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        HET0016對LPS誘導大鼠小膠質(zhì)細胞增殖和遷移的抑制作用研究*

        2020-08-04 06:37:08舒仕瑜
        中國病理生理雜志 2020年7期
        關(guān)鍵詞:結(jié)果顯示膠質(zhì)培養(yǎng)液

        許 燕, 舒仕瑜

        (1重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院麻醉科,2重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科,重慶400000)

        小膠質(zhì)細胞(microglia)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細胞,一直以來被認為是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵御病原入侵的第一道防線[1]。在正常的大腦內(nèi),小膠質(zhì)細胞能不斷運動,執(zhí)行多種功能,例如突觸調(diào)節(jié)、吞噬凋亡的細胞碎片、防御感染等。當組織發(fā)生損傷時,小膠質(zhì)細胞會遷移到損傷部位周圍,發(fā)揮屏障作用[2]。但是在腦缺血、感染等病理狀態(tài)下,小膠質(zhì)細胞可被迅速激活,活化的小膠質(zhì)細胞將釋放多種炎癥因子,包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)等,從而誘導周圍細胞損傷。已有研究表明,活化的小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如神經(jīng)退行性疾?。?]、腦出血[4]等)中起著重要的作用。因此,抑制小膠質(zhì)細胞的活化并減少炎癥因子釋放,對緩解神經(jīng)系統(tǒng)損傷炎癥反應有重要意義[5]。

        花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)著機體的細胞分化、增殖、激素分泌、凝血及纖溶系統(tǒng)動態(tài)平衡等生理過程。20-羥二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)是AA 的代謝產(chǎn)物,其水平上升對于炎癥反應、氧化應激、心血管疾病發(fā)生等都有重要意義[6]。HET0016 是 20-HETE合成酶的抑制劑,研究證實HET0016 可減小小鼠腦梗死局灶性缺血的體積,并改善神經(jīng)功能評分,其機制與增強 Na+-K+-ATP 酶活性有關(guān)[7]。此外,有實驗證明,HET0016可通過抑制 MMP-9 表達、JNK 通路和氧化應激以激活緊密連接蛋白的表達,從而減輕實驗性創(chuàng)傷后腦水腫,發(fā)揮保護腦屏障功能[8]。但是HET0016 是否能在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞增殖和遷移中發(fā)揮作用,目前并不清楚。

        核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是一種快反應因子,以無活性的形式廣泛存在于多種組織和細胞中,被激活以后參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9]。近年來的研究顯示,NF-κB 活化與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD)、帕金森?。≒arkinson disease,PD)等[10]的發(fā)生有密切的聯(lián)系。此外,在小膠質(zhì)細胞中,NF-κB 激活可通過核移位而參與調(diào)節(jié)炎癥因子的基因表達,而阻斷NF-κB 所介導的炎癥反應很可能是修復中樞神經(jīng)相關(guān)損傷的途徑之一[11]。本研究通過分離、培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細胞,觀察HET0016 對小膠質(zhì)細胞活力及遷移的影響,進一步檢測小膠質(zhì)細胞內(nèi)炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的表達水平及NF-κB 信號通路中p50 和p65 兩種蛋白的表達情況,為探究小膠質(zhì)細胞炎癥反應的機制提供參考資料。

        材 料 和 方 法

        1 儀器和試劑

        HET0016(Sigma);抗 CD11b、p50 和 p65 抗體(Abcam);DMEM/F12 培養(yǎng)液、PBS 和0.25%胰蛋白酶(HyClone);胎牛血清(Gibico);CCK-8 試劑盒(Dojindo);20-HETE ELISA 試劑盒(上海生工);TNF-α 和IL-1β ELISA 試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司)。

