張 典 陳金玉 張坤生 任云霞 尚 坤 吳 鵬

（天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室 天津300134）

肌原纖維蛋白（MP）是雞胸肉中含量最高的蛋白，對雞胸肉制品的凝膠性能起著決定性作用。在所有動物蛋白中，MP 熱誘導凝膠能力最強，0.5%含量就足以產(chǎn)生凝膠，MP 熱誘導凝膠是肉制品加工中最重要的特性[1]。近年來，國內(nèi)外學者研究了各種改性手段（如化學改性[2]和物理改性[3]等）對蛋白的改善效果，而磷酸化改性是目前研究的重要方向[4]。

氧化是肉制品在加工貯藏過程中品質(zhì)下降的重要原因。作為天然高效抗氧化劑，植物多酚被廣泛應(yīng)用于肉制品中以替代合成抗氧化劑[5-6]。植物多酚來源廣泛，具有抗氧化、抗菌、抗炎癥、抗過敏以及抗動脈硬化等生理功效，近年來成為人們關(guān)注和研究的熱點[7-8]。目前，關(guān)于磷酸化協(xié)同天然多酚對蛋白或肉制品凝膠特性的影響尚缺乏研究。

本文首先通過響應(yīng)面法對雞胸肉MP 磷酸化工藝進行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，研究兩種結(jié)構(gòu)不同的天然多酚（綠原酸和沒食子酸）協(xié)同磷酸化對蛋白凝膠特性（硬度、彈性、白度和保水性）的影響，旨在為多酚與磷酸鹽復配在雞胸肉質(zhì)構(gòu)特性的改善方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胸肉，天津市紅橋區(qū)華潤萬家超市西青道店；牛血清蛋白（BSA），美國Sigma 試劑公司；綠原酸，上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸，上海麥克林生化科技有限公司；其它試劑均為分析純級。

A2004A 電子天平，上海精天儀器有限公司；PT 2100 高速組織勻漿機，寶創(chuàng)科技股份有限公司；Avanti J-E 高效離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；U-5100 比例光束分光光度計，日立高新技術(shù)公司；EL20 實驗室pH 計，梅特勒-托利多儀器有限公司；磁力攪拌器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；通風櫥，科藝實驗室設(shè)備研制廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 預處理及MP 提取 參照Paek 等[9]和Zhang等[10]的方法并改進，雞胸肉剔除可見的脂肪結(jié)締組織，用刀斬碎成肉糜，加入4 倍體積的蛋白提取 液（0.1 mol/L NaCl，0.002 mol/L MgCl2，0.001 mol/L EDTA·2Na 和0.1 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH=7.0），均質(zhì)25 s，高速冷凍離心（5 000 r/min，15 min，4 ℃），棄上清液留沉淀，再加入蛋白提取液重復上述操作2 次得粗蛋白。將所得粗蛋白與4 倍體積的0.1 mol/L NaCl 溶液混合，用均質(zhì)機高速勻漿20 s，高速冷凍離心 （5 000 r/min，15 min，4℃），棄上清液留沉淀，再加入上述NaCl 溶液重復上述操作2 次，最后所得膏狀沉淀即為雞胸肉MP，提取的MP 保存于4 ℃，并于24 h 內(nèi)用完。

1.2.2 MP 濃度的測定 采用雙縮脲法[11]測定蛋白濃度，以牛血清蛋白（BSA）作為標準蛋白。

1.2.3 磷酸化MP 的制備 參考彭倩[12]磷酸化方法并加以改進，按照單因素試驗設(shè)計用量，將三聚磷酸鈉（STP）溶于一定濃度的NaCl 溶液中，并調(diào)節(jié)pH 至所需。稱取一定量的MP 與磷酸化試劑混合，均質(zhì)后在磁力攪拌器作用下反應(yīng)一定時間。反應(yīng)結(jié)束后于4 ℃，pH 7.4 的PBS 中透析12 h。

1.2.4 磷酸化程度的測定 采用鉬藍比色法[13]測定磷酸化程度，以磷酸二氫鉀作為標準液。

1.2.5 單因素試驗 MP 磷酸化過程中，影響磷酸化程度的主要因素為pH 值、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、NaCl 濃度、反應(yīng)時間和STP 含量。

