張彬，李萌，劉晶，王俊杰，侯思宇，李紅英，韓淵懷

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030800）

0 引言

【研究意義】米色是消費(fèi)者衡量小米品質(zhì)的重要指標(biāo)，小米米色包括黃色、綠色、白色等多種性狀，其中，黃色小米所占比例最高。近年來(lái)，綠小米作為一類“營(yíng)養(yǎng)-功能型”新米種，備受人們青睞，一度被認(rèn)為是繼沁州黃之后身價(jià)最高的小米品種[1]。然而對(duì)于綠小米米色形成的機(jī)制卻鮮有報(bào)道，研究谷子籽粒中葉綠素合成代謝調(diào)控機(jī)制，可為今后通過(guò)基因工程手段提高谷物中葉綠素含量，方便人們通過(guò)膳食攝入更多的葉綠素奠定重要的理論基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】谷子（Setaria italica(L.) Beauv），在8 700年前被人們馴化[2]，具有生育期短、耐旱、耐貧瘠、穩(wěn)產(chǎn)性強(qiáng)等特點(diǎn)[3]，是重要的雜糧作物。谷子去殼后稱為小米，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如必需氨基酸、脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等[4-5]。米色具有多樣性，可直接反應(yīng)小米品質(zhì)的優(yōu)劣。黃小米中黃色素的主要成分是類胡蘿卜素，且以葉黃素和玉米黃質(zhì)為主要組成成分。綠小米中的黃色素含量雖低，但其葉綠素含量較高[5]。葉綠素（Chlorophyll）包括葉綠素a（Chla）和葉綠素b（Chlb），是葉片和果實(shí)色素積累的重要色素之一，其代謝過(guò)程受多個(gè)基因控制，葉綠素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因的突變可能導(dǎo)致其編碼的酶失活進(jìn)而使得植物中葉綠素含量降低，表型上會(huì)表現(xiàn)出泛黃、變白、斑馬葉和條紋葉等特征[6-7]。半個(gè)世紀(jì)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用表明葉綠素對(duì)人體具有消炎、造血、去臭、解毒的藥理作用，并且對(duì)于癌癥的治療也有一定的輔助療效[8]。對(duì)于葉綠素生物合成相關(guān)基因的研究始于孟德?tīng)枙r(shí)期，整個(gè)合成過(guò)程可分為2個(gè)階段：L-谷氨酰tRNA至原卟啉Ⅸ的生物合成和原卟啉Ⅸ至葉綠素的生物合成，包括18種酶參與的15步酶促反應(yīng)[9-10]。高等植物的葉綠素生物合成途徑已較為明確，主要集中在擬南芥[11]、水稻[12]等植物中，且在擬南芥中完成其全部基因的克隆。擬南芥葉綠素生物合成過(guò)程有15種酶參與反應(yīng)，并分離出27個(gè)編碼這些酶的基因[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著人們生活水平的提高，對(duì)飲食健康價(jià)值的理念越來(lái)越強(qiáng)，小米作為藥食同源性食品越來(lái)越受到重視，谷子品質(zhì)改良必然成為今后谷子育種工作的重要任務(wù)，因此，明確優(yōu)異米質(zhì)米色形成的分子機(jī)制勢(shì)在必行。然而多年來(lái)對(duì)于谷子的相關(guān)研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和種質(zhì)方面，而不同顏色小米米色的形成機(jī)制尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)對(duì)比分析綠色和白色小米葉綠素含量，小米籽粒內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)以及葉綠素生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)模式，對(duì)綠色小米米色形成的分子機(jī)制進(jìn)行研究，為揭示谷物籽粒中葉綠素的合成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以綠小米大青谷（DQG）、露米青谷（LMQG）和白小米牛毛白（NMB）為試驗(yàn)材料，其中大青谷和露米青谷為綠色小米谷子品種，對(duì)照材料牛毛白為白色小米谷子品種。試驗(yàn)材料于2018年5月種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)田（112°55′E，37°42′N），土壤類型為褐壤土。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法，設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)種植材料。待籽粒成熟時(shí)收獲置于50 mL離心管，并立即放入液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

