亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        茶樹CsWRKYIIcs轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析

        2020-08-04 09:09:40肖羅丹唐磊王偉東高岳芳黃伊凡孟陽楊亞軍肖斌
        中國農(nóng)業(yè)科學 2020年12期
        關鍵詞:鋅指進化樹結(jié)構(gòu)域

        肖羅丹,唐磊,王偉東,高岳芳,黃伊凡,孟陽,楊亞軍,2,肖斌

        (1西北農(nóng)林科技大學園藝學院,陜西楊凌 712100;2中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所,杭州 310008)

        0 引言

        【研究意義】茶樹(Camellia sinensis(L.)O.kuntze)起源于我國西南地區(qū),是一種重要的葉用經(jīng)濟作物[1]。全國的茶樹種植分為四大茶區(qū),跨度大、范圍廣,茶樹在生長過程中易遭受高溫、高鹽、干旱等非生物脅迫的傷害,如干旱脅迫使茶樹葉片脫水變枯,導致茶氨酸、兒茶素等含量減少,嚴重影響其品質(zhì)成分的積累,降低經(jīng)濟效益[2]。因此,鑒定出茶樹中的抗性基因,對利用分子育種技術定向篩選和培育抗性品種有重要研究價值?!厩叭搜芯窟M展】WRKY是植物重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,因具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域得名。根據(jù)不同數(shù)量的WRKY結(jié)構(gòu)域和不同類型的鋅指結(jié)構(gòu)將WRKY分成I、II、III家族,I家族有2個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2(C-X4-5-C-X22-23-H-X-H)型鋅指結(jié)構(gòu);II家族有1個WRKY結(jié)構(gòu)域及與I家族相同的鋅指結(jié)構(gòu)類型;III家族有1個WRKY結(jié)構(gòu)域,且含與I、II家族不同的C2HC(C-X7-C-X23-H-X-C)型鋅指結(jié)構(gòu)。依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析和氨基酸序列差異,II家族可進一步分為IIa—e等5個亞家族,其中IIc亞家族具有1個高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和C-X4-C-X22-23-H-X-H型鋅配體[3-5]。近年來,大量研究表明,植物中不同WRKY家族成員受病菌、干旱、高鹽、高溫和外源激素等誘導表達,參與多種植物對生物或非生物脅迫的抗性[6-10],其中IIc亞家族成員也參與對多種脅迫的響應過程,如擬南芥AtWRKY8、AtWRKY48、AtWRKY50、AtWRKY51和AtWRKY57對茉莉酸和水楊酸介導的信號通路有應答作用[11],棉花GhWRKY33、GhWRKY39、GhWRKY93、GhWRKY110和GhWRKY114參與低溫、鹽堿、干旱、外源脫落酸(ABA)等非生物脅迫的響應[12]等?!颈狙芯壳腥朦c】目前,茶樹中的WRKY基因家族已有報道[13-15],研究了不同WRKY的功能[16-22],表明WRKY與茶樹的生長發(fā)育和脅迫響應密切相關。茶樹的WRKY家族基因眾多,筆者課題組通過對茶樹高鹽、干旱和高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)多個IIc亞家族基因差異表達,推測其在茶樹響應非生物脅迫的過程中具有重要作用。【擬解決的關鍵問題】基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(http://tpia.teaplant.org/)中注釋的WRKY序列設計特異性引物,從‘陜茶1號’茶樹中克隆CsWRKYIIcs的cDNA序列,并進行一系列的生物信息學分析,探究不同組織和脅迫下的表達模式,驗證其轉(zhuǎn)錄活性,為后續(xù)深入研究抗逆機理提供理論參考。

