李杰，賈栩超，張瑞芬，劉磊，池建偉，黃菲，董麗紅，張名位

（1福建農(nóng)林大學食品科學學院，福州 350000；2廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣州 510610）

0 引言

【研究意義】黑芝麻（Sesamum indicumL.）又稱胡麻、黑脂麻、巨勝等，是脂麻科（胡麻科）脂麻屬植物脂麻的干燥成熟種子[1]。黑芝麻是中國傳統(tǒng)的藥食兩用作物，古代醫(yī)書記載黑芝麻具有補肝腎、益精血、養(yǎng)五臟、生津烏發(fā)、延緩衰老等功效[2]?，F(xiàn)代營養(yǎng)學研究表明黑芝麻富含蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[3]。另外，黑芝麻中還含有一些如芝麻酚、芝麻素、黑色素等功能性成分，其中黑色素是黑芝麻的特征活性成分。研究報道黑芝麻黑色素具有多種藥理保健活性，包括抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、保肝、預防神經(jīng)性疾病等[4-9]；此外，還可作為天然色素添加到食品、醫(yī)藥和保健品等當中，具有廣泛的應用前景。與黑豆、黑米中的花色苷類黑色素不同，黑芝麻黑色素是一種非均質(zhì)的類多酚聚合物，結(jié)構(gòu)十分復雜[10]，目前人們對黑芝麻黑色素的化學結(jié)構(gòu)仍缺乏深入認識。因此，對黑芝麻黑色素進行分離純化和結(jié)構(gòu)表征，明確其骨架結(jié)構(gòu)信息，有助于推進對大分子黑色素結(jié)構(gòu)的認知，也進一步為黑芝麻保健食品的開發(fā)提供可靠的科學支持，對黑芝麻精深加工與利用具有重要的科學意義和經(jīng)濟價值?！厩叭搜芯窟M展】已有學者對天然黑色素進行了研究，發(fā)現(xiàn)黑色素是由酚類或吲哚類化合物氧化聚合而形成的大分子，不溶于水和常見的有機溶劑（如己烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或丙酮），溶于堿水[10-12]，存在于動物[13-14]、植物[10]和微生物[15-16]中。黑色素根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可以分為真黑色素（黑色或深棕色）、棕黑色素（紅色至黃棕色）和異黑色素（黑色或棕色）[14,17]。目前對黑芝麻黑色素的研究主要集中在提取純化工藝[18-24]、理化性質(zhì)[20-23]及生物活性評價[4,6,8-9]等方面，也有部分學者對黑芝麻黑色素的結(jié)構(gòu)進行了初步研究。前人研究表明堿提酸沉法是提取黑芝麻黑色素的有效手段[21-22]。徐利萍[21]通過研究得出黑芝麻黑色素可能是含有酚羥基、C=O、高度共軛的C=C、芳香羧基等官能團的真黑素，而不含棕黑素。有學者采用紅外光譜、紫外光譜、元素分析等手段對黑芝麻黑色素進行研究[22,25-27]，結(jié)果表明黑芝麻黑色素結(jié)構(gòu)中含有羥基、羧基等官能團，并且存在吲哚結(jié)構(gòu)，不含噻嗪環(huán)。陸懋蓀等[28]、尹佩玉等[29]采用元素分析、紫外光譜、堿熔降解GC-MS等試驗表明黑芝麻黑色素可能屬于兒茶酚型的生物大分子。PANZELLA等[6]使用堿性過氧化氫分解黑芝麻色素并對降解產(chǎn)物進行分析，推斷黑芝麻色素和聚松伯醇在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性。而黑芝麻黑色素的精細結(jié)構(gòu)仍有待進一步研究明確，且黑芝麻黑色素的空間結(jié)構(gòu)特征和自由基特性也有待探究。黑芝麻黑色素被報道具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤等生物活性，單良等[5]、徐利萍[21]、白亮[23]研究發(fā)現(xiàn)黑芝麻黑色素具有良好的DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+等自由基清除能力，劉曉芳等[8]研究表明，黑芝麻黑色提取物具有保肝作用，這可能與其抗氧化作用有關(guān)。此外，KAMEI等[7]研究發(fā)現(xiàn)黑芝麻黑色素對體內(nèi)外腫瘤細胞的生長有抑制功能。CHU等[30]報道天然黑芝麻黑色素可用于淋巴結(jié)腫瘤光熱治療?！颈狙芯壳腥朦c】黑色素是一種非均質(zhì)類多酚聚合物，目前有關(guān)黑芝麻黑色素結(jié)構(gòu)的研究多是直接對粗黑色素提取物進行結(jié)構(gòu)表征，獲得的波譜信號復雜、重疊嚴重，且非黑色素雜質(zhì)對結(jié)構(gòu)表征有較大干擾；因此，本研究對黑芝麻黑色素進行分離純化，將其劃分為不同級分而后進行結(jié)構(gòu)表征，獲得不同級分的純度、含量和精細結(jié)構(gòu)信息、進而明確黑芝麻黑色素的級分組成及結(jié)構(gòu)特征，降低結(jié)構(gòu)表征的難度。此外黑色素是具有順磁性的多聚物大分子，結(jié)構(gòu)中含有大量的自由基，而黑芝麻黑色素的自由基特性和空間結(jié)構(gòu)特征仍然未知。本研究首次采用電子順磁共振（EPR）和X-射線衍射（XRD）對黑芝麻黑色素進行研究，明確其不同級分的自由基特性和空間結(jié)構(gòu)特征?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過HW-40C尺寸排阻色譜柱對黑芝麻黑色素粗提物進行分離，采用紫外可見光譜（UV-Vis）、元素分析（EA）、傅里葉紅外光譜（FT-IR）、核磁共振氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）、X-射線光電子能譜（XPS）、電子順磁共振（EPR）、X-射線衍射（XRD）等手段表征黑芝麻黑色素不同級分的結(jié)構(gòu)，旨在明確不同級分的色素純度、精細結(jié)構(gòu)信息、自由基特性和空間結(jié)構(gòu)特征，推進對黑芝麻黑色素結(jié)構(gòu)的認知，并通過DPPH、ABTS、FRAP和ORAC 4種方法評價黑芝麻黑色素不同級分的體外抗氧化活性，明確黑芝麻黑色素不同級分抗氧化活性的差異，為后期黑芝麻黑色素的深入科學研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2019年1—7月在廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室內(nèi)進行。