        2 主要方法

        2.1 小膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng) 取出生24 h 內(nèi)SD 大鼠放入75%乙醇中進行浸泡消毒,取出小鼠并轉(zhuǎn)移至無菌干凈的平皿中,用剪刀剪開顱骨,取出腦組織,剪去腦干后置于D-Hanks 洗液中清洗,去除血污后轉(zhuǎn)移至新的盛有D-Hanks 洗液的無菌培養(yǎng)皿中,仔細去除腦組織表面腦膜和血管(盡量在15 min 內(nèi)完成)。將剝離完血管膜的組織放入預置有1 mL 解剖液的青霉素小瓶中,用顯微剪剪碎(<1 mm×1 mm×1 mm),加入2 滴DNA 酶和1 mL 胰酶(胰酶終濃度為0.125%),于37℃孵箱中孵育15 min。結(jié)束后取出小瓶,將液體轉(zhuǎn)移至離心管中,并加5 mL 完全培養(yǎng)液,900×g離心 5 min 棄上清,重懸在 5 mL 無血清培養(yǎng)液中,轉(zhuǎn)移至75 cm2培養(yǎng)瓶中,加入10 mL 完全培養(yǎng)液(37℃預熱)。5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d,全量換液,以后每3 d半量換液。

        2.2 小膠質(zhì)細胞的分離純化 待原代細胞培養(yǎng)到9~14 d 時,細胞充分分層生長,用封口膜封閉培養(yǎng)瓶瓶口,將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫振蕩搖床上,在160×g下震蕩6 h,收集上清至無菌離心管中,400×g離心8 min,棄上清,加入4 mL 無血清培養(yǎng)液輕輕吹打重懸,均勻滴加于24孔培養(yǎng)板的中央4個孔中,于孵箱中培養(yǎng)半小時使小膠質(zhì)細胞貼壁,取出,吸出上清,再向每個孔加1 mL 培養(yǎng)液,所得細胞可用于細胞純度鑒定及下一步實驗。

        2.3 免疫熒光細胞化學染色 取種于載玻片中的小膠質(zhì)細胞,PBS 洗3 次,每次5 min。加入4%多聚甲醛進行固定,20 min 后用PBS 清洗三次,每次5 min。用0.1%Triton X-100進行破膜處理,一共3次,每次5 min。將載玻片置于濕盒內(nèi),加入5%山羊血清,室溫封閉30 min。加入抗CD11b 抗體(1∶200)于4℃過夜孵育。將載玻片從濕盒中取出,PBS 洗3 次,每次5 min。加入Goat anti-Rat IgG H&L(1∶1 000)置于濕盒內(nèi),室溫孵育30 min。用PBS 洗3 次,每次5 min。DAPI(1∶2 000)染核10 min。PBS洗3次,每次5 min,用免疫熒光防淬滅劑封片,晾干后置于熒光顯微鏡下觀察。

        2.4 細胞實驗分組 取小膠質(zhì)細胞,分為對照(control)組(培養(yǎng)液+細胞)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)組(50 μg/L LPS+培養(yǎng)液+細胞)、HET0016 組(1 μmol/L HET0016+培養(yǎng)液+細胞)和LPS+HET0016 組(50 μg/L LPS+1 μmol/L HET0016+培養(yǎng)液+細胞);其中LPS 和HET0016 的處理時間均為24 h,共處理時先用LPS處理24 h,再用HET0016處理24 h。

        2.5 流式細胞術(shù)檢測S 期細胞比例 處理結(jié)束后,將小膠質(zhì)細胞離心收集,用300 μL 含10%胎牛血清的PBS 重懸,轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 的EP 管中,加入0.7 mL 無水乙醇,于4℃固定過夜;次日,將EP 管于500×g離心 1 min 后,加入 1 mL PBS 重懸細胞,再加入400 μL 50 mg/L PI,避光孵育10 min,用流式細胞術(shù)分析S期細胞比例。

        2.6 CCK-8 法檢測細胞活力 將小膠質(zhì)細胞制備成細胞懸液,以每孔100 μL(含約8 000 個細胞)細胞懸液接種于96 孔板,培養(yǎng)24 h 后,按照實驗分組在培養(yǎng)板加入不同濃度的待測物,處理結(jié)束后,根據(jù)試劑盒說明書進行操作,向每個孔加入CCK-8 工作液(100 μL 培養(yǎng)液+10 μL CCK-8 溶液),于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h 后,用酶標儀測定450 nm 處的吸光度(A)。細胞相對活力(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