RNAiso、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II，SYBR Premix Ex Taq II 試劑、PrimeSTAR HS聚合酶均購(gòu)自Takara公司；Epon LX112試劑盒（美國(guó)Williston公司）；丙酮、乙醇、甲醇、戊二醛、OSO4、磷酸緩沖液、乙酸鈾酰和檸檬酸鉛均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

非接觸式色差儀兼光澤儀VS450（美國(guó)Xrite公司）；Hitachi TEM H-7500（日本Hitachi公司）。

1.3 米色測(cè)定

運(yùn)用色差儀對(duì)米色（L*、a*、b*）進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前剔除發(fā)育不良、黑粒及碎粒等。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，取平均值。在這個(gè)測(cè)量系統(tǒng)中，測(cè)量參數(shù)L*代表亮度，a*代表紅色/綠色度，數(shù)值為正值表示為紅色，數(shù)值為負(fù)值表示為綠色；b*值代表黃色/藍(lán)色度，正值代表黃色，負(fù)值代表藍(lán)色[15]。

1.4 葉綠素含量的測(cè)定

將成熟收獲后的谷子進(jìn)行脫殼處理，稱取0.2 g，用液氮研磨成粉末，置于10 mL離心管中，分別加入6 mL丙酮和乙醇（2﹕1，v/v）混合溶液進(jìn)行提取，室溫避光條件下振蕩24—48 h，直至組織變白，12 000 r/min離心10 min，以乙醇和丙酮混合液為參比，測(cè)定645和663 nm處吸光值，每個(gè)品種重復(fù)3次。參照ARNON等[16]方法計(jì)算。

式中，V：提取液體積；W：樣品重量。

1.5 葉綠素合成基因表達(dá)模式分析

選取處于各品種灌漿中期（籽粒中乳狀物質(zhì)固化，胚處于粉狀物質(zhì)中）谷子，去殼后提取籽粒RNA，以1 μg RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA；利用Prime Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物（電子附表1），引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。運(yùn)用Bio-Rad CFX96TMTouch實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑，進(jìn)行熒光定量PCR。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量[17]。

1.6 SiCAO的克隆

從不同谷子幼苗葉片中提取各材料中的基因組DNA，使用PrimeSTAR HS聚合酶對(duì)不同米色品種中的SiCAO進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物為SiCAO-F：5′-CAA CAACCCCTGCTCATTCG-3′和SiCAO-R：5′-GTGAT CCGTCGCTAGGTA-3′），測(cè)序，通過(guò)Multalin進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)（http://mult alin.Toulouse.inra.fr/mult alin/mult alin.html）。

1.7 透射電子顯微鏡分析

同樣選取處于灌漿中期的各品種籽粒，參照KECK等[18]研究方法對(duì)綠米和白米小米籽粒進(jìn)行透射電鏡分析。從2種小米上切出1 mm×1 mm的新鮮片段，4℃置于4%戊二醛中8 h，然后用0.1 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液沖洗，經(jīng)1% OSO4固定2 h后，用乙醇和丙酮進(jìn)行脫水，并將其包埋在Epon LX112試劑盒中。為了便于透射電鏡觀察，將超薄切片（60 nm）用甲醇乙酸鈾酰和檸檬酸鉛進(jìn)行染色。所有透射電鏡圖像都是用Hitachi TEM H-7500設(shè)備拍攝。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，相關(guān)圖表使用OriginPro 8.0軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同品種米色表型分析比較