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 黑芝麻，2018年9月購自山東濟南，品種為中芝33號。

YOYOPEARL HW-40C尺寸排阻填料，日本東曹株式會社；DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）、ABTS（2,2'-疊氮基-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、AAPH（2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽）、Trolox（水溶性維生素E）、沒食子酸（gallic acid，GA）、烏賊墨黑色素（sepia melanin，SM）、福林酚試劑均購自美國Sigma公司，F(xiàn)RAP試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 BS124S分析天平，賽多利斯科學儀器公司；FDU-2110真空冷凍干燥機，日本東京理化器械株式會社；EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社；GZX-9420 MBE電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀（配備示差折光檢測器），美國Agilent公司；Elementar Vario EL Cube元素分析儀，德國公司；JES-FA 200電子自旋共振波譜儀，日本東京理化器械株式會社；Axis Ultra DLD多功能X-射線光電子能譜儀，英國Kratos公司；銳影（Empyrean）X-射線粉末衍射儀，荷蘭帕納科公司；VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀，德國公司；AVANCE AV 400型超導脈沖傅立葉變換核磁共振波譜儀，瑞士Bruker BioSpin公司；BioTek Gen5酶標儀，美國BioTek公司；TECAN Infinite 200酶標儀，瑞士Tecan公司。

1.2 黑芝麻黑色素原料的制備

1.2.1 黑芝麻黑色素粗提物的制備 黑芝麻黑色素的制備參考徐利萍[21]及康靜靜[22]的方法，稍作修改，取一定質(zhì)量的黑芝麻皮，按料液比1 : 10（w/v）加入甲醇，常溫下超聲提取30 min，過濾，重復3次，所得黑芝麻皮于50℃烘箱中烘干。甲醇提取后的黑芝麻皮，按料液比1﹕40（w/v）加入30 g·L-1的氫氧化鈉溶液，在60℃條件下水浴浸提90 min，過濾收集上清液，4 000 r/min離心5 min，合并上清液并抽濾，用6 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH=2，靜置待其沉淀，離心棄上清，用水反復洗滌沉淀，分裝，真空冷凍干燥后即得黑芝麻黑色素粗品。

1.2.2 黑芝麻黑色素的分離 取一定量的黑芝麻黑色素粗品，用0.1 mol·L-1NaOH溶液溶解后通過TOYOPEARL HW-40C尺寸排阻色譜柱分離，洗脫液為2%的乙醇水，分離得到兩個級分，分別記為Fr1和Fr2，F(xiàn)r1呈黑色，F(xiàn)r2呈棕褐色。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 黑芝麻黑色素不同級分色價的測定 精確稱取不同級分黑色素0.01 g，加入少量0.1 mol·L-1NaOH溶液使黑色素溶解，配成1 mg·mL-1的母液，再加入氫氧化鈉溶液稀釋一定的倍數(shù)，在λmax處測定其吸光值，色價計算公式如下：

式中，E：試樣液濃度為1%，用1 cm比色皿，在最大吸收波長λmax處測得吸光值；A：實際測得樣品的吸光值；C：被測試樣的濃度（g·mL-1）。

1.3.2 黑芝麻黑色素不同級分光譜定量測定 參考USACH等[31]的方法，稍作修改，將烏賊墨黑色素標準品配置成一系列不同濃度的溶液，分別測定不同濃度標準品溶液在470 nm下的吸光值，繪制標準曲線；將不同級分黑色素樣品配制成一定濃度的溶液，進行吸光值測定，代入烏賊墨黑色素標曲計算黑色素含量，黑色素含量以每g不同級分黑色素（干重）中所含的烏賊墨黑色素當量（Sepia melanin equivalents/g dry weight）表示，簡寫為mg SME·g-1DW。

1.3.3 黑芝麻黑色素不同級分的GPC測定 色譜條件：TSK-GEL G4000SW凝膠柱，TSK-GEL G3000SW凝膠柱；流動相為pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液，流速0.8 mL·min-1；柱溫40℃；進樣10 μL；標樣為已知分子量的葡聚糖標準品（Dextran，分子量為670 000、410 000、270 000、150 000、50 000、12 000、5 000和1 000 Da，Sigma公司）。

測定方法：將已知分子量的葡聚糖標準品用流動相分別配制成1.0 mg·mL-1的溶液，進樣量為10 μL，記錄色譜圖，以標準葡聚糖的分子量對洗脫體積進行回歸處理。將黑色素樣品用流動相配制成一定濃度的溶液，進樣10 μL，測得黑色素樣品的保留時間，利用標準曲線求得黑色素樣品分子量。

1.3.4 黑芝麻黑色素不同級分的紫外-可見光譜（UV-Vis） 按照1.3.1的方法將黑色素配制成一定的濃度，用UV-1800型紫外分光光度計掃描190－800 nm范圍內(nèi)不同波長下溶液的吸光值，繪制吸光值隨波長變化的曲線圖。

1.3.5 黑芝麻黑色素不同級分的元素分析（EA） 采用Elementar Vario EL III型元素分析儀測定黑芝麻黑色素不同級分的C、H、N、S含量，每個樣品3個平行。

1.3.6 黑芝麻黑色素不同級分的傅里葉紅外光譜（FT-IR） 將樣品和溴化鉀于105℃烘箱中干燥至衡重，除去樣品中的游離水或結(jié)晶水，以消除水分子對吸收峰的干擾。分別稱取2 mg樣品置于研缽中，放入40 mg干燥的溴化鉀粉末，在紅外燈光附近研磨均勻，將粉末裝入壓片模具中抽真空壓片成薄片。采用傅立葉紅外光譜儀對樣品進行掃描測定，掃描波長范圍400—4 000 cm-1。