1.2.5.1 pH 值的確定 稱取一定量MP，設(shè)置STP含量為2%，NaCl 濃度為0.5 mol/L，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20 mg/mL，反應(yīng)時間為2 h，考察pH 為7.0，7.5，8.0，8.5 和9.0 條件下MP 磷酸化程度。

1.2.5.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的確定 稱取一定量MP，pH 值由1.2.5.1 節(jié)確定，設(shè)置STP 含量為2%，NaCl 濃度為0.5 mol/L，反應(yīng)時間為2 h，考察蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為10，15，20，25，30 mg/mL 條件下MP 磷酸化程度。

1.2.5.3 NaCl 濃度的確定 稱取一定量MP，pH由1.2.5.1 節(jié)確定，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度由1.2.5.2 節(jié)確定，設(shè)置STP 含量為2%，反應(yīng)時間為2 h，考察NaCl 濃度為0，0.25，0.5，0.75，1.0 mol/L 條件下MP 磷酸化程度。

1.2.5.4 反應(yīng)時間的確定 稱取一定量MP，pH由1.2.5.1 節(jié)確定，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度由1.2.5.2 節(jié)確定，NaCl 濃度由1.2.5.3 節(jié)確定，設(shè)置STP 含量為2%，考察反應(yīng)時間為1，1.5，2.0，2.5，3.0 h 條件下MP 磷酸化程度。

1.2.5.5 STP 含量的確定 稱取一定量MP，pH 由1.2.5.1 節(jié)確定，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度由1.2.5.2 節(jié)確定，NaCl 濃度由1.2.5.3 節(jié)確定，反應(yīng)時間由1.2.5.4 節(jié)確定，考察STP 含量為1%，2%，3%，4%和5%條件下MP 磷酸化程度。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Box-behnken 設(shè)計原理，以pH 值（X1）、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（X2）、STP 含量（X3）為變量，展開3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗，因素與水平設(shè)計見表1。采用F 檢驗對試驗結(jié)果進行方差分析以評價模型的統(tǒng)計意義。數(shù)據(jù)分析軟件采用Design-Expert 8.0.6.1。

表1 Box-Behnken 試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Box-Behnken experimental design factors and levels

1.2.7 最佳條件驗證試驗 利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件獲得各個因素的最佳條件組合，結(jié)合實際可操作性進行適當修正，在修正后的條件下進行3 次驗證試驗。

1.2.8 模擬實際加工流程 根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，模擬肉制品實際加工流程。將雞胸肉剔除可見的脂肪結(jié)締組織，用刀斬碎成肉糜，與三聚磷酸鈉試劑混合均勻，置于4 ℃條件下反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束后提取MP，測定磷酸化程度。

1.2.9 多酚協(xié)同磷酸化對MP 凝膠特性的影響選用易溶于水的綠原酸和沒食子酸進行試驗。根據(jù)1.2.5.3 節(jié)確定的NaCl 濃度溶解綠原酸或沒食子酸。磷酸化MP 溶液分別與一定體積的綠原酸或沒食子酸反應(yīng)，使綠原酸或沒食子酸的最終質(zhì)量濃度依次為0，50，100，150，200，250 μg/mL，充分攪拌均勻，在磁力攪拌器作用下低速反應(yīng)4 h。

1.2.10 凝膠性能的測定

1）熱誘導凝膠制備 取20 mL 不同條件處理的蛋白于50 mL 燒杯中，在水浴鍋中，以1 ℃/min的升溫速度從20 ℃升至75 ℃，到達75 ℃后繼續(xù)加熱30 min。加熱結(jié)束后，立即將樣品放入冰水混合物中冷卻30 min，然后放入4 ℃冰箱過夜。測定凝膠性能之前，將凝膠樣品從冰箱中取出放在室溫下平衡2 h。

2） 凝膠硬度和彈性測定 將待測凝膠樣品置于測試平臺上固定，室溫條件下利用TA-XT Plus 型質(zhì)構(gòu)儀進行測定。測定模式設(shè)置為測前速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，下壓距離為5 mm，引發(fā)力5 g，探頭型號P/0.5。每個樣品做3 組平行。

3） 凝膠白度測定 待測凝膠樣品的色差值采用全自動便攜式色差計測定，記錄L*、a*和b*值，每個樣品測定3 次，取其平均值。凝膠白度值根據(jù)式（1）計算[14]。

4） 凝膠保水性測定 參照Foegeding 等[15]的方法，取凝膠在10 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min 根據(jù)式（2）計算凝膠的保水性。