        1 材料與方法

        試驗于2018—2019年在西北農(nóng)林科技大學園藝學院茶學實驗室進行。

        1.1 植物材料、生長條件和脅迫處理

        2018年6月底于人工氣候室對‘陜茶1號’一年生扦插苗進行水培預培養(yǎng),生長條件:晝夜溫度25℃/20℃,相對濕度70%—80%,光強度300 μmol·m-2·s-1,光周期為晝夜12 h/12 h。8月底時茶苗生長狀況良好且萌發(fā)出新芽,選取生長勢一致的健壯茶苗隨機分成4組,每組30株,分別置于4個水培箱中進行高鹽、模擬干旱、高溫及外源脫落酸脅迫處理。高鹽處理:將茶苗的根部全部浸入含200 mmol·L-1NaCl的溶液中;模擬干旱處理:將茶苗的根部全部浸入含20%PEG 6000的溶液中;高溫處理:茶苗置于40℃的人工氣候室;外源脫落酸處理:將ABA(少量95%乙醇溶解)溶于蒸餾水配制成100 μmol·L-1的溶液,均勻噴施于茶苗葉片。每個處理在0、1、2、4、8、12、24和48 h時取不同株的芽下二至三葉3—5片混勻分成3份,液氮速凍于-80℃冰箱備用。另從多株未處理的茶苗中,取初開的花朵、未木質(zhì)化的嫩莖、嫩根和頂芽下第二葉各0.1 g用于組織表達分析,材料液氮速凍于-80℃冰箱保存[23-24]。

        1.2 茶樹CsWRKYIIcs的克隆

        基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(http://tpia.teaplant.org/)中注釋的WRKY序列,以擬南芥IIc亞家族(https://www.arabidopsis.org/)的序列作為查詢序列,經(jīng)本地BLAST檢索及冗余性檢查后,獲得9個CsWRKYIIcs亞家族基因。利用在線IDT網(wǎng)站(https://sg.idtdna.com/calc/analyzer)從基因序列起始密碼子前和終止密碼子后的非編碼區(qū)設計特異性引物(表1),以‘陜茶1號’葉片cDNA為模板進行RT-PCR擴增,反應程序為94℃ 5 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 70 s,35個循環(huán);72℃延伸7 min。將膠回收得到的PCR產(chǎn)物連接至pMD-19T克隆載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

        1.3 生物信息學分析

        在ORF finder網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)分析開放閱讀框。利用ExPASy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/)分析理化性質(zhì)。在WOLF PSORT網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位預測,并利用cNLS Mapper網(wǎng)站(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)進行核定位信號預測。利用Meme suite 5.0.5(http://memesuite.org/)在線預測motif基序。DNAMAN 6.0.3.99進行氨基酸序列比對,并用WebLogo(http://weblogo)生成保守域序列l(wèi)ogo圖。利用MEGA7軟件中鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,bootstrap值設置為1 000,并 利 用EvolView(http://120.202.110.254:8280/evolview/)修飾進化樹。利用GSDS2.0網(wǎng)站構(gòu)建外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)。截取基因ATG上游約2 000 bp啟動子區(qū)域,利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測順式作用元件。

        1.4 實時熒光定量分析

        采用CTAB法[24]提取茶樹不同組織及脅迫處理的總RNA,保存于-80℃?zhèn)溆?。?×All-In-One RT Master Mix試劑盒(abm,加拿大)合成cDNA第一鏈作為模板,茶樹基因CsActin作為內(nèi)參[16],設計9個CsWRKYIIcs的定量引物(表1),按照Eva Green 2×qPCR Master Mix-ROX試劑盒(abm,加拿大)使用說明在QuantStudio?5熒光定量PCR儀進行qRT-PCR分析,反應條件為95℃ 3 min;95℃ 30 s,60℃ 70 s,40個循環(huán)。每個樣品設3個技術重復,用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)[25],用SPSS 26統(tǒng)計分析,GraphPad Prism 8.0.1作圖。