1.3.7 黑芝麻黑色素不同級分的核磁共振

1.3.7.1 核磁共振氫譜（1H-NMR）1H共振頻率為600.17 MHz，譜寬12 019.2 Hz，采樣脈沖寬度為13.2 s，兩次采樣間隔時間為0，各樣品采樣次數(shù)為16次。樣品溶于DMSO中。

1.3.7.2 固體核磁碳譜（13C-NMR） 固體核磁參考DUFF等[32]的方法，稍作修改，采用交叉極化/魔角旋轉(zhuǎn)固體核磁共振。測試條件：共振頻率為100.628 MHz，4 mm CP/MAS固體探頭，場強9.4 T。

1.3.8 黑芝麻黑色素不同級分的XPS 參考XIAO等[33]的方法，稍作修改，采用XPS測定黑芝麻黑色素不同級分的表面化學成分。使用單色化的Al Kα X射線作為激發(fā)源（hν=1 486.60 eV），工作電壓為15 kV，功率為150 W。對每個樣品以160 eV的通能進行掃描（0—1 400 eV），然后以20 eV的通能進行Ti 2p、C 1s、N 1s和O 1s的高分辨率光譜掃描，根據(jù)靈敏度系數(shù)，從高分辨率光譜中得到各元素的原子百分比。將中性碳1s峰（C-C(H)）設置為285.00 eV作為電荷校正的參考標準。

1.3.9 黑芝麻黑色素不同級分的EPR 參考YAO等[34]的方法稍作修改，取適量烘干后的黑色素樣品于石英管中，插入樣品孔，室溫下進行波譜掃描。檢測條件：工作頻率為9.86 GHz（X波段），調(diào)制頻率為100 kHz，調(diào)制幅度為1 G，微波功率為1.85 mW，掃描時間為20.48 s。中心歸檔：3 509.650 G，掃描寬度：50 G，靜態(tài)場：3 484.65 G。

1.3.10 黑芝麻黑色素不同級分的X-射線衍射 將烘干后的黑色素樣品壓入直徑為1 cm、厚度為1 mm的圓片中。使用銳影X射線衍射儀對樣品進行掃描。檢測條件：Cu靶Kα射線，電壓40 kV，電流40 mA，發(fā)散射狹縫1/8°，防散射狹縫1/4°，發(fā)散射狹縫7.5 mm，2θ范圍：3°—80°，步長0.02°，每步停留時間40 s。

參考CASADEVALL等[35]的方法，將散射強度作為散射角的函數(shù)，數(shù)據(jù)由角度坐標轉(zhuǎn)換為Q標度，Q是X射線光子通過角度θ彈性散射時動量變化的大小。參數(shù)Q與散射角θ的關(guān)系式為：Q=（4πsinθ）/λ，λ為X-射線光子波長（λ=1.54 A）。將Q峰最大值與分子層之間的距離R聯(lián)系起來，其中R=2π/Q，R代表距離的平均值，與Q空間中堆疊特征的寬度有關(guān)。

1.3.11 黑芝麻黑色素不同級分的體外抗氧化活性測定

1.3.11.1 DPPH自由基清除能力的測定 黑芝麻黑色素不同級分的DPPH自由基清除能力參考TU等[14]和P?O-LEóN等[36]的方法，并稍作修改，稱取3.94 mg DPPH溶解于100 mL 95%的乙醇中配成0.1 mmol·L-1的DPPH工作液。將不同級分的黑色素配成不同濃度梯度的溶液，測定他們對DPPH自由基的清除能力。準確吸取1.0 mL不同濃度的樣品溶液與現(xiàn)配制的2.0 mL DPPH工作液充分混合，室溫避光反應30 min，測定其在517 nm吸光度A1，同時測定2 mL 95%乙醇溶液與1 mL樣品溶液的吸光度A2以及2 mL DPPH工作液與1 mL樣品溶劑的吸光度A0。每個樣品每個濃度重復3次，取平均值，計算DPPH自由基清除率，同時求得清除率為50%時所需樣品的濃度，即IC50值。按下列公式計算DPPH自由基清除率：

式中，A0：空白對照，表示2 mL DPPH工作液與1 mL樣品溶劑反應后的吸光值；A1：樣品組，表示2 mL DPPH工作液與1 mL樣品反應后的吸光值；A2：樣品空白，表示2 mL 95%乙醇與1 mL樣品反應后的吸光值。

1.3.11.2 ABTS自由基清除能力的測定 黑芝麻黑色素不同級分的ABTS自由基清除能力參考P?O-LEóN等[36]的方法，稍作修改，ABTS儲備液的配制：稱取66.23 mg過硫酸鉀溶解于100 mL蒸餾水中配制成濃度為2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液，再稱取19.20 mg ABTS溶解于5 mL過硫酸鉀溶液中配制成濃度為7 mmol·L-1的ABTS儲備液，在室溫、避光條件下放置13—16 h。ABTS待測液的配制：將ABTS儲備液在波長λ=734 nm處以10 mmol·L-1、pH 8的磷酸鹽緩沖液稀釋至吸光度為0.70±0.05。準確吸取1 mL不同濃度梯度的黑色素樣品溶液與4 mL ABTS待測液混合，渦旋震蕩30 s，避光反應6 min，在734 nm波長處測定吸光度A1，同時測定4 mL樣品溶劑與1 mL樣品的吸光度A2以及4 mL ABTS待測液與1 mL樣品溶劑的吸光度A0。每個樣品每個濃度重復3次，取平均值，計算ABTS自由基清除率，同時求得清除率為50%時所需樣品濃度，即IC50值。按下列公式計算ABTS自由基清除率：