        2.7 細胞遷移實驗

        2.7.1 Transwell 遷移實驗 將細胞消化離心后,用完全培養(yǎng)液重懸,進行細胞計數(shù)后,將細胞稀釋成為1×108/L 的細胞懸液;先向Transwell 板中加入500 μL的完全培養(yǎng)液,將小室放入板中;再向Transwell小室中加入 200 μL 的細胞懸液,將 Transwell 板放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;處理結(jié)束后,取出Transwell 小室,吸掉培養(yǎng)液,用PBS 清洗。最后用結(jié)晶紫溶液染色10 min,PBS 清洗去除多余染料后,置于顯微鏡下觀察并拍照,計算遷移細胞的數(shù)量。

        2.7.2 細胞劃痕實驗 取適量小膠質(zhì)細胞接種于6孔板中,待細胞長滿后,用200 μL吸頭垂直于培養(yǎng)板劃痕;用PBS 清洗細胞3 次,去除細胞碎片和未貼壁細胞,加入無血清培養(yǎng)液,立刻在顯微鏡下觀察,并拍攝劃痕區(qū)域圖像(即0 h);繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后,再次于同一區(qū)域進行觀察并拍攝(即24 h)。

        2.8 ELISA 法檢測 20-HETE、TNF-α 和 IL-1β 的水平 將小膠質(zhì)細胞接種于6孔板中,每孔約4×105個,并分為對照組、LPS 組、HET0016 組和 LPS+HET0016組,每組設(shè)3 個復孔,處理結(jié)束后收集細胞上清液進行后續(xù)檢測。按照20-HETE、TNF-α 和IL-1β 檢測試劑盒步驟進行測定,在酶標儀中于490 nm 波長處測定A值。繪制標準曲線,并根據(jù)曲線計算對應的濃度。

        2.9 Western blot 檢測蛋白表達 依次提取各組細胞總蛋白,用BCA 法進行蛋白定量。制備用于SDSPAGE 的凝膠,每孔加入 40 μg 細胞總蛋白,90 V 電泳約30 min 后,調(diào)整電壓至120 V,電泳至溴酚藍到達玻璃板底部。取出凝膠,采用濕轉(zhuǎn)法于磚模夾子中210 mA 電泳2 h,蛋白可被轉(zhuǎn)到PDVF 膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h;TBST 清洗 3 次,每次 5 min;加入 I 抗(抗p50 和p65 抗體均按1∶1 000 稀釋),4℃孵育過夜;TBST 清洗3 次,每次5 min;加入II 抗,室溫孵育2 h;TBST 清洗 3 次,每次5 min;結(jié)束后加入顯色劑進行化學發(fā)光,在多功能凝膠成像系統(tǒng)下,觀察并拍照分析。

        3 統(tǒng)計學處理

        應用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,采用單因素方差分析進行組間比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        1 小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)和純度鑒定

        分離并培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細胞后,顯微鏡下可見小膠質(zhì)細胞貼壁生長,單個細胞呈細長或橢圓形,從胞體發(fā)出兩個或多個突起,胞體形態(tài)清晰,生長附著良好,成團情況少見,見圖1A、B。進一步用免疫熒光法檢測小膠質(zhì)細胞特異性表面抗原CD11b(呈綠色熒光),用DAPI 標記其胞核(呈藍色熒光)。結(jié)果顯示,視野內(nèi)所見細胞均呈綠色熒光,證實所檢測的細胞為CD11b 陽性細胞,即為小膠質(zhì)細胞,見圖1C、D。這說明通過本方法可獲得狀態(tài)良好、純度較高的小膠質(zhì)細胞,可用于繼續(xù)培養(yǎng)并進行下一步實驗。

        2 HET0016對LPS刺激后小膠質(zhì)細胞活力的影響

        CCK-8 結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS 組小膠質(zhì)細胞活力顯著提高(P<0.01);當 HET0016 濃度為0.5~1.5 μmol/L 時,小膠質(zhì)細胞的活力顯著下降(P<0.05);當應用1 μmol/L 的HET0016處理小膠質(zhì)細胞24~48 h 時,小膠質(zhì)細胞活力相比于LPS 組也有所下降(P<0.05),見圖2。因此在后續(xù)實驗中,HET0016處理小膠質(zhì)細胞的濃度為1 μmol/L,處理時間為24 h。

        Figure 2.HET0016 inhibited the viability of microglia induced by LPS.A:the effects of different concentrations of HET0016 on the viability of microglia;B:the viability of microglia after treated with 1 μmol/L HET0016 for different time.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖2 HET0016抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活力