        1.5 轉(zhuǎn)錄活性驗證

        利用NovoRec? Plus PCR一步定向克隆試劑盒(Novoprotein,中國)分別將9個茶樹CsWRKYIIcs的cDNA序列融合至pGBKT7表達載體上的GAL4 DNA結(jié)合域,引物見表1,構(gòu)建pGBKT7-CsWRKYIIcs重組表達載體。通過PEG/LiAc法將重組表達載體轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)細胞中,在SD/-Trp缺陷固體培養(yǎng)基上30℃倒置培養(yǎng)3—5 d,觀察酵母菌落生長情況。挑取單菌落接種于SD/-Trp缺陷液體培養(yǎng)基中,在30℃下250 r/min振蕩培養(yǎng)約24 h,取3 μL點在SD/-Ade/-His及含X-α-gal的SD/-Ade/-His缺陷固體培養(yǎng)基上,于30℃倒置培養(yǎng)3—5 d,根據(jù)菌落生長情況及是否變藍來驗證轉(zhuǎn)錄活性。以pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽性對照,pGBKT7作為陰性對照[17,19]。

        2 結(jié)果

        2.1 茶樹CsWRKYIIcs的克隆及理化性質(zhì)分析

        以‘陜茶1號’cDNA為模板進行RT-PCR擴增,得到9條大小在500—1 000 bp不等的特異性條帶(圖1),將其純化后分別連接到pMD-19T克隆載體,挑取陽性單克隆測序,獲得9條CsWRKYIIcs的cDNA序列,依次命名為CsWRKYIIc1—CsWRKYIIc9,用于后續(xù)試驗分析。

        理化性質(zhì)分析表明,9個茶樹CsWRKYIIcs的開放閱讀框長度分別為561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp,分別編碼186、319、311、325、298、303、239、335、322個氨基酸。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為21.098(CsWRKYIIc1)—36.952kD(CsWRKYIIc8)。CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc4、CsWRKYIIc7的理論等電點大于7.0,是堿性蛋白;而CsWRKYIIc2、CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc5、CsWRKYIIc6、CsWRKYIIc8、CsWRKYIIc9的理論等電點小于7.0,是酸性蛋白。平均疏水性指標均為負值,說明它們是親水性蛋白。另外,核定位值區(qū)間及亞細胞定位預測顯示9個基因均定位于細胞核(表2)。

        表1 克隆、熒光定量和構(gòu)建酵母載體引物Table 1 Primers of cloning, qRT-PCR and constructing yeast vectors

        圖1 CsWRKYIIcs的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of CsWRKYIIcs

        表2 CsWRKYIIcs的理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical analysis of CsWRKYIIcs

        2.2 CsWRKYIIcs的序列比對分析

        9個茶樹CsWRKYIIcs蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果顯示(圖2-A),9個蛋白均具有一段高度保守的WRKYGQK序列,CsWRKYIIc7的C2H2型鋅指基序缺少“H-X-H”在內(nèi)的部分氨基酸殘基,其他蛋白均具有完整的C-X4-C-X23-H-X-H型鋅配體。此外,WebLogo分析WRKYGQK序列及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)出現(xiàn)頻率高(圖2-B),進一步驗證了WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)的高度保守性。

        2.3 進化樹及保守基序分析

        9個茶樹CsWRKYIIcs亞家族成員與擬南芥AtWRKY家族成員(https://www.arabidopsis.org/)系統(tǒng)進化樹分析見圖3,茶樹CsWRKYIIcs與擬南芥IIc亞家族成員聚集,除CsWRKYIIc1外,其他茶樹成員兩兩成對,說明9個CsWRKYIIcs均屬于IIc亞家族,并且在茶樹中可能發(fā)生了復制。

        圖2 CsWRKYIIcs的氨基酸序列比對分析Fig.2 Amino acid sequence alignment of CsWRKYIIcs

        圖3 CsWRKYIIcs和AtWRKYs的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CsWRKYIIcs and AtWRKYs