式中，A0：空白對照，表示4 mL ABTS待測液與1 mL樣品溶劑反應后的吸光值；A1：樣品組，表示4 mL ABTS待測液與1 mL樣品溶液反應后的吸光值；A2：樣品空白，表示4 mL樣品溶劑與1 mL樣品溶液反應后的吸光值。

1.3.11.3 鐵離子還原力（FRAP）的測定 參照董麗紅等[37]的方法，具體步驟參考FRAP測定試劑盒說明書。向96孔板的每個檢測孔中加入現(xiàn)配的180 μL FRAP工作液?？瞻讓φ湛字屑尤? μL蒸餾水，標準曲線檢測孔內(nèi)加入5 μL各種濃度的FeSO4-7H2O標準溶液。樣品檢測孔內(nèi)加入5 μL待測樣品溶液，37℃孵育1 min后，于593 nm下測定吸光值。FRAP結(jié)果以每g不同級分黑色素（干重）中所含的FeSO4-7H2O當量（FeSO4-7H2O equivalents/g dry weight）表示，簡寫為mmol FeE·g-1DW。

1.3.11.4 ORAC抗氧化能力的測定 參考ZHANG等[38]的方法，并稍作修改。Trolox標準品及各種待測樣品用75 mmol·L-1pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋到適當濃度，反應用黑色96孔板，除樣品孔外，另設空白孔、對照孔、不同濃度的標準溶液孔（Trolox）和陽性對照孔（沒食子酸），各處理均設3個復孔。先向空白孔加入20 μL磷酸鹽緩沖液，其余孔分別加入樣品溶液、不同濃度的Trolox標準溶液（6.25、12.5、25和50 μmol·L-1）以及17.5 μmol·L-1的沒食子酸溶液，將96孔板放入提前調(diào)節(jié)溫度至37℃的酶標儀中孵育10 min；然后每孔加入200 μL 0.96 μmol·L-1熒光素鈉工作液，繼續(xù)孵育20 min后，除對照孔外，每孔再加入20 μL新鮮配置的119 mmol·L-1AAPH溶液。最后，將96孔板立即放入酶標儀中，在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長520 nm下測定各孔熒光值，每4.5 min測定一次，共35個循環(huán)。計算各孔熒光強度曲線下的面積（AUG），減掉空白孔的AUG，即得到各孔的Net AUG，根據(jù)不同濃度Trolox的Net AUG做標準曲線，計算各樣品的ORAC值。ORAC結(jié)果以每g不同級分黑色素樣品（干重）中所含的μmol Trolox當量（Trolox equivalents/g dry weight）表示，簡寫為μmol TE·g-1DW。

1.3.12 數(shù)據(jù)分析 采用Origin9.0軟件和SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖。試驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，每組試驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 黑芝麻黑色素不同級分得率及色價

如表1所示，黑芝麻皮經(jīng)堿提酸沉得到黑芝麻黑色素粗提物，粗黑色素經(jīng)過HW-40C尺寸排阻色譜柱分離后得到Fr1（黑色）和Fr2（棕褐色）兩個級分，得率分別為60%和24%，可知Fr1為黑色素的主要級分。從色價測定結(jié)果來看，F(xiàn)r1的色價低于粗黑色素，F(xiàn)r2的色價高于粗黑色素，表明Fr2的純度高于Fr1。

表1 黑芝麻黑色素不同級分的得率及色價Table 1 The yield and color value of different fractions of black sesame melanin

2.2 黑芝麻黑色素不同級分光譜定量測定結(jié)果

以烏賊墨黑色素為標準品，對黑芝麻黑色素不同級分采用吸收光譜法進行測定，由表2可知，F(xiàn)r1的含量為782.16 mg SME·g-1DW，F(xiàn)r2的含量為884.66 mg SME·g-1DW，通過吸收光譜法測定的黑芝麻黑色素兩個級分的純度為Fr2較Fr1高。

表2 黑色素不同級分光譜定量結(jié)果Table 2 Quantitative results of different fractions of melanin

2.3 黑芝麻黑色素不同級分GPC結(jié)果

以標準葡聚糖的分子量對洗脫體積進行回歸得到葡聚糖Dextran系列標準品的標準曲線方程，并由標準曲線求得Fr1和Fr2的重均分子量Mw分別為38 800和6 000 Da，數(shù)均分子量Mn分別為18 200和3 600 Da，分子量分布寬度分別為2.13和1.67（表3）。

2.4 黑芝麻黑色素不同級分紫外可見吸收光譜

黑芝麻黑色素的兩個級分與分離前粗黑色素的紫外吸收光譜如圖1所示，F(xiàn)r1和Fr2的紫外可見吸收光譜均為典型的黑色素吸收光譜，它在紫外區(qū)吸收強烈，隨著波長的增加，吸收逐漸減弱，兩個級分在210 nm左右均有一個明顯的吸收峰，在270—280 nm處有一小的吸收峰，在可見光范圍內(nèi)沒有最大吸收峰，且在270—280 nm處Fr1的吸收低于粗黑色素與Fr2。

2.5 黑芝麻黑色素不同級分元素分析結(jié)果

黑芝麻黑色素不同級分的元素分析結(jié)果如表4所示，F(xiàn)r1的C、N、H、S元素含量均高于Fr2，F(xiàn)r1的N/C和H/C高于Fr2。Fr1的C、H、S元素含量與粗黑色素相當，但N元素含量高于粗黑色素，F(xiàn)r2的C、H、N、S元素含量低于粗黑色素。Fr1、Fr2及粗黑色素的S元素與其他元素相比，含量很低，可忽略不計。

圖1 黑芝麻黑色素不同級分紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-visible absorption spectrum of different fractions of black sesame melanin

表3 黑色素不同級分GPC結(jié)果Table 3 GPC results of different fractions of melanin

表4 黑芝麻黑色素不同級分元素分析Table 4 Elemental analysis of different fractions of black sesame melanin