通過(guò)對(duì)綠色和白色小米谷子品種米色表型進(jìn)行對(duì)比分析（圖1），3個(gè)小米品種米色表型差異顯著。由表1色差儀測(cè)得數(shù)據(jù)顯示，2種綠色小米（L*＜50）的亮度值均低于白色小米（L*＞60），可能是由于白色小米的反射性更強(qiáng)導(dǎo)致。比較紅綠度指標(biāo)a*值結(jié)果顯示，大青谷和露米青谷的a*值分別為2.66和2.9，且趨向于負(fù)值，而牛毛白的a*值為4.99，顯著高于2種綠色小米，表明大青谷和露米青谷比牛毛白更綠，這與觀察到的表型差異結(jié)果一致。

2.2 不同米色品種小米葉綠素含量比較

通過(guò)對(duì)各品種籽粒中總?cè)~綠素、葉綠素a及葉綠素b含量進(jìn)行測(cè)定分析（圖2），2個(gè)綠色小米中的Chla、Chlb和Chl含量均顯著高于白色小米，其中，露米青谷總?cè)~綠素含量最高為0.102 mg·g-1，大青色略低為0.097 mg·g-1，而牛毛白中總?cè)~綠素含量?jī)H為0.016 mg·g-1，且在白色小米中Chlb的含量?jī)H為0.006 mg·g-1。

圖1 白小米和綠小米米色表型差異比較Fig.1 The phenotype comparison between white and green millet varieties

表1 不同谷子品種的米色指標(biāo)Table 1 The color indicators of different foxtail millet varieties

圖2 不同米色品種小米中葉綠素含量比較Fig.2 The comparison of chlorophyll contents in different millet color varieties

2.3 葉綠素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因在不同米色品種谷子籽粒中的表達(dá)模式分析

為了從分子水平上探索導(dǎo)致綠小米和白小米顏色表型差異的原因，利用qRT-PCR的方法檢測(cè)了對(duì)照組谷子品種籽粒中18個(gè)葉綠素生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式（圖3），位于葉綠素生物合成途徑上游部分的結(jié)構(gòu)基因在2個(gè)品種中均有較高的表達(dá)量，其中只有SiHEMA2在白米品種中的表達(dá)量高于綠色品種，SiPPXII、SiCHLM在2個(gè)綠米品種中的表達(dá)均顯著高于白米品種，其他結(jié)構(gòu)基因的在各品種間的表達(dá)都沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異。下游途徑中，除SiPORA在3個(gè)品種中的表達(dá)水平基本一致外，其余結(jié)構(gòu)基因都表現(xiàn)出明顯的品種間差異，值得注意的是，SiMTC、SiDVR和SiCHIG在白米品種中的表達(dá)要顯著高于綠米品種，與此相反，處于代謝途徑最下游的SiCAO雖然在2個(gè)綠米品種中都有高豐度的表達(dá)，但在白米品種中基本檢測(cè)不到該基因的表達(dá)。綜上所述，推測(cè)SiCAO的差異表達(dá)可能是造成綠小米葉綠素含量顯著高于白小米的主要原因。

2.4 谷子中SiCAO的克隆及蛋白序列比對(duì)分析

從這3種基因型中分別克隆出開(kāi)放閱讀框?yàn)? 626 bp的SiCAO，編碼541個(gè)氨基酸。對(duì)NMB、DQG和LMQG編碼的SiCAO蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析（圖4），3個(gè)品種的SiCAO蛋白序列分別在第171、184、195、286和318個(gè)氨基酸處存在差異。

圖3 白色品種NMB與綠色品種DQG和LMQG葉綠素生物合成基因表達(dá)量分析Fig.3 Quantitative real-time RT-PCR analysis of the expression profiling of the chlorophyll biosynthetic genes in white cultivate NMB and green cultivates DQG and LMQG

圖4 牛毛白（NMB）、大青谷（DQG）和露米青谷（LMQG）SiCAO蛋白序列比對(duì)Fig.4 Protein sequence alignment of SiCAO in NMB, DQG and LMQG