式中，m0——離心管質(zhì)量，g；m1——離心管與凝膠在離心前的質(zhì)量和，g；m2——離心管與離心去掉水以后的凝膠的質(zhì)量和，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Design Expert 8.0 軟件設(shè)計響應(yīng)面分析，采用軟件Excel 2010 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖，并通過SPSS 16.0 對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。

圖1 pH 值對MP 磷酸化程度的影響Fig.1 Effect of pH on phosphorylation of MP

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線方程的建立

根據(jù)雙縮脲法得到的蛋白質(zhì)含量的標準曲線回歸方程為：Y=0.0476X+0.0091，R2=0.9998，式中，Y——吸光度；X——蛋白含量，mg/g；根據(jù)鉬藍比色法得到的磷酸根標準曲線回歸方程為：Y=8.5617X-0.0172，R2=0.9999，式中，Y——吸光度，X——磷酸根標準液質(zhì)量濃度，mg/mL。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 pH 值的確定 由圖1可知，當pH 值為7.5時，雞胸肉MP 磷酸化程度最大，達到了92.1 mg/g，磷酸化修飾效果最佳。反應(yīng)pH 由7.0 升至9.0時，雞胸肉MP 磷酸化程度出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢?？赡艿脑蚴堑鞍自谌鯄A性條件下，氨基的活性較大，更易與磷酸根結(jié)合反應(yīng)[16]。隨著堿性增強，蛋白質(zhì)變性程度加深，使得氨基不利于與磷酸根結(jié)合，導致磷酸化程度降低[17]。

2.2.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的確定 由圖2可知，當?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度為15 mg/mL 時，雞胸肉MP 磷酸化程度最大，達到了93.2 mg/g，磷酸化修飾效果最佳。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度由10 mg/mL 上升至30 mg/mL時磷酸化程度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。這可能是由于隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，參與反應(yīng)的蛋白質(zhì)增多，因此磷酸化修飾效果增強；隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進一步增大，反應(yīng)體系變得更加粘稠，使蛋白質(zhì)與磷酸化試劑反應(yīng)不完全，磷酸化修飾效果下降，磷酸化程度降低。

圖2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對MP 磷酸化程度的影響Fig.2 Effect of protein mass concentration on phosphorylation of MP

2.2.3 NaCl 濃度的確定 由圖3可知，當NaCl濃度為0.75 mol/L 時，MP 的磷酸化程度為97.6 mg/g，此時磷酸化修飾效果最好。當NaCl 濃度由0增加至1 mol/L 時，磷酸化程度先上升至97.6 mg/g，再下降至57.8 mg/g?？赡艿脑蚴荕P 屬于鹽溶性蛋白，當NaCl 濃度逐漸增加時，MP 溶解度增加[18]，分子膨脹，使磷酸化反應(yīng)更充分；當NaCl 濃度過高時，蛋白質(zhì)可能會發(fā)生鹽析效應(yīng)[19]，導致磷酸化程度下降。

2.2.4 反應(yīng)時間的確定 由圖4可知，隨著反應(yīng)時間的延長，磷酸化程度呈上升趨勢。反應(yīng)時間在1 h 到2 h 之間時，反應(yīng)更充分，磷酸化程度上升迅速；繼續(xù)延長反應(yīng)時間，蛋白磷酸化已基本完全，磷酸化程度趨于平緩?？紤]到實際生產(chǎn)加工的效率問題，選取反應(yīng)2 h 為最優(yōu)條件。

2.2.5 STP 用量的確定 由圖5可知，STP 用量為3%時，MP 磷酸化程度最高。STP 含量為1%～3%時，磷酸化程度隨著STP 含量的增加而升高；STP含量大于3%時，磷酸化程度隨之下降。這可能是由于STP 用量不斷升高達到磷酸根飽和，使得能與磷酸根結(jié)合的特定氨基酸基團減少；另一方面，繼續(xù)增加STP 用量，磷酸根基團數(shù)量增加，蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力加大，阻礙反應(yīng)繼續(xù)進行，從而導致磷酸化程度降低[9，12]。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，NaCl 濃度和反應(yīng)時間對MP 磷酸化程度的影響沒有其它3 個因素顯著。以反應(yīng)pH、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、STP 含量為變量，進行3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗。