2.6 黑芝麻黑色素不同級分的FT-IR

黑芝麻黑色素不同級分的紅外光譜如圖2所示，與文獻報道[17,34,39]的烏賊墨、栗子殼及合成黑色素等的紅外光譜相似，F(xiàn)r1和Fr2在3 500—3 300 cm-1處均有一較寬的吸收峰，且吸收較強，該處為-OH、-NH2的伸縮振動；兩個級分在2 900—2 800 cm-1處有兩個較弱的吸收峰，屬于脂肪族中飽和烴基C-H的伸縮振動；在1 650 cm-1處的吸收峰為芳香族C=C鍵的拉伸與-COOH的對稱拉伸振動，1 450 cm-1處的吸收是脂肪族C-H變形引起，1 400 cm-1處的吸收峰是酚羥基的-OH變形和C-O伸縮以及COO-基團的對稱伸展引起，但在1 650、1 450和1 400 cm-1處Fr2較Fr1的吸收變得更強，F(xiàn)r1在1 540 cm-1左右有較弱吸收峰，F(xiàn)r2在1 540 cm-1吸收峰消失，可能與N-H變形和C-N拉伸有關(guān)；在1 250 cm-1處的吸收峰是由于-COOH中C=O的拉伸和O-H的變形以及酚的C-O鍵的拉伸，1 070和1 030 cm-1處均有吸收峰，屬于苯環(huán)上的C-H鍵彎曲振動引起，F(xiàn)r2較Fr1的吸收變得更強；900—700 cm-1間有許多較弱的吸收峰，是芳環(huán)和芳雜環(huán)上氫的彎曲振動引起，700 cm-1以下是脂肪碳上氫的振動吸收峰。

2.7 黑芝麻黑色素不同級分的核磁共振

圖2 黑芝麻黑色素不同級分FT-IR圖譜Fig.2 FT-IR spectrum of different fractions of black sesame melanin

圖3 黑芝麻黑色素不同級分的1H-NMR譜圖Fig.3 1H-NMR spectrum of different fractions of black sesame melanin

2.7.1 核磁共振氫譜（1H-NMR） 黑芝麻黑色素不同級分的核磁共振氫譜如圖3所示，F(xiàn)r1與Fr2的核磁共振氫譜脂肪區(qū)譜峰較為接近，芳香區(qū)譜峰有明顯區(qū)別。高場區(qū)δ 0.82處吸收峰為脂肪烴末端甲基的特征峰；δ 1.23為中心的吸收峰主要是直鏈或支鏈烷烴基團中的亞甲基峰；δ 2.50處的峰為DMSO溶劑峰；δ 3.37處的譜峰是水在氘代二甲基亞砜中的殘留吸收，化學位移在3.00—5.00 ppm的譜峰為與電負性較強的基團相連碳上的氫，例如連氧碳和連氮碳上的質(zhì)子，兩個級分在此區(qū)間內(nèi)都有較弱的吸收峰；低場區(qū)δ 6.00—8.40區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)較弱的寬峰，屬于芳香氫的吸收峰，部分活潑氫也在此區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)。芳香氫化學位移跨度大，說明各種芳香氫所處的化學環(huán)境差別較大，這些譜峰可能是芳環(huán)或芳雜環(huán)上的質(zhì)子。從圖譜峰面積區(qū)域可以看出，芳香氫和脂肪氫的比例為Fr1小于Fr2，表明Fr1中芳香結(jié)構(gòu)單元少，以飽和結(jié)構(gòu)單元為主，或者Fr1結(jié)構(gòu)中芳環(huán)取代基較多。

2.7.2 固體核磁（CP/MAS13C-NMR） 黑芝麻黑色素不同級分的核磁共振碳譜如圖4所示，在脂肪區(qū)（10—95 ppm）、芳香區(qū)（95—165 ppm）和羰基官能團區(qū)（165—220 ppm）都有譜峰出現(xiàn)。表明黑芝麻黑色素兩個級分中除了含有芳香聚合物的骨架外，還連接有其他結(jié)構(gòu)片段如脂肪酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等?；瘜W位移在10—40 ppm的譜峰可能是脂肪鏈上的甲基、亞甲基或者次甲基?；瘜W位移在55 ppm的譜峰可能是連氮的飽和碳或者甲氧基，化學位移在73 ppm處的譜峰是連氧的飽和碳。化學位移在100—140 ppm的譜峰是苯環(huán)或者雙鍵上的不飽和碳，140—165 ppm為連接氧、氮等雜原子的芳香不飽和碳的吸收峰。165—190 ppm的譜峰為羧酸、羧酸酯、酰胺及醌式結(jié)構(gòu)中的羰基吸收峰。Fr1中的羰基區(qū)域吸收峰較強，芳香碳區(qū)域（95—165 ppm）吸收峰面積小于脂肪碳區(qū)域吸收面積（10—95 ppm），表明Fr1結(jié)構(gòu)中可能含有較多的飽和結(jié)構(gòu)單元，可能是脂肪酸。Fr2的羰基區(qū)域吸收峰相對較小，芳香碳區(qū)域吸收峰面積與脂肪碳區(qū)域相當，表明結(jié)構(gòu)中不飽和結(jié)構(gòu)占比較高。兩個級分相比，F(xiàn)r1中羰基和飽和碳結(jié)構(gòu)單元含量較高，可能是結(jié)構(gòu)中有較多脂肪酸和蛋白質(zhì)取代，而Fr2芳香結(jié)構(gòu)單元（芳環(huán)、雙鍵）占比較高。

圖4 黑芝麻黑色素不同級分的CP/MAS 13C-NMR譜圖Fig.4 CP/MAS 13C-NMR spectrum of different fractions of black sesame melanin