        3 HET0016對小膠質(zhì)細胞上清液20-HETE 水平的影響

        ELISA 結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS 組小膠質(zhì)細胞上清液 20-HETE 水平顯著上升(P<0.05),HET0016 處理組20-HETE 水平顯著下降(P<0.05);與 LPS 組相比,LPS+HET0016 組 20-HETE 水平顯著下降(P<0.05),見圖3。

        4 HET0016對小膠質(zhì)細胞S期比例的影響

        Figure 3.The level of 20-HETE was decreased in the supernatant of microglia after HET0016 treatment.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖3 HET0016下調(diào)小膠質(zhì)細胞上清液20-HETE水平

        流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,對照組、HET0016組、LPS組和LPS+HET0016 組小膠質(zhì)細胞S 期比例分別為36.19%、27.37%、43.8%和34.48%;與對照組相比,LPS 處理能夠增加 S 期細胞百分比(P<0.05);而與LPS 組相比,LPS+HET0016 組S 期細胞百分比下降,即HET0016 處理能降低S 期細胞百分比(P<0.05),見圖4。

        5 HET0016對小膠質(zhì)細胞遷移的影響

        Transwell實驗結(jié)果顯示,LPS組穿膜小膠質(zhì)細胞數(shù)量較對照組顯著增多(P<0.05);與LPS 組相比,HET0016 組和LPS+HET0016 處理組穿膜細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05),見圖5A。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,LPS 組劃痕縮減面積顯著大于對照組(P<0.05);與 LPS 組相比,HET0016 組和 LPS+HET0016 組劃痕縮減面積顯著減?。≒<0.05),見圖5B。這2 個實驗結(jié)果一致,均說明HET0016 能抑制LPS 引起的小膠質(zhì)細胞遷移。

        6 HET0016 對小膠質(zhì)細胞炎癥因子(TNF-α 和IL-1β)釋放的影響

        ELISA 結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS 組小膠質(zhì)細胞上清液TNF-α和IL-1β水平顯著上升(P<0.05);與 LPS 組相比,HET0016 組和 LPS+HET0016 組小膠質(zhì)細胞上清液 TNF-α 和 IL-1β 水平顯著下降(P<0.05),見圖6。

        7 HET0016 對小膠質(zhì)細胞 NF-κB 通路 p50 和 p65蛋白表達的影響

        Western blot 結(jié)果顯示,與對照組比較,LPS 組p50 和p65 蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,HET0016 組和 LPS+HET0016 組 p50 和 p65蛋白表達量顯著下降(P<0.05),見圖7。

        Figure 4.HET0016 decreased the S-phase proportion in microglia induced by LPS.Mean±SD. n=3. *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖4 HET0016降低LPS誘導的小膠質(zhì)細胞S期比例

        討 論

        小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫細胞,介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的內(nèi)源性免疫反應。有研究證實,LPS 可誘導小膠質(zhì)細胞活化并大量釋放NO、TNF-α、IL-6 等炎癥因子,導致神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)炎癥反應;與此同時,小膠質(zhì)細胞的大量增殖將使得更多小膠質(zhì)細胞被活化,從而加重神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[12]。而應用非甾體抗炎藥水楊酸甲酯糖苷處理LPS 刺激的小膠質(zhì)細胞,可抑制小膠質(zhì)細胞內(nèi)炎癥因子IL-6 的釋放,且不同程度地抑制iNOS、COX-1和COX-2蛋白的表達,以緩解小膠質(zhì)細胞內(nèi)炎癥反應,進而對LPS刺激的小膠質(zhì)細胞發(fā)揮保護作用[13-14]。因此,調(diào)控小膠質(zhì)細胞增殖活化及炎癥反應對緩解神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有著重要意義。

        Figure 5.HET0016 inhibited the migration of microglia exposed to LPS.A:results of Transwell assay;B:results of scratch wound healing assay.Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖5 HET0016抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞遷移

        Figure 6.HET0016 decreased the levels of TNF-α(A)and IL-1β(B)in the supernatant of microglia.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖6 HET0016下調(diào)小膠質(zhì)細胞上清液TNF-α和IL-1β水平