        9個茶樹CsWRKYIIcs與水稻(7條)、玉米(3條)、葡萄(8條)和擬南芥(12條)等不同物種的WRKYIIcs亞家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析顯示(圖4-A),39個成員被分為4個組,每組都包含茶樹的CsWRKYIIcs亞家族成員。其中CsWRKYIIc8和CsWRKYIIc9與VvWRKY33和VvWRKY37關系更近;CsWRKYIIc2與VvWRKY16親緣關系最近,并與CsWRKYIIc3及成對的CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7聚類;CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6與VvWRKY1和AtWRKY57關系更近;CsWRKYIIc1與VvWRKY3關系最近。另外,不同物種中的WRKYIIc亞家族成員有相似的保守基序(圖4-B)。motif1出現(xiàn)在39個WRKYIIcs亞家族成員中;除了茶樹CsWRKYIIc7外,其他38個成員均擁有motif2;4個組中都出現(xiàn)motif3和motif5,第1組、2組、3組中均含motif4。此外,同組成員擁有更多相同基序,如motif6和motif9只出現(xiàn)在第2組。而有的基序只出現(xiàn)在某一組中,如motif7只存在第1組,motif10出現(xiàn)在第3組,motif8只出現(xiàn)在第4組,說明WRKYIIcs在進化過程中不同組成員的保守基序有一定的差異。

        2.4 CsWRKYIIcs的結(jié)構(gòu)分析

        9個茶樹CsWRKYIIcs亞家族成員分為4個組(圖5-A)。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析顯示9個基因的編碼區(qū)包含1—2個內(nèi)含子和2—3個外顯子(圖5-B),表明它們在進化過程中可能行使相似的功能。

        2.5 順式作用元件預測

        9個茶樹CsWRKYIIcs的啟動子區(qū)域預測到多個與非生物脅迫相關的順式作用元件(表3),它們重復出現(xiàn)在一個或多個啟動子區(qū)域,可能影響CsWRKYIIcs對不同非生物脅迫的應答。值得探討的是,每個啟動子序列中高頻出現(xiàn)響應脫落酸的作用元件ABRE及受干旱誘導的作用元件MYB,在多個啟動子區(qū)域頻繁出現(xiàn)與干旱脅迫相關的作用元件MBS和MYC,由此推測9個CsWRKYIIcs可能與干旱脅迫密切相關。

        2.6 CsWRKYIIcs的表達分析

        qRT-PCR結(jié)果顯示(圖6),CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc8和CsWRKYIIc9在花中優(yōu)勢表達,根中次之,在莖和葉中的表達量最低;而CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7在根中表達量顯著,花中次之,在莖和葉中的表達量相對較低;CsWRKYIIc5在根中的表達量最高,莖中次之,在葉和花中相對較低;CsWRKYIIc6在根中的表達顯著高于莖、葉和花。這9個CsWRKYIIcs在根和花中的表達量明顯高于莖和葉,表明其組織表達存在差異。

        圖4 不同物種WRKYIIcs的進化樹和保守基序分析Fig.4 Analysis of phylogenetic tree and motifs of WRKYIIcs from different species

        圖5 CsWRKYIIcs的結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Structure analysis of CsWRKYIIcs

        圖6 CsWRKYIIcs在不同組織中的表達分析Fig.6 Expression analysis of CsWRKYIIcs in different tissues

        表3 順式作用元件預測Table.3 Cis-elements prediction

        圖7 CsWRKYIIcs在干旱脅迫下的表達分析Fig.7 Expression analysis of CsWRKYIIcs under drought stress

