吳惠娟，張盛昔，楊瀟，胡因銘，王樂旬△，郭姣

《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》顯示我國(guó)心血管病現(xiàn)患人數(shù)約為2.9 億，其中90%以上與心臟有關(guān)［1］。心肌纖維化是眾多心臟疾病的共同病理改變，其持續(xù)進(jìn)展會(huì)嚴(yán)重影響患者的生存和預(yù)后［2］。預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化是心血管疾病防治的主要目標(biāo)，但目前臨床上仍缺乏有效防治心肌纖維化的藥物［3］。心肌成纖維細(xì)胞的異?；罨切募±w維化的核心環(huán)節(jié)［4］。巨噬細(xì)胞在不同條件刺激下可極化為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞（M1 型）或選擇性活化的巨噬細(xì)胞（M2 型）［5］。研究顯示不同型別的巨噬細(xì)胞在心肌纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用并不一致，可表現(xiàn)為抑制［6-7］和促進(jìn)［8-10］心肌纖維化的雙重作用。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)以明確不同型別巨噬細(xì)胞在原代心肌成纖維細(xì)胞活化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠10 只，體質(zhì)量150 g 左右，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。重組大鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、白細(xì)胞介素（IL）-4和干擾素（INF）-γ購(gòu)自美國(guó)PeproTech 公司，血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）α、磷酸化（p）-PDGFRα（Tyr720）、PDGFRβ、p-PDGFRβ（Tyr751）、膠原蛋白1（Col1a1）和平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子2（CCN2）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公 司，GAPDH 抗 體 購(gòu) 自 美 國(guó)ProteinTech 公司，Smad2 和p-Smad2（Ser465/Ser467）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology。Leica DMi8 倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司，PikoReal實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）儀和NanoDrop 2000 核酸濃度測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，Mithras LB-940 酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)Berthold公司。

1.2 方法

1.2.1 不同型別巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定 斷頸處死大鼠后，收集股骨和脛骨。用注射器吸取含1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，插入骨髓腔沖洗，收集沖洗液以提取骨髓細(xì)胞。1 000 r/min 室溫離心5 min，棄上清后加入紅細(xì)胞裂解液，靜置3～5 min后離心。用含1%雙抗、10%胎牛血清（FBS）以及10 μg/L M-CSF的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換成含10 μg/L M-CSF 和10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基。M-CSF 誘導(dǎo)7 d 后，用2 g/L 的乙二胺四乙酸（EDTA）消化細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。按1.0×106細(xì)胞/孔進(jìn)行接種，6～8 h細(xì)胞貼壁后，按照巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)的方法加入刺激因子［5］。M0（無刺激因子）、M1［加入100 μg/L 脂多糖（LPS）+10 μg/L INF-γ］、M2（加入20 μg/L IL-4）。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集培養(yǎng)上清并提取細(xì)胞mRNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過qPCR 鑒定不同型別巨噬細(xì)胞表型特征分子的表達(dá)，其中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和IL-12為M1型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［11］，精氨酸酶1（Arg1）和甘露糖受體（CD206）為M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［5］。

1.2.2 心肌成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［12］，10只大鼠斷頸處死后，在無菌環(huán)境下取出心臟。用含1%雙抗的PBS沖洗3～5次，去掉心房及多余組織，將心臟剪碎成1 mm×1 mm×1 mm 小塊，用PBS 洗3次。將心臟組織吸入無菌錐形瓶中，加入0.1%的膠原酶Ⅱ于37 ℃恒溫水浴中攪拌10～15 min，重復(fù)5～8次至消化完全。收集消化后的懸液過濾至15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，PBS清洗1次。加入紅細(xì)胞裂解液5 mL，混勻，靜置3 min 后離心，用含20%FBS 的DMEM 重懸細(xì)胞，差速貼壁法培養(yǎng)1.5 h后換液，保留貼壁細(xì)胞（即心肌成纖維細(xì)胞）。取3～5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞共培養(yǎng)及分組 共培養(yǎng)處理：按照每種細(xì)胞1.0×105/孔將巨噬細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞分別接種在上方的共培養(yǎng)小室和下方的培養(yǎng)孔中，分別設(shè)空白對(duì)照組（NT 組，心肌成纖維細(xì)胞）、M0組（M0型巨噬細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞）、M1組（M1型巨噬細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞）、M2組（M2型巨噬細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞）。上清處理：將收集到的巨噬細(xì)胞上清加入心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，每孔1.5 mL，細(xì)胞分組與共培養(yǎng)處理一致。培養(yǎng)12 h 后收集心肌成纖維細(xì)胞提取mRNA和蛋白，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.4 mRNA提取及qPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特征分子的表達(dá) 使用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA［13］。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃3 min；95 ℃30 s，60 ℃15 s，40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參，將所得Ct 值按2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。引物由上海Invitrogen公司合成，序列見表1。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集處理過的細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取蛋白質(zhì)，并用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取30 mg 蛋白進(jìn)行電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%BSA封閉1 h，4 ℃孵 育 α -SMA、CCN2、PDGFRα、p-PDGFRα（Tyr720）、PDGFRβ、p-PDGFRβ（Tyr751）、Smad2、p-Smad2 和GAPDH一抗（均為1∶1 000稀釋）孵育過夜，洗膜5 min×3次。室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000稀釋）1 h，洗膜4次后用ECL發(fā)光液檢測(cè)信號(hào)并計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光 將已制備好的細(xì)胞爬片用PBS浸洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，0.5%的Triton X-100 室溫通透20 min，PBS浸洗后滴加山羊血清封閉30 min。棄去PBS，滴加Col1a1 和α-SMA 一抗（1∶100 稀釋）并放入濕盒中，4 ℃孵育過夜。PBS浸洗爬片3次，每次3 min，滴加熒光二抗（1∶1 000稀釋），37 ℃孵育1 h。PBS浸洗爬片3次，滴加DAPI避光孵育5 min，PBS清洗后用吸水紙吸干液體。加入抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下采集圖像，觀察Col1a1和α-SMA的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同型別巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果 與M0型相比，M1型巨噬細(xì)胞iNOS和IL-12的mRNA水平顯著升高，M2 型中Arg1 和CD206 的mRNA 水平顯著升高（P＜0.05），提示M1型和M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功，見表2。