2.8 黑芝麻黑色素不同級分的XPS

為了確定黑色素不同級分的官能團百分比，將C1s、O1s、N1s的高分辨率光譜曲線擬合如圖5。將C1s掃描得到的原始數(shù)據(jù)中最大的峰移至285.00 eV對整個光譜進行校正，進行峰的擬合，C1s圖譜有5個譜峰，分別為285.00 eV的C-C(H)、286.40 eV的C-OH/C-N、288.00 eV的C=O、289.00 eV的O-C=O和π→π鍵。N1s圖譜有3個譜峰，分別對應400.30 eV的-C-NH、399.50 eV的芳香N及402.00 eV的C-NH3+3個峰。O1s圖譜在531.50 eV和533.00 eV處有兩個主要譜峰，分別來自C=O和C-OH。

不同級分官能團的比例如圖6所示，C、N、O 3個元素分峰結(jié)果表明，F(xiàn)r1和Fr2兩個級分官能團的含量不同，在C1s譜中，F(xiàn)r1的C-C(H)和C=O官能團的含量高于Fr2，而Fr1的C-OH/C-N和O-C=O官能團的含量低于Fr2，F(xiàn)r1的C=O和O-C=O之間比例為7.90，F(xiàn)r2的C=O和O-C=O之間比例為2.10；在N1s譜中，F(xiàn)r1的C-NH官能團含量高于Fr2，而Fr1的芳香N含量低于Fr2，可能是Fr2比Fr1含有更多的雜環(huán)結(jié)構(gòu)單元，且Fr1中不含質(zhì)子化的C-NH3+；在O1s譜中，F(xiàn)r1的C-OH官能團的含量高于Fr2，但Fr1的C=O官能團含量略低于Fr2，且Fr1中不含吸收的H2O。

圖5 黑芝麻黑色素不同級分的C1s、N1s和O1s的XPS高分辨率光譜圖Fig.5 High-resolution spectrum of C1s, N1s and O1s of different fractions of black sesame melanin

圖6 黑芝麻黑色素不同級分的官能團相對百分比Fig.6 Relative percentage of different functional groups of different fractions of black sesame melanin

2.9 黑芝麻黑色素不同級分的EPR

黑色素因含有自由基而具有順磁共振特性，在EPR光譜中g(shù)值表示光譜分裂因子，線寬表示磁共振弛豫的強弱，通常用一次微分曲線上兩極值之間的距離表示（以G為單位），稱“峰對峰寬度”，記作ΔHpp。由圖7可知黑芝麻黑色素分離后的兩個級分均顯示出強烈的共振吸收，由單個對稱線組成，沒有超精細分裂，F(xiàn)r1較Fr2顯示出較強的共振吸收，類似于不同來源的其他合成黑色素和天然黑色素的EPR光譜。Fr1和Fr2的g值分別為2.0078和2.0085，F(xiàn)r1和Fr2的ΔHpp分別為0.7430和0.6950 mT。

2.10 黑芝麻黑色素不同級分的X-射線衍射

圖7 黑芝麻黑色素不同級分的EPR光譜Fig.7 EPR spectrum of different fractions of black sesame melanin

圖8 黑芝麻黑色素不同級分的X-射線衍射圖譜Fig.8 X-ray diffraction pattern of different fractions of black sesame melanin

黑芝麻黑色素不同級分的X-射線衍射圖譜如圖8所示，由圖可知Fr1和Fr2的X-射線衍射圖譜有明顯區(qū)別，F(xiàn)r1的X-射線衍射圖譜中出現(xiàn)了彌散的較弱的“隆峰”，而Fr2的X-衍射圖譜中未發(fā)現(xiàn)“隆峰”，F(xiàn)r1在2θ為22.52°處有較為突出的“隆峰”，由Q=(4πsinθ)/λ，Q值為1.59，由R=2π/Q，R值為3.94 ?。

2.11 黑芝麻黑色素不同級分的體外抗氧化活性

采用DPPH、ABTS、FRAP和ORAC四種方法評價黑芝麻黑色素不同級分的體外抗氧化活性，結(jié)果如表5所示，粗黑色素與Fr1和Fr2都具有DPPH和ABTS自由基清除能力，兩種自由基清除率IC50值大小依次為Fr1＞Fr2＞粗黑色素＞Vc，說明Fr1的DPPH和ABTS自由基清除能力弱于Fr2，且均弱于粗黑色素與天然抗氧化劑Vc。Fr1的FRAP值與粗黑色素差異不顯著，F(xiàn)r2的FRAP值顯著高于Fr1與粗黑色素，說明Fr2的FRAP抗氧化能力較強。ORAC值大小依次為：Vc＞Fr2＞粗黑色素＞Fr1，說明Fr2的ORAC抗氧化能力強于Fr1。以上結(jié)果表明，F(xiàn)r2的DPPH和ABTS自由基清除能力、FRAP和ORAC抗氧化能力均高于Fr1，說明Fr2的體外抗氧化活性較Fr1好。

表5 黑芝麻黑色素不同級分的體外抗氧化活性Table 5 Antioxidant activities of different fractions of black sesame melanin

3 討論

3.1 黑芝麻黑色素不同級分結(jié)構(gòu)表征

黑芝麻黑色素經(jīng)分離得到了黑色的Fr1和棕褐色的Fr2，兩個級分的紫外可見吸收光譜與劉元法等[26]報道的黑芝麻黑色素的吸收特征一致，其他天然黑色素如魷魚墨、烏骨雞黑色素也表現(xiàn)出同樣的紫外吸收特征[14,40-41]。TU等[14]認為天然黑色素的紫外吸收光譜在270—280 nm處的平臺吸收峰可能是因為與天然黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)引起的，因此，可以推測本研究分離得到的兩個黑芝麻黑色素級分中可能都含有蛋白質(zhì)。

由元素分析結(jié)果可知，F(xiàn)r1含有C、H、N、S四種元素，F(xiàn)r2含有C、H、N而不含S元素，ITO等[42]報道真黑色素N元素含量為6%—9%，不含S元素（0—1%）；棕黑色素N元素含量為8%—11%，S元素含量為9%—12%；KAMEI等[7,43]報道異黑色素含有極少量的氮甚至不含氮，僅存在于高等植物和真菌中，屬于酚類與蛋白質(zhì)結(jié)合的聚合物。根據(jù)Fr1和Fr2的N元素和S元素含量可知，黑芝麻黑色素的兩個級分均不是棕黑色素，F(xiàn)r1可能為真黑色素，F(xiàn)r2可能為異黑色素，與陸懋蓀等[28]的元素分析結(jié)果基本一致。