2.5 不同米色品種成熟期谷子籽粒質(zhì)體超微結(jié)構(gòu)比較

通過(guò)對(duì)白色和綠色小米谷子品種灌漿中期籽粒內(nèi)部透射電鏡結(jié)果的觀察比較（圖5），發(fā)現(xiàn)灌漿中期谷子籽粒胚乳層主要由圓形或橢圓形的淀粉體構(gòu)成，且為單粒淀粉體。與白小米相比綠小米中的淀粉體個(gè)體較大，著色很深。另外，綠小米淀粉體周圍充滿了質(zhì)體小球及圓球體，而白小米淀粉體周圍很少，推測(cè)綠色谷子可能通過(guò)灌漿后期淀粉體與質(zhì)體小球的相對(duì)含量、淀粉體向有色體的轉(zhuǎn)化對(duì)色素積累產(chǎn)生影響。

圖5 白小米和綠小米籽粒超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Ultrastructure of white and green millet grains

3 討論

谷子是中國(guó)北方重要的雜糧和抗旱作物，谷子脫殼后的小米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物外，還富含多種維生素和鐵、鈣、磷等人體必需的礦質(zhì)元素[19]。據(jù)谷子種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)記錄，小米米色包括金黃色、黃色、淡黃色、白色、綠色、橙黃色、灰色等在內(nèi)共16種顏色[20]。其中，綠小米因具有特殊的食療價(jià)值且資源稀缺，其商品價(jià)值也越來(lái)越高[1]。高等植物中的綠色來(lái)源于葉綠素，本研究2個(gè)綠米品種籽粒中均有較高的葉綠素含量，而白米品種籽粒中的葉綠素含量?jī)H為0.016 mg·g-1。顯然葉綠素在大青谷和露米青谷2個(gè)品種籽粒中的過(guò)量積累是使得它們米色呈現(xiàn)綠色的主要原因。

葉綠素生物合成整個(gè)途徑中一個(gè)或部分結(jié)構(gòu)基因的突變或表達(dá)量的變化都可以引起植物中葉綠素含量的變化[21-22]。為了進(jìn)一步從分子水平上揭示綠小米米色形成的分子機(jī)制，本研究以白小米作為對(duì)照，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)對(duì)對(duì)照谷子品種籽粒中葉綠素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。植物中ALA的合成是四吡咯化合物合成途徑的限速步驟，它決定葉綠素合成途徑的總流量[23]。HEMA家族基因編碼的谷氨酰tRNA還原酶在ALA的合成中起著重要作用。HEMA1受光誘導(dǎo)，主要在光合組織中表達(dá)，而HEMA2在非光合組織中表達(dá)[24]，因此，本研究主要針對(duì)非光組織中表達(dá)的HEMA2進(jìn)行研究。同時(shí)，HEMA2的表達(dá)表明植物中需要血紅素、西羅卡因和光敏色素[25]。本研究SiHEMA2在白小米品種籽粒中的表達(dá)明顯高于2個(gè)綠小米品種，這表明在白小米中四吡咯化合物的代謝更可能流向的是血紅素而不是葉綠素。葉綠素與血紅素的生物合成具有共同的前期步驟，ProtoⅨ由原卟啉原氧化酶（PPXI和PPXII）編碼，是血紅素和葉綠素生物合成的分支點(diǎn)。后期鎂螯合酶催化Mg2+插入ProtoⅨ形成Mg-ProtoⅨ，然后再生成葉綠素，鐵螯合酶催化Fe2+形成血紅素[11]。其中SiPPXII在綠小米中表達(dá)量顯著高于白小米，表明綠小米較白小米積累了較多的葉綠素合成前體物質(zhì)。鎂螯合酶由3個(gè)亞基組成（CHLI、CHLD和CHHL），它們各自的酶基因在3個(gè)品種谷子籽粒中的表達(dá)水平相似。