Tab.2 Determination of different subtypes of macrophages表2 不同型別巨噬細(xì)胞的鑒定（n=3）

Tab.2 Determination of different subtypes of macrophages表2 不同型別巨噬細(xì)胞的鑒定（n=3）

＊＊P＜0.01；a與M0型相比，b與M1型相比，P＜0.05

型別M0型M1型M2型F iNOS mRNA 1.00±0.17 86.03±2.85a 0.84±0.10b 2661.143＊＊IL-12 mRNA 1.00±0.25 21.48±1.66a 1.42±0.35b 419.207＊＊Arg1 mRNA 1.00±0.20 0.68±0.08 9.82±1.39ab 122.511＊＊CD206 mRNA 1.00±0.13 0.87±0.27 20.26±1.83ab 326.724＊＊

2.2 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后心肌成纖維細(xì)胞Col1a1 和α-SMA 的表達(dá)變化 熒光顯微鏡下可見，與NT 組相比，M0 組Col1a1 和α-SMA 表達(dá)增多；而與M0 組相比，M1 組中Col1a1 和α-SMA 少量表達(dá)；而M2 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中Col1a1 和α-SMA大量表達(dá)，見圖1。

Fig.1 The activation of cardiac fibroblastsco-cultured with macrophages(immunofluorescence,×200)圖1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞活化的影響（免疫熒光，×200）

2.3 不同型別巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的影響 巨噬細(xì)胞上清處理后心肌成纖維細(xì)胞顯示了和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)類似的情況。與NT組和M0組相比，M1 組中Col1a1 和α-SMA 少量表達(dá)，而M2組中Col1a1和α-SMA大量表達(dá)，見圖2。

Fig.2 Effects of macrophage supernatant on cardiac fibroblasts(immunofluorescence,×200)圖2 巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的影響（免疫熒光，×200）

2.4 不同型別巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響 與M0 組相比，M1 組Col1a1 和Col3a1 的mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），而在M2 組中則顯著升高（P＜0.05），見表3。與M0組相比，M1 組中α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而M2 組中α-SMA 和CCN2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見表3、圖3。

Tab.3 Effects of macrophage supernatants on fibrotic genes in cardiac fibroblasts表3 巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響 （n=3）

Tab.3 Effects of macrophage supernatants on fibrotic genes in cardiac fibroblasts表3 巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響 （n=3）

＊＊P＜0.01；a與NT組相比，b與M0組相比，c與M1組相比，P＜0.05

組別NT組M0組M1組M2組F蛋白水平α-SMA/GAPDH CCN2/GAPDH 0.10±0.01 0.12±0.02 0.15±0.01a 0.26±0.02abc 53.843＊＊mRNA水平Col1a1 1.00±0.05 1.10±0.15 0.70±0.10ab 1.49±0.17abc 20.592＊＊Col3a1 1.00±0.16 1.29±0.14 0.67±0.08ab 2.03±0.26abc 33.754＊＊0.76±0.12 0.97±0.09 0.47±0.10ab 1.33±0.16abc 28.681＊＊

Fig.3 Effects of macrophage supernatants on fibrotic genes in cardiac fibroblasts圖3 巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 不同型別巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌纖維化相關(guān)通路分子表達(dá)的影響 4 組細(xì)胞TGFβRⅡ和PDGFRα的mRNA 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PDGFRα 和TGFβRⅡ通路關(guān)鍵分子Smad2的總蛋白及磷酸化水平?jīng)]有明顯改變。與NT 組和M0 組相比，M1 組PDGFRβ 的mRNA 和蛋白磷酸化水平顯著降低，而其蛋白磷酸化水平在M2 組中則明顯升高（P＜0.05），見圖4、表4。