黑芝麻黑色素的兩個級分在3 500—3 300 cm-1、1 650 cm-1、500 cm-1附近均有較強的吸收峰，由此推測Fr1和Fr2中含有-OH、-NH2、-COOH、C=O等官能團，與陸懋蓀等[28]的紅外結(jié)果基本一致。與魷魚墨黑色素[40]相比，F(xiàn)r1和Fr2在2 900—2 800 cm-1處存在較弱的吸收峰，在1 070 cm-1及1 030 cm-1處有吸收峰，而魷魚墨黑色素在該處均無吸收峰，可能是黑芝麻黑色素的兩個級分含有較多的飽和結(jié)構(gòu)單元，且芳香環(huán)上含有較少的取代物。

核磁共振氫譜結(jié)果表明，F(xiàn)r2和Fr1在芳香區(qū)和脂肪區(qū)均有吸收，但Fr2比Fr1芳香區(qū)譜峰多，表明Fr2結(jié)構(gòu)中可能含有更多的芳香結(jié)構(gòu)單元，而Fr1結(jié)構(gòu)中芳香骨架上有較多的飽和單元（脂肪酸、氨基酸和蛋白質(zhì)）等取代。陸懋蓀等[28]的核磁氫譜結(jié)果表明芝黑素I的芳香性低于芝黑素II，與本研究結(jié)果一致，而本研究中，F(xiàn)r1和Fr2在δ 0—2 ppm處的吸收峰強度較陸懋蓀的弱了許多，該處屬于脂肪鏈烷烴的吸收區(qū)域，可能是Fr1和Fr2中脂肪酸的含量較少。KATRITZKY等[44]用核磁共振氫譜對烏賊墨黑色素進行了結(jié)構(gòu)表征，烏賊墨黑色素氫譜中芳香區(qū)信號呈現(xiàn)精細裂分特征，而黑芝麻黑色素兩個級分氫譜芳香區(qū)均是簇峰，究其原因是烏賊墨黑色素構(gòu)成單元較為單一，以5,6-二羥基吲哚（DHI）和5,6-二羥基吲哚二羧酸（DHICA）為主；而黑芝麻黑色素的構(gòu)成單元種類較多，連接方式多樣，因而呈現(xiàn)典型的雜聚物核磁共振氫譜特征。本研究中Fr1中羰基和脂肪碳結(jié)構(gòu)單元含量較Fr2高，但芳香區(qū)碳信號明顯弱于Fr2，表明Fr1結(jié)構(gòu)中可能有較多脂肪酸和蛋白質(zhì)取代，而Fr2芳香結(jié)構(gòu)單元（芳環(huán)、雙鍵）占比較Fr1高。ADHYARU等[45]研究發(fā)現(xiàn)烏賊墨黑色素的碳譜在脂肪區(qū)（10—95 ppm）、芳香區(qū)（95—165 ppm）和羰基官能團區(qū)（165—220 ppm）都有譜峰出現(xiàn)，與黑芝麻黑色素兩個級分的固體核磁類似。烏賊墨黑色素中連接雜原子的芳香碳信號（140—160 ppm）較黑芝麻黑色素的兩個級分強，而黑芝麻黑色素兩個級分在100—130 ppm處碳信號較強，表明烏賊墨黑色素芳香結(jié)構(gòu)中有更多氧、氮等雜原子取代，而黑芝麻黑色素的兩個級分結(jié)構(gòu)中芳香碳上氫原子和碳原子取代較多。

高分辨率XPS為黑色素化學結(jié)構(gòu)表征的有力工具[33,46]，本研究首次采用XPS高分辨率光譜對黑芝麻黑色素的兩個級分進行研究。由C1s分峰結(jié)果可知，F(xiàn)r1結(jié)構(gòu)中含有較多的酮羰基，而Fr2結(jié)構(gòu)中含有更多的羧羰基，F(xiàn)r1的羰基含量多于Fr2，與核磁共振碳譜結(jié)果一致。Fr1的C=O和O-C=O之間比例為7.9，F(xiàn)r2的C=O和O-C=O之間比例為2.1，與XIAO等[33]報道的烏賊墨（7.0）和烏鴉（1.9）的結(jié)果類似，表明Fr2較Fr1含有更多的單體及其氧化物。N1s譜中，F(xiàn)r1的C-NH官能團的含量高于Fr2，而Fr1的芳香氮的含量低于Fr2，且Fr1中不含質(zhì)子化的C-NH3+，說明Fr2中的氮多是以芳香氮的形式存在，表明結(jié)構(gòu)中可能存在更多的吲哚結(jié)構(gòu)單元，F(xiàn)r1中的氮多是脂肪氮，可能是一些蛋白質(zhì)上的氨基。在O1s譜中，F(xiàn)r1的C-OH官能團的含量高于Fr2，但Fr1的C=O官能團含量略低于Fr2，且Fr1中不含吸收的H2O，說明Fr1中的羥基含量高，結(jié)合核磁共振碳譜（60—90 ppm吸收峰較高）推測其可能更多的以醇羥基的形式存在。

黑芝麻黑色素的兩個級分均顯示出較強的共振吸收，與魷魚墨黑色素的EPR光譜類似。文獻報道魷魚墨黑色素g值為2.0037，ΔHpp為0.5090 mT，F(xiàn)r1和Fr2的g值分別為2.0078和2.0085，均略高于文獻報道[34,47]的黑色素g值，這是由黑芝麻黑色素的結(jié)構(gòu)決定的，F(xiàn)r1和Fr2的ΔHpp分別為0.7430和0.6950 mT，均高于魷魚墨黑色素的ΔHpp，在0.4—0.8 mT天然黑色素范圍內(nèi)[34]。以上說明黑芝麻黑色素不同級分與魷魚墨黑色素具有相似的自由基性質(zhì)。