下游基因SiCHLM和SiCAO在綠米籽粒中的表達(dá)都顯著高于白米，特別值得注意的是，SiCAO在白米品種中基本不表達(dá)。CAO（葉綠素a氧化酶）是催化Chla轉(zhuǎn)化為Chlb的必要酶[26-27]。在水稻中，克隆出2個(gè)編碼CAO的基因，其中OsCAO1由光誘導(dǎo)，但OsCAO2僅在黑暗中表達(dá)，兩者獨(dú)立發(fā)揮作用[28]。研究表明，當(dāng)擬南芥中不存在AtCAO時(shí)，沒(méi)有或極少檢測(cè)到Chlb[29]。本研究中，SiCAO在白米品種籽粒中的不表達(dá)同樣導(dǎo)致在白小米中只檢測(cè)到極低水平的Chlb，由于白色小米中SiCAO的不表達(dá)水平抑制葉綠素的生物合成，最終產(chǎn)生白色表型。下游途徑中SiMTC、SiDVRS、SiCHIG在綠米品種中的低表達(dá)可能是由于綠小米里SiCAO的過(guò)量表達(dá)，促進(jìn)了Chlb的合成，從而拉動(dòng)整個(gè)代謝途徑向葉綠素合成的方向走，而較多的葉綠素的積累又會(huì)對(duì)前面代謝反應(yīng)有反饋抑制作用。因此，推測(cè)SiCAO在2種米色品種中的極顯著差異表達(dá)是導(dǎo)致綠小米和白小米米色差異的主要原因。

質(zhì)體是植物細(xì)胞特有的細(xì)胞器，根據(jù)顏色、結(jié)構(gòu)和代謝物積累的不同，分為葉綠體、有色體、白色體及淀粉體等[30]。對(duì)花卉、果實(shí)和蔬菜成熟過(guò)程中質(zhì)體的形成和分化研究主要集中在葉綠體向其他類型質(zhì)體轉(zhuǎn)化方面，伴隨著葉綠體的降解消失，逐步積累類胡蘿卜素至成熟期形成有色體。除此之外，很多情況下有色體也由淀粉體轉(zhuǎn)化而來(lái)，尤其是在非光合組織中[31]。之前的研究表明灌漿中期是谷子籽粒開(kāi)始積累色素的轉(zhuǎn)色期，因此，選用這個(gè)時(shí)期的谷子籽粒材料，并利用透射電鏡對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析[32]，結(jié)果顯示，谷子籽粒中的淀粉主要為單粒淀粉體，有別于水稻的復(fù)粒淀粉體，與小麥和高粱的單粒淀粉體類似[32-33]。與白小米相比，綠小米籽粒中的淀粉體顆粒大且顏色深，周圍充滿了質(zhì)體小球和圓球體。處于灌漿期綠色小米籽粒中的這些大顆粒淀粉體在后期成熟過(guò)程逐步將轉(zhuǎn)化為更多的有色體，結(jié)合之前的報(bào)道，由于綠小米籽粒中的滯綠基因SiSGR表達(dá)量受到抑制，進(jìn)而影響綠小米籽粒成熟過(guò)程中葉綠素的降解[34]。因此，綠小米中很可能由于生物合成途徑SiCAO的過(guò)量表達(dá)與降解途徑SiSGR的低表達(dá)共同促進(jìn)了其籽粒在后期成熟時(shí)，淀粉體向有色體轉(zhuǎn)化過(guò)程中葉綠素的積累，而白小米中SiCAO的不表達(dá)導(dǎo)致其籽粒中葉綠素含量極低，使得觀察到的淀粉體在綠小米中著色深，白小米著色淺。

4 結(jié)論

由于SiCAO在綠米品種籽粒中的過(guò)量表達(dá)和在白米品種籽粒中的不表達(dá)導(dǎo)致葉綠素含量的顯著差異，進(jìn)而造成綠小米和白小米顏色表型差異。SiCAO在綠色小米籽粒中積累葉綠素而呈現(xiàn)綠色表型中發(fā)揮作用。