Fig.4 Effects of macrophage supernatants on fibrotic signaling pathways in cardiac fibroblasts圖4 巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞纖維化通路的影響

Tab.4 Effects of macrophage supernatants on fibrotic signaling pathways in cardiac fibroblasts表4 巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞纖維化通路的影響（n=3）

Tab.4 Effects of macrophage supernatants on fibrotic signaling pathways in cardiac fibroblasts表4 巨噬細(xì)胞上清對(duì)心肌成纖維細(xì)胞纖維化通路的影響（n=3）

＊＊P＜0.01；a與NT組相比，b與M0組相比，c與M1組相比，P＜0.05

3 討論

心肌纖維化幾乎與所有的心臟疾病都有關(guān)聯(lián)，心肌梗死、心臟外科手術(shù)、高血壓、心肌病、毒性因子（乙醇和蒽環(huán)類藥物）、代謝紊亂（糖尿病和肥胖）以及高齡等都能促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展［14］，因此至今仍缺乏有效的防治措施阻止和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化。在本研究中，筆者通過體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同型別巨噬細(xì)胞對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的活化有不同的影響，其中M1型巨噬細(xì)胞上清能夠抑制心肌成纖維細(xì)胞的活化，而M2型上清能夠促進(jìn)其活化。

目前不同型別巨噬細(xì)胞的區(qū)別在于：一是刺激物的不同，M1 型巨噬細(xì)胞的刺激因子是LPS，M2 型巨噬細(xì)胞的刺激因子是IL-4；二是表達(dá)的蛋白因子不同，M1型巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)CXC類趨化因子配體9（CXCL9）、iNOS、IL-12、CD80和TNF-α，M2型細(xì)胞可特異性表達(dá)CD206、Arg1、TGF-β和IL-10等［5］。筆者選擇了iNOS 和IL-12 作為M1 型的標(biāo)記，選擇CD206 和Arg1 作為M2 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記，證實(shí)這些標(biāo)記能夠反映各自的型別，表明M1 和M2 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。

目前不同型別巨噬細(xì)胞的具體作用仍有分歧。有研究顯示M2 型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)能夠促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化動(dòng)物模型中，M2型巨噬細(xì)胞在纖維化的心臟組織中聚集，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化和膠原的合成與分泌［16］。在基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）敲除的小鼠心肌梗死模型以及衰老的小鼠模型中也證實(shí)了類似的結(jié)果［10］。在IL-13 敲除的小鼠心肌梗死模型中，M2 型巨噬細(xì)胞在損傷的心臟組織中減少，心肌纖維化程度增加，心功能惡化［8］。在清道夫受體A（SR-A）敲除的心肌梗死模型、主動(dòng)脈縮窄所致的心肌纖維化模型以及糖尿病心肌病模型中也觀察到類似的結(jié)果［7，17-18］。同樣，M1型巨噬細(xì)胞也有和M2類似的報(bào)道，即有些研究顯示M1型巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生［9］，而有些報(bào)道認(rèn)為M1型能夠抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展［6-7］。M1型巨噬細(xì)胞出現(xiàn)在損傷的早期，主要起到誘導(dǎo)炎癥發(fā)生發(fā)展的作用，而M2型巨噬細(xì)胞的高峰出現(xiàn)在損傷的后期，主要發(fā)揮組織修復(fù)的作用［19］。筆者推測(cè)在這些動(dòng)物模型中，并不是單一型別的巨噬細(xì)胞，而是M1和M2型巨噬細(xì)胞所占比例不同所致。

纖維化的發(fā)生過程中，TGF-β1 介導(dǎo)的TGFβRs通路和PDGFs介導(dǎo)的PDGFRs通路發(fā)揮了重要的作用［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)TGFβR 通路下游Smad2 和PDGFRs 通路中PDGFRα 蛋白活性變化不明顯，而是顯著影響了PDGFRβ的轉(zhuǎn)錄、翻譯及磷酸化水平，提示不同型別巨噬細(xì)胞對(duì)纖維化的影響主要是通過PDGFRβ 信號(hào)通路來發(fā)揮作用的。值得注意的是，體外分離培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中會(huì)發(fā)生活化，這可能和培養(yǎng)環(huán)境與在體環(huán)境不同有關(guān)［22］。因此，本研究并沒有設(shè)置纖維化陽(yáng)性組對(duì)照（比如利用TGF-β1或PDGFs進(jìn)行處理）以及在陽(yáng)性處理的基礎(chǔ)上利用不同型別巨噬細(xì)胞上清處理。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明不同型別巨噬細(xì)胞對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的活化有不同的影響，M2型巨噬細(xì)胞的上清能夠促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的活化，而M1型上清則能抑制其活化，這可能與調(diào)控PDGFRβ通路的活化有關(guān)。本研究只是在體外對(duì)巨噬細(xì)胞影響心肌成纖維細(xì)胞的活化進(jìn)行了探討，并沒有明確上清的具體成分以及探討不同型別巨噬細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)心肌纖維化的影響，這是今后的研究方向。