雞胸肉MP 磷酸化工藝條件優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計了17 組試驗，5 組為中心點重復試驗，如表2所示。本試驗以磷酸化程度作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對磷酸化程度Y 進行多元回歸擬合。得二次多項式擬合方程為：Y=97.736+1.715X1+2.9925X2+9.3725X3-3.145X1X2-0.97X1X3+0.07X2X3-16.2455X12-20.2005X22-11.7205X32。

回歸模型的顯著性檢驗和方差分析見表3。由表3可知，該模型的F 值為70.27，P ＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項的F 值為2.37，P =0.2113 ＞0.05，故失擬項不顯著，模型選擇合適。回歸模型決定系數(shù)R2= 0.9891，矯正決定系數(shù)R2Adj=0.9750，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以通過該回歸方程確定雞胸肉MP 磷酸化的最佳工藝條件。

圖3 NaCl 濃度對MP 磷酸化程度的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on phosphorylation of MP

圖4 反應(yīng)時間對MP 磷酸化程度的影響Fig.4 Effect of reaction time on phosphorylation of MP

圖5 STP 含量對MP 磷酸化程度的影響Fig.5 Effect of STP content on phosphorylation of MP

方差分析表明，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對磷酸化程度的影響顯著，STP 含量對磷酸化程度的影響極顯著。從各變量顯著性檢驗P 值的大小，可以看出影響雞胸肉MP 磷酸化的各因素按顯著性排序依次為：STP 含量＞蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度＞pH。pH 值平方項、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度平方項、STP 含量平方項對磷酸化程度的影響極顯著。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)回歸方程，做出三維響應(yīng)面圖及等高線圖，三維響應(yīng)面圖可以顯示響應(yīng)面的變化趨勢和最大值點。如果一個響應(yīng)曲面坡度相對平緩，就表明因素對響應(yīng)值的影響較??；相反，如果一個響應(yīng)曲面坡度非常的陡峭，就表明響應(yīng)值對于因素改變非常敏感。等高線圖表示在同一橢圓形區(qū)域內(nèi)，磷酸根含量是相同的；在橢圓形區(qū)域中心，磷酸根含量最高，由中心向邊緣逐漸減少；圖中橢圓排列越密集，說明因素變化對磷酸根含量影響越大；同時等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著；而圓形則與之相反，表示此時兩因素交互作用可忽略[20]。

圖6～8 可以看出，對比其它兩個因素間的交互作用，pH 與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的交互作用更顯著，具體表現(xiàn)為等高線圖形較扁平。由圖6可以看出，pH 與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對磷酸化程度均有影響，二者均呈二次曲線形式。隨著pH 值或蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，磷酸化程度先增大后減小，說明pH 值和蛋白濃度之間有顯著的協(xié)同作用，二者的協(xié)同作用可能會影響磷酸化程度。

圖6 pH 和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Responsive surfaces and contour of the combined effects of pH and protein mass concentration

圖7 pH 和STP 含量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Responsive surfaces and contour of the combined effects of pH and content of STP

圖8 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和STP 含量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Responsive surfaces and contour of the combined effects of protein mass concentration and content of STP

2.4 驗證試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 試驗所得出的結(jié)果以及二次多項式回歸方程，再利用Design-Expert 8.0 軟件獲得了磷酸化條件的最佳因素組合為：pH 7.52，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度15.36 mg/mL，STP 含量3.40%，NaCl 濃度0.75 mol/L，反應(yīng)時間2 h。此時預測的磷酸化程度為99.74 mg/g。為檢驗模型預測的準確性，選取pH 7.52，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度15.36 mg/mL，STP 含量3.40%，NaCl 濃度0.75 mol/L，反應(yīng)時間2 h 為反應(yīng)條件，進行3 組平行試驗進行驗證，得到的磷酸化程度為99.001 mg/g，本次結(jié)果與最佳理論條件下所得結(jié)果誤差均在1%以內(nèi)。由此可見，采用響應(yīng)面法優(yōu)化雞胸肉MP磷酸化工藝是行之有效的。