晶體在X-射線衍射光譜中通常產(chǎn)生尖銳的峰，非晶態(tài)化合物如黑色素和多糖在衍射光譜中產(chǎn)生廣泛的特征，稱為非布拉格特征，這是由于無規(guī)則和重復結(jié)構(gòu)的相干散射造成的。研究報道[35,48-50]黑色素都有一個基本的衍射單元，該單元類似平面石墨烯結(jié)構(gòu)，在堆積距離上有所不同，堆積峰是黑色素的一個普遍特征。Fr1的X-射線衍射圖譜中出現(xiàn)了彌散的較弱的“隆峰”，Q值為1.59，R值為3.94 ?，F(xiàn)r2中并未出現(xiàn)類似的“隆峰”，表明二者空間結(jié)構(gòu)不同。Fr1結(jié)構(gòu)中存在平面共軛結(jié)構(gòu)的堆疊，而Fr2中堆疊結(jié)構(gòu)較少或者不存在。研究報道[35,48-49]烏賊墨黑色素的Q值為1.60，R值為3.46 ?，黑曲霉黑色素的Q值為1.41，R值為4.45 ?，雞腿菇黑色素的Q值為1.53，R值為4.10 ?，由此發(fā)現(xiàn)不同的黑色素Q值與層堆疊距離會有所不同，本研究中Fr1與烏賊墨黑色素的Q值與R值最為接近。

3.2 黑芝麻黑色素不同級分體外抗氧化活性分析

本研究采用DPPH、ABTS、FRAP、ORAC四種方法評價黑芝麻黑色素不同級分的抗氧化活性，其中，DPPH、ABTS、FRAP三種抗氧化均屬于單電子轉(zhuǎn)移（ET）機制，是體外評價活性物質(zhì)抗氧化能力的常見方法，操作簡單[51-52]；而ORAC抗氧化屬于經(jīng)典的氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）機制，是目前國際上常用的一種評價食品抗氧化能力的方法，較一般的自由基清除法更準確靈敏[52-53]。

單良等[5]研究表明黑芝麻黑色素具有清除DPPH·、O2-·、·OH等自由基的能力，黑色素的這種特性與其結(jié)構(gòu)中含有的酚羥基和醌式結(jié)構(gòu)有關(guān)。JACOBSON等[54]研究表明黑色素的抗氧化功能可能與其結(jié)構(gòu)中含有的類似醌和對苯二酚的殘基結(jié)構(gòu)有關(guān)。金春英等[55]研究得出具有多酚羥基或易氧化成醌式共軛結(jié)構(gòu)的化合物對自由基有顯著的清除作用。以上研究均表明酚羥基和醌式結(jié)構(gòu)與抗氧化活性密切相關(guān)。本研究4種抗氧化方法結(jié)果都表明Fr2的抗氧化活性較Fr1好，這與兩個級分的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。核磁共振碳譜表明Fr2含有更多的芳香結(jié)構(gòu)，也意味著Fr2可能具有更多的酚羥基和醌式羰基，而Fr1結(jié)構(gòu)中飽和結(jié)構(gòu)單元占比大，說明脂肪酸和蛋白質(zhì)取代較多，這些結(jié)構(gòu)往往不具備清除自由基能力，導致Fr1的抗氧化活性不如Fr2。VATE等[56]研究發(fā)現(xiàn)魷魚墨黑色素具有DPPH、ABTS自由基清除能力與鐵離子還原（FRAP）能力，抗氧化能力依次為（179.60±2.10）μmol TE·g-1蛋白質(zhì)、（957.80±89.30）μmol TE·g-1蛋白質(zhì)、（171.10±7.30）μmol TE·g-1蛋白質(zhì)；TU等[14]研究得出烏雞黑色素和合成黑色素的DPPH自由基清除率的IC50值分別為（37.30±2.62）μg·mL-1和（49.20±2.48）μg·mL-1，均高于Fr1和Fr2的IC50值，低于天然抗氧化劑Vc的IC50值（（13.00±1.04）μg·mL-1），說明Fr1與Fr2的DPPH自由基清除能力低于烏雞黑色素。

本研究通過分離純化結(jié)合多種波譜學手段對黑芝麻黑色素的結(jié)構(gòu)特征、自由基特性和空間結(jié)構(gòu)進行了表征，在前人研究基礎(chǔ)上推進了對黑芝麻黑色素的認知。目前黑芝麻黑色素不同級分的構(gòu)成單元及連接方式仍未明確，后續(xù)研究應嘗試采用合適的降解手段和更加先進的波譜學表征技術(shù)（如傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜）對其結(jié)構(gòu)進行研究，明確黑芝麻黑色素的精細結(jié)構(gòu)。此外，本研究通過體外抗氧化手段明確了黑芝麻黑色素的抗氧化活性，其體內(nèi)抗氧化作用有待后續(xù)研究，將通過動物試驗進一步證實。

4 結(jié)論

本研究采用HW-40C尺寸排阻色譜柱對黑芝麻黑色素進行分離純化，得到Fr1和Fr2兩個級分，分子量分別為38 800 Da和6 000 Da，且Fr2的純度較Fr1高。利用多種波譜學手段對兩個級分的結(jié)構(gòu)進行表征并評價它們的抗氧化活性，結(jié)果表明Fr1為黑芝麻黑色素的主要級分；結(jié)構(gòu)分析表明Fr1主要是真黑色素，F(xiàn)r2可能是異黑色素。Fr1和Fr2結(jié)構(gòu)中均含有羰基、羥基、氨基、芳環(huán)和氮雜環(huán)等官能團，F(xiàn)r2結(jié)構(gòu)芳香性較Fr1高；Fr2的DDPH和ABTS自由基清除能力、FRAP和ORAC抗氧化能力均高于Fr1。