        在干旱、ABA、高鹽、高溫等不同脅迫處理下,CsWRKYIIcs主要呈不同的表達模式。干旱脅迫下,不同CsWRKYIIcs被階段性誘導(圖7),CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6的表達量先升高后降低,在8 h時達到峰值,達0 h的8倍和10倍;其他基因在1—4 h受干旱影響較小,僅有CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc3和CsWRKYIIc7在1 h明顯上調(diào);而8—48 h時間段總體表達水平高于前期,其中CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3均顯著上調(diào),CsWRKYIIc1在48 h的表達量為對照的36倍。在ABA誘導下,CsWRKYIIcs均強烈地上調(diào)表達(圖8),除CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7稍顯遲緩外,其他基因均能在1 h時快速作出反應,在隨后時間段也有較高表達水平,其中CsWRKYIIc1在48 h表達量最高,達處理前的60倍以上,CsWRKYIIc7在4和24 h均達對照的70倍。在鹽處理下,不同CsWRKYIIcs的表達水平不等(圖9),CsWRKYIIc1僅在4和48 h時被顯著誘導;CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6、CsWRKYIIc8于1—8 h變化較小,在12 h后表達量顯著增加;而CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7在24 h表達量達最高,其中CsWRKYIIc7表達量為處理前200倍。CsWRKYIIc9分別在2、12和48 h上調(diào)顯著,表達量最高可達處理前的400倍。高溫脅迫下CsWRKYIIcs的表達也存在差異(圖10),CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3在處理前期無顯著變化,分別在12和8 h時上調(diào)表達,后期表達量小幅度下降;CsWRKYIIc5在各階段上調(diào)表達,除2和8 h外;CsWRKYIIc6僅在24 h時上調(diào)表達;CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7、CsWRKYIIc9均在12 h時表達量達到最高,特別是CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可達對照的100倍;而CsWRKYIIc8在高溫下的表達受到強烈的抑制。這些結(jié)果表明,CsWRKYIIcs能快速應答ABA信號,不同程度地響應干旱、高鹽、高溫脅迫,高鹽脅迫下相對表達水平高于干旱、高溫脅迫,表明其可能對鹽脅迫有更高的敏感性。其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7表達量更顯著,可能參與了茶樹對這些脅迫的抗逆反應。

        圖8 CsWRKYIIcs在ABA誘導下的表達分析Fig.8 Expression analysis of CsWRKYIIcs under ABA-induced

        圖9 CsWRKYIIcs在鹽脅迫下的表達分析Fig.9 Expression analysis of CsWRKYIIcs under NaCl stress

        圖10 CsWRKYIIcs在高溫脅迫下的表達分析Fig.10 Expression analysis of CsWRKYIIcs under heat stress

        2.7 轉(zhuǎn)錄活性試驗結(jié)果

        利用酵母試驗研究CsWRKYIIcs蛋白的轉(zhuǎn)錄活性(圖11),所有重組表達載體、陽性對照及陰性對照均能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長;所有重組表達載體及陽性對照在SD/-Ade/-His培養(yǎng)基上正常生長,而陰性對照生長受抑制;在加入X-α-gal的培養(yǎng)基上,陰性對照長勢微弱且無變藍,但所有重組表達載體及陽性對照菌斑均呈現(xiàn)不同程度的藍色,表明9個茶樹CsWRKYIIcs重組蛋白都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

        圖11 CsWRKYIIcs的轉(zhuǎn)錄活性分析Fig.11 Transcription activity analysis of CsWRKYIIcs

        3 討論

        WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、防御調(diào)控和脅迫應答中發(fā)揮重要作用。有研究表明植物經(jīng)常發(fā)生鋅指結(jié)構(gòu)丟失事件,如菠蘿的AcWRKY23和‘鐵觀音’的CsWRKY39均出現(xiàn)鋅指結(jié)構(gòu)缺失[20,26],本研究也發(fā)現(xiàn)CsWRKYIIc7缺少鋅指殘基,推測缺失可能導致其功能差異,還需要進一步研究。基因結(jié)構(gòu)分析顯示9個CsWRKYIIcs含有1—2個內(nèi)含子和2—3個外顯子,蘋果MdWRKYIIcs亞家族成員也有類似現(xiàn)象[27],說明它們結(jié)構(gòu)組成之間密切聯(lián)系,可能有相似作用。

        大量研究表明植物中不同WRKY的組織表達具有特異性,例如,玉米ZmWRKY58在根中表達較強[28],陸地棉GhWRKY42主要在莖中表達[29],菊花CmWRKY40在葉片中表達量最高[30]。本研究中‘陜茶1號’CsWRKYIIcs在不同組織中的表達也有一定差異,根和花中的表達量顯著高于莖和葉,推測其可能在茶樹的根和花中發(fā)揮重要的生物學作用。前人研究證實不同茶樹品種間的WRKY存在較大差異[14],如‘龍井43號’的CsWRKY3在根中表達最強[18],CsWRKY7在老葉和根中都優(yōu)勢表達[22],‘鐵觀音’的CsWRKY48在根和莖中的表達強于葉和花,而CsWRKY6和CsWRKY31分別在老葉和花中優(yōu)勢表達[21],意味著不同的茶樹品種和生長環(huán)境可能導致WRKY在不同組織中的表達差異。

