胞的活力（P＜0.01），見圖2A。流式細胞術檢測結果顯示，與轉染miR-153-3p NC 比較，轉染miR-153-3p-inhibitor 可顯著降低H2O2處理后H9C2細胞的凋亡率（P＜0.01），見圖2B。隨后檢測H9C2細胞中MDA 含量和SOD 活性的變化，發(fā)現與轉染miR-153-3p NC 比較，轉染 miR-153-3p inhibitor 可顯著降低 H2O2處理后 H9C2 細胞內的 MDA 含量（P＜0.01），升高SOD 的水平（P＜0.01），見圖2C。因此，抑制miR-153-3p 可顯著降低H2O2引起的H9C2 的細胞的氧化損傷。

Figure 2.Inhibition of miR-153-3p expression attenuated H2O2（200 μmol/L）-induced oxidative injury of H9C2 cells.A:cell viability was measured by MTT assay；B:apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining；C:MDA content and SOD activity were measured by TBA assay and NBT assay，respectively.Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs miR-153-3p-NC group；##P＜0.01 vs H2O2+miR-153-3p-NC group.圖2 抑制miR-153-3p表達減輕H2O2誘導的H9C2細胞氧化損傷

3 miR-153-3p靶基因的研究

Western blot 結果顯示，H2O2濃度依賴性促進H9C2細胞中Nrf2表達（P＜0.01），見圖3A；且ARE 活性隨H2O2濃度升高而遞增（P＜0.01），見圖3B。TargetScan 在線軟件分析結果顯示，Nrf2 的 3′-UTR 具有miR-153-3p 潛在的結合序列，且雙螢光素酶報告基因法驗證Nrf2為miR-153-3p 的靶基因之一，見圖3C。Western blot 實驗結果顯示，與轉染miR-153-3p-NC 比較，轉染 miR-153-3p mimic 抑制 H9C2 細胞中Nrf2蛋白的表達，而轉染miR-153-3p inhibitor則促進H9C2 細胞中 Nrf2 蛋白的表達（P＜0.01），見圖3D。以上結果表明miR-153-3p負調控靶基因Nrf2。

4 敲減Nrf2 表達可消除下調miR-153-3p 表達對H2O2誘導的H9C2細胞損傷的抑制作用

H2O2處理后，與轉染miR-153-3p-inhibitor+si-NC的細胞比較，轉染miR-153-3p-inhibitor+si-Nrf2 的細胞的活力與SOD 活性均降低，細胞凋亡率與MDA 含量均增加（P＜0.01），見圖4。這提示下調miR-153-3p是通過激活Nrf2 來抑制H2O2引起的H9C2 細胞氧化損傷的。

討 論

ROS 即·O2-、H2O2和·OH-，與抗氧化系統共同維持著細胞氧化還原平衡［10］。氧化應激是機體ROS之間的動態(tài)平衡失調而引起的一系列適應性反應。氧化應激與多種心血管疾病有關，如心力衰竭、急性心肌梗死等［11］。心臟缺血再灌注損傷中大量ROS的生成是心肌細胞凋亡的主要原因［12］，因此控制心肌細胞氧化損傷是心血管疾病治療的途徑之一。

有研究報道，miR-153-3p 高表達可抑制肝細胞的氧化損傷［9］，然而其對心肌細胞的作用并不清楚。本研究通過H2O2處理建立心肌H9C2 細胞氧化損傷模型，發(fā)現H9C2細胞的活力隨H2O2濃度升高而逐漸降低，而miR-153-3p 表達隨H2O2濃度升高而增加。為了進一步研究miR-153-3p在心肌細胞氧化損傷中的作用，我們在H9C2 細胞中抑制miR-153-3p 的表達，結果顯示抑制miR-153-3p表達可提高H9C2細胞在氧化應激狀態(tài)下的細胞活力并降低細胞凋亡。生物體內脂質發(fā)生過氧化反應的最終產物為MDA，MDA含量可反映組織過氧化損傷程度［13］。SOD可清除機體代謝過程中產生的過量超氧陰離子自由基，在機體對抗氧化損傷中具有重要作用［14］。隨后我們研究了miR-153-3p 對H9C2 細胞中MDA 含量和SOD活性的影響，結果顯示抑制miR-153-3p 可顯著降低H2O2處理后H9C2 細胞的MDA 含量并升高SOD水平。

Figure 3.Target validation of miR-153-3p and Nrf2 gene.A，B:Nrf2 expression and ARE activity in the H9C2 cells after treated with H2O2；C:identification of Nrf2 as a potential target of miR-153-3p and relative luciferase activity of WT and Mut；D:the expression of Nrf2 in the H9C2 cells transfected with miR-153-3p NC，mimic or inhibitor.Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；##P＜0.01 vs miR-153-3p NC group.圖3 miR-153-3p和Nrf2基因的靶向驗證

Figure 4.Nrf2 was involved in the inhibitory effect of miR-153-3p down-regulation on H2O2-induced injury of H9C2 cells.A:the cell viability；B:the apoptosis rate；C:MDA content；D:SOD activity.Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs miR-153-3p-NC+si-NC group；##P＜0.01 vs miR-153-3p-inhibitor+si-NC group.圖4 敲減Nrf2可消除下調miR-153-3p表達對H2O2誘導的H9C2細胞損傷的抑制作用

Nrf2/ARE 是近些年發(fā)現的機體抵抗氧化和化學等應激的信號通路。正常情況下，細胞質中Nrf2 與Keap1 結合并處于非活性狀態(tài)；當氧化應激發(fā)生時，Nrf2與Keap1解離而活化?；罨腘rf2進入細胞核，與ARE結合，啟動II相解毒酶、抗氧化蛋白和蛋白酶體/分子伴侶等基因轉錄以抵抗氧化應激損傷［15-17］。本研究發(fā)現Nrf2 表達和ARE 活性隨H2O2濃度升高而增強。本研究進一步探究Nrf2與miR-153-3p之間的關系，結果發(fā)現Nrf2是miR-153-3p的靶基因，miR-153-3p 過表達可引起Nrf2 的表達抑制，抑制miR-153-3p后Nrf2表達升高。干擾Nrf2并同時抑制miR-153-3p，可顯著降低H9C2 細胞在H2O2環(huán)境下細胞活性并增強細胞凋亡，還可升高H9C2 細胞中MDA 含量和降低SOD水平。

綜上所述，本研究證明抑制miR-153-3p 可上調Nrf2/ARE 通路并抑制H2O2引起的H9C2 細胞損傷。這為心臟缺血再灌注損傷提供了新的參考資料。