2.5 肉品實際加工流程驗證

在實際生產(chǎn)工藝中，磷酸鹽作為添加劑直接添加到肉糜中。因此驗證最優(yōu)磷酸化條件是否也適用于肉品實際加工流程顯得尤為重要。根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，模擬設(shè)計肉品實際加工過程。設(shè)置STP 含量為3.40%，NaCl 濃度為0.75 mol/L，pH 7.52，STP 溶液體積在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為15.36 mg/mL 的基礎(chǔ)上，根據(jù)雞胸肉質(zhì)量確定反應(yīng)時間為12 h。由圖9可以看出，肉品實際生產(chǎn)過程中的磷酸化程度與試驗流程相比略小，這可能是由于肉中還含有一定量的脂肪或其它物質(zhì)，反應(yīng)所需時間延長，反應(yīng)不夠徹底，導致三聚磷酸鈉與肉中MP 的反應(yīng)效率降低。由圖9可知，兩組數(shù)據(jù)差異不顯著，這為今后磷酸化改性在肉品實際加工中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，證明了磷酸化修飾的可行性。

圖9 實際生產(chǎn)流程與試驗流程磷酸化程度比較圖Fig.9 Comparison of phosphorylation levels between actual production processes and experimental processes

2.6 磷酸化修飾對MP 凝膠特性的影響

采用水浴加熱制備熱誘導蛋白凝膠。在凝膠化過程中，蛋白質(zhì)分子相互作用形成一個三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由表4可以看出，經(jīng)過STP 磷酸化改性后，雞胸肉MP 的凝膠硬度、回復性、凝膠白度和凝膠保水性均有所提高。經(jīng)過磷酸化改性，蛋白凝膠硬度減小了31.94%，彈性提高了6.9%，凝膠白度提高了5.14%，凝膠保水性提高了15.63%。這是因為磷酸化后引入大量磷酸根，改變了蛋白電荷的密度，提高了體系的離子強度，并使其偏離等電點，使電荷之間相互排斥，在蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生更大的空間，減緩了蛋白變性階段的凝聚，使凝膠硬度下降[21]。多聚磷酸鹽可以最大限度提高蛋白質(zhì)的持水性是因為其能使MP 分子變性膨脹，溶脹形成3 個尺寸的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，從而使得蛋白凝膠具有高保水性[22-23]。

圖10 磷酸化及未磷酸化MP 凝膠特性Fig.10 Gel properties of phosphorylated and unphosphorylated MP

2.7 多酚協(xié)同磷酸化對MP 凝膠特性的影響

在肉制品生產(chǎn)加工過程中，MP 氧化是影響肉制品品質(zhì)的重要因素。添加天然抗氧化劑是控制肉制品氧化的有效手段。據(jù)研究報道，磷酸鹽除了可以提高蛋白的水合能力，還具有顯著的金屬離子螯合能力，使得被螯合的金屬離子無法參與氧化反應(yīng)，因此可以提高肉制品的氧化穩(wěn)定性[24-25]。然而磷酸鹽只能螯合金屬離子，并不具備清除自由基的能力，單獨使用抗氧化效果有限。多酚作為目前常用的天然抗氧化劑之一，被廣泛應(yīng)用于肉制品生產(chǎn)加工。因此，本試驗旨在探討兩種天然多酚（綠原酸和沒食子酸）協(xié)同磷酸化對MP 凝膠特性的影響，為實際生產(chǎn)加工提供理論基礎(chǔ)。

2.7.1 質(zhì)構(gòu)特性的影響 由圖11a 可知，隨著多酚濃度的增大，凝膠硬度呈先增大后減小的趨勢。多酚質(zhì)量濃度為50～100 μg/mL 時，硬度變化不顯著；質(zhì)量濃度為150 μg/mL 時，硬度達到最大；質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，硬度則出現(xiàn)明顯下降。分析原因可能是低質(zhì)量濃度的多酚對蛋白結(jié)構(gòu)的影響較小，故凝膠硬度的變化不大[26]；而中質(zhì)量濃度的多酚與磷酸化MP 的結(jié)合有利于蛋白結(jié)構(gòu)適當展開及更多氨基酸殘基的暴露，進而促進蛋白分子間二硫鍵及其它共價鍵的形成，有利于蛋白的相互作用和交聯(lián)，使凝膠硬度緩慢增大；而高濃度綠原酸或沒食子酸可能會破壞磷酸化MP 的結(jié)構(gòu)，引起過多蛋白聚集體的形成，極大地屏蔽了參與反應(yīng)的官能團，破壞了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[27]。