        近年來,眾多研究表明植物的WRKY參與響應多種非生物脅迫[31-33],本研究結(jié)果也說明CsWRKYIIcs與茶樹的逆境脅迫響應密切相關。在干旱脅迫下,CsWRKYIIcs被階段性誘導表達,與菊花[30]等植物有類似的表達模式,說明它們參與干旱脅迫的響應。前人證實激活AtWRKY57表達可上調(diào)ABA3和NCED3,提高ABA水平增強擬南芥的抗旱性[34]。CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6受干旱脅迫于8 h時達對照的8倍和10倍,系統(tǒng)進化樹表明其與AtWRKY57親緣關系相近,推測其可能具有相似的生物學功能。前人研究表明WRKY是ABA信號途徑的關鍵基因,如CsWRKY2通過參與到ABA下游信號途徑中響應干旱脅迫[16];過表達GmWRKY16誘導體內(nèi)ABA合成并調(diào)控脅迫相關基因表達從而提高植株的抗性[35]等。本研究結(jié)果顯示ABA誘導下所有CsWRKYIIcs均上調(diào)表達,且反應迅速,這可能與其表達快速而瞬時的特點相關[36]。其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7表達量高于其他CsWRKYIIcs,預示著它們可能在ABA信號調(diào)控途徑中起關鍵作用。另一方面,從啟動子區(qū)域預測到多個響應ABA和干旱脅迫的順式作用元件,推測CsWRKYIIcs可能通過ABA信號途徑參與茶樹的抗旱調(diào)控,將是下一步研究重點。

        在鹽脅迫下,CsWRKYIIcs被不同程度地誘導,與前人分析結(jié)果一致[15],表明其參與了茶樹對鹽脅迫的響應。有研究證實過量表達ZmWRKY17調(diào)節(jié)ABA和脅迫相關基因的表達,降低植株對鹽脅迫的耐受性[37]。而ZHU等[38]證實葡萄VvWRKY30受鹽脅迫強烈誘導,并通過活性氧清除和滲透壓積累增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。本研究中CsWRKYIIcs被鹽脅迫誘導較高水平表達,尤其是CsWRKYIIc7和CsWRKYIIc9可分別達對照的200和400倍,因此推測其可能在茶樹抗鹽反應中扮演重要角色。另外,WU等[13]分析表明不同茶樹品種的WRKY受溫度誘導存在差異,但又表現(xiàn)出群體一致性。本試驗中CsWRKYIIcs的表達沒有出現(xiàn)規(guī)律性的上調(diào)或下調(diào),其中CsWRKYIIc1、CsWRKYIIc2、CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7、CsWRKYIIc9表達量在12 h達到峰值,尤其是CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可達100倍,可能與ZmWRKY106和OsWRKY11具有相似的功能,即正向調(diào)控植物對高溫脅迫的耐受性[9,39]。而CsWRKYIIc8被強烈地抑制,與茶樹CsWRKY7和菊花多個CmWRKYs的表達趨勢一致[22,30],可能在高溫脅迫中起負調(diào)控作用。此外,本研究也發(fā)現(xiàn)組內(nèi)基因之間有相似的表達趨勢,如干旱脅迫下的CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc5和CsWRKYIIc6,鹽處理下的CsWRKYIIc2和CsWRKYIIc3、CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7,高溫脅迫下的CsWRKYIIc4和CsWRKYIIc7等,推測它們在逆境中可能有相似的響應機制,但還需進一步的試驗證明。