        Figure 7.HET0016 decreased the protein expression of p50 and p65 in microglia.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖7 HET0016下調(diào)小膠質(zhì)細胞p50和p65蛋白表達水平

        本實驗結(jié)果顯示,LPS可引起小膠質(zhì)細胞增殖和遷移能力增強,炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的水平均有所增加,這與文獻報道結(jié)果一致[15]。小膠質(zhì)細胞的增殖和遷移能力增強將導致更多小膠質(zhì)細胞被活化,釋放大量炎癥因子,其中,IL-1β 和TNF-α 都被證實參與了神經(jīng)炎癥反應[13]。此外,本研究還檢測到LPS 能引起20-HETE 表達增加,而已有研究指出20-HETE的增加不僅與腦梗死的發(fā)生相關(guān)[16],還可以通過激活NF-κB 促進血管內(nèi)皮炎癥反應[17]。HET0016作為20-HETE 合成的特異性抑制劑,對20-HETE 的抑制效果比17-十八炔酸(17-octadecynoic acid,17-ODYA)和1-氨基苯并三唑(1-aminobenzotriazole,1-ABT)更為明顯,因此在很多由于20-HETE 失衡導致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病及心血管疾病中具有潛在價值[18-20]。本研究進一步探究HET0016 在LPS 刺激小膠質(zhì)細胞中的作用,結(jié)果顯示,HET0016在有效降低20-HETE水平的同時,不僅抑制了小膠質(zhì)細胞的增殖和遷移,還減少了LPS 所誘導的細胞內(nèi)炎癥因子IL-1β 和TNF-α的釋放。與我們實驗結(jié)果相似的是,HET0016在其它疾病模型中也發(fā)揮了一定作用。有研究證實,HET0016 能抑制缺血/再灌注大鼠模型中的超氧陰離子的產(chǎn)生,減輕脂質(zhì)過氧化程度,降低血腦屏障通透性,以減輕腦水腫[18]。而在紋狀體腦出血小鼠模型中,HET0016 可減少活化小膠質(zhì)細胞和變性壞死神經(jīng)元的數(shù)量,減小腦損傷體積,從而減輕腦出血后周圍神經(jīng)的損傷[21]。而在本研究中,HET0016 可通過抑制小膠質(zhì)細胞的活力和遷移能力,減少炎癥因子釋放,進而減輕小膠質(zhì)細胞對機體的損傷。

        NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于多種細胞中,激活后參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要的意義。有研究顯示,雷公藤內(nèi)酯可抑制小膠質(zhì)細胞的活化,緩解神經(jīng)系統(tǒng)損傷,其機制與下調(diào) NF-κB 的表達有關(guān)[22]。另外,20-HETE 可通過激活NF-кB 通路,進一步對血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮氧化應激和促炎作用,參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[23]。由于 NF-κB 以 p65/p50 異源二聚體發(fā)揮主要作用,因此本研究檢測了p50 和p65 蛋白的表達水平。結(jié)果顯示,LPS 處理后細胞內(nèi)p50 和p65 蛋白的表達水平顯著上升,而HET0016 處理不僅下調(diào)細胞中p50 和p65 蛋白表達水平,且抑制LPS 所引起的p50 和p65 蛋白表達上調(diào)。此外,p65/p50 蛋白表達水平增加還見于急性腎損傷模型、食管鱗癌組織等[24-25]。張思思等[26]研究證實,羥基積雪草苷可以有效抑制LPS 刺激的小膠質(zhì)細胞炎癥因子生成,其機制也與抑制 NF-κB 的表達有關(guān),因此 NF-κB 可能是調(diào)控小膠質(zhì)細胞炎癥反應的重要途徑之一。由于激活的NF-κB 需要轉(zhuǎn)移入核內(nèi)才能發(fā)揮功能,因此盡管HET0016 處理引起的p50 和p65 蛋白表達水平下調(diào)可在一定程度上抑制NF-κB 通路的功能,但是其中的機制需要更深入的研究。

        綜上所述,本研究結(jié)果顯示HET0016 能抑制LPS刺激的小膠質(zhì)細胞增殖和遷移能力,減少炎癥因子的釋放,其發(fā)揮作用的途徑很可能與NF-κB 通路有關(guān),然而更深入的作用機制有待進一步研究。

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