由圖11b 可知，隨著綠原酸或沒食子酸的加入，磷酸化MP 凝膠的彈性變化不顯著，而均在中質(zhì)量濃度左右出現(xiàn)最大值，這與凝膠硬度的結(jié)果類似。中質(zhì)量濃度的綠原酸或沒食子酸與磷酸化MP 的結(jié)合提高了蛋白溶解性，利于相鄰蛋白分子間的活性基團相互作用，使凝膠彈性增大。

圖11 不同多酚質(zhì)量濃度對磷酸化MP 凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Fig.11 The effect of polyphenols at different mass concentration on gel texture of phosphorylated MP

2.7.2 凝膠白度的影響 由圖12可知，隨著綠原酸質(zhì)量濃度的增大，凝膠白度出現(xiàn)先減小后增大的趨勢。曹云剛[27]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度綠原酸對于羥自由基誘導的MP 凝膠白度影響不大，而中高濃度顯著降低凝膠白度。這與本試驗結(jié)果有所差異，可能是因為本文的研究對象是磷酸化后的MP，沒有建立氧化體系而且添加多酚質(zhì)量濃度也有較大差異所致。在本試驗中，添加中質(zhì)量濃度綠原酸時，由于綠原酸本身容易被氧化，造成顏色變化，故導致凝膠白度下降。隨著綠原酸質(zhì)量濃度增大，破壞凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導致組織間自由水分含量增加，引起凝膠表面亮度值L*增大，使得凝膠白度有所升高[28]。這與本試驗凝膠硬度的變化原因一致。觀察圖12可知，添加中高質(zhì)量濃度的沒食子酸使磷酸化MP 凝膠白度顯著降低，且隨著沒食子酸質(zhì)量濃度的增加，白度值呈下降趨勢。這是因為沒食子酸與磷酸化MP 反應(yīng)呈現(xiàn)顏色變化，沒食子酸質(zhì)量濃度越高，二者反應(yīng)下的蛋白溶液墨綠色變化越顯著，熱凝膠的白度值降低越明顯。

2.7.3 凝膠保水性的影響 由圖13可知，隨著綠原酸或沒食子酸質(zhì)量濃度的增大，凝膠保水性均呈逐漸增大的趨勢。其中，多酚的質(zhì)量濃度為50～150 μg/mL 時，保水性變化不顯著，這與本研究中低、中質(zhì)量濃度多酚對凝膠硬度的影響一致；當多酚的質(zhì)量濃度為200～250 μg/mL 時，凝膠保水性顯著增大。分析原因可能是多酚的酚羥基及羧基進一步提升了蛋白表面的親水性。因此隨著多酚質(zhì)量濃度的增加，保水性隨之增大。張慧蕓等[29]報道向豬肉MP 中添加沒食子酸能提高其凝膠保水性。

圖12 不同多酚質(zhì)量濃度對磷酸化MP 凝膠白度的影響Fig.12 The effect of polyphenols at different mass concentration on gel whiteness of phosphorylated MP

圖13 不同多酚濃質(zhì)量度對磷酸化MP 凝膠保水性的影響Fig.13 The effect of polyphenols at different mass concentration on gel water retention of phosphorylated MP

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化，得到雞胸肉MP 磷酸化的最佳工藝條件為：pH 7.52、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度15.36 mg/mL，NaCl 濃度0.75 mol/L，反應(yīng)時間2 h，STP 含量3.40%。在此條件下得到的磷酸化程度為99.001 mg/g。模擬肉品實際加工流程得到的蛋白磷酸化程度與試驗結(jié)果比較接近，證明了磷酸化修飾的可行性。磷酸化MP 的凝膠彈性、白度和保水性均有不同程度提高，說明磷酸化可以改善蛋白的凝膠特性。多酚協(xié)同磷酸化對蛋白凝膠特性的影響表明，相較于綠原酸，沒食子酸對凝膠特性各方面的影響更顯著。隨多酚質(zhì)量濃度的增加，凝膠硬度先增大后減小；凝膠彈性隨質(zhì)量濃度的變化不明顯；凝膠白度隨綠原酸質(zhì)量濃度的增大呈先降低后增大的趨勢，隨沒食子酸質(zhì)量濃度的增大明顯下降；凝膠保水性隨多酚質(zhì)量濃度的增大逐漸升高。本研究可為今后多酚與磷酸鹽復配在雞胸肉質(zhì)構(gòu)特性改善方面提供理論依據(jù)，為雞胸肉的實際加工生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。