        另一個方面,WRKY是植物重要的轉(zhuǎn)錄因子家族,它的一個基本特征是具有轉(zhuǎn)錄激活活性,可以通過激活下游基因的表達參與調(diào)控作用[40-41]。因此,本文通過酵母試驗驗證茶樹CsWRKYIIcs的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示9個pGBKT7-CsWRKYIIcs重組表達載體在含X-α-gal的缺陷培養(yǎng)基上呈藍色,表明它們都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。前人報道茶樹中不同CsWRKYs定位于細胞核內(nèi)[16,19,22],本研究根據(jù)CsWRKYIIcs的核定位預測值和亞細胞定位預測結(jié)果,推測它們是定位于細胞核的調(diào)控蛋白。另外,研究表明WRKY的N端是表現(xiàn)活性的關鍵結(jié)構(gòu)[38,42],因此,可進一步驗證CsWRKYIIcs序列的活性部位,為后續(xù)試驗提供一定理論依據(jù)。

        4 結(jié)論

        從‘陜茶1號’中克隆獲得9個CsWRKYIIcs轉(zhuǎn)錄因子,除CsWRKYIIc7鋅指基序缺失外,其他8個CsWRKYIIcs均含有1個高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu),屬于IIc亞家族。9個蛋白均具有轉(zhuǎn)錄激活活性,可能作為轉(zhuǎn)錄激活因子參與茶樹的逆境調(diào)控。這些基因受ABA、干旱、高鹽和高溫脅迫不同程度的誘導表達,而且從啟動子序列預測到多個與非生物脅迫相關的作用元件,表明CsWRKYIIcs參與了茶樹對多種非生物脅迫的響應;高鹽脅迫下的總體表達水平高于干旱、高溫脅迫,表明其可能對鹽脅迫具有更高的敏感性。在ABA、干旱、高鹽和高溫處理下,CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7表達量變化顯著,可作為茶樹逆境候選基因進行深入研究。

        猜你喜歡
        鋅指進化樹結(jié)構(gòu)域
        鋅指蛋白與肝細胞癌的研究進展
        基于心理旋轉(zhuǎn)的小學生物進化樹教學實驗報告
        常見的進化樹錯誤概念及其辨析*
        生物學通報(2021年9期)2021-07-01 03:24:44
        C2H2型鋅指蛋白在腫瘤基因調(diào)控中的研究進展
        蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域劃分方法及在線服務綜述
        艾草白粉病的病原菌鑒定
        重組綠豆BBI(6-33)結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析
        組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
        Myc結(jié)合的鋅指蛋白1評估實驗性急性胰腺炎疾病嚴重程度的價值
        泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與泛素化信號的識別
        国产白浆大屁股精品视频拍| 久久精品国产亚洲av网在 | 国产精品内射后入合集| 超碰97人人射妻| 精品久久中文字幕系列| 免费国人成人自拍视频| 中文字幕一区二区人妻| 国产成人精品久久亚洲高清不卡| 亚洲人成伊人成综合久久| 久久精品国产亚洲AV香蕉吃奶| 中文字幕无码精品亚洲资源网久久 | 国产一区二区资源在线观看| 无码伊人久久大蕉中文无码| 熟妇人妻AV中文字幕老熟妇| 日本最大色倩网站www| 国产精品高清网站| 日韩av一区二区蜜桃| 久久久精品亚洲懂色av| 亚洲国产精品久久久天堂不卡海量| 无码精品a∨在线观看| 无码人妻精品一区二区三| 青青草在线这里只有精品| 日本一区中文字幕在线播放| 国内视频一区| 久久麻豆精品国产99国产精| 国产精品对白刺激久久久| 丰满人妻一区二区三区免费视频| 日本第一影院一区二区| 淫秽在线中国国产视频| 精品视频在线观看一区二区三区 | 国产精久久一区二区三区 | 麻花传媒68xxx在线观看| 99久久国内精品成人免费| 亚洲小少妇一区二区三区| 亚洲AV专区一专区二专区三| 久久无码一一区| 色一情一乱一伦一区二区三欧美| 天码人妻一区二区三区| 免费观看18禁无遮挡真人网站| 国产亚洲欧美精品永久| 日本a级免费大片网站 |