趙賢杰 ， 張?zhí)煊?， 李 舜 ， 李桂珍 ， 謝宏林 ， 李康健 ，張 熙 ， 付 強(qiáng)，3 ， 馬春全,3 , 陳勝鋒

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院 ， 廣東 佛山 528225 ； 2.廣州長(zhǎng)隆野生動(dòng)物世界 ， 廣東 廣州 511430 ； 3.佛山佛科院動(dòng)物醫(yī)院有限公司 ， 廣東 佛山 528225)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，發(fā)病迅速、傳播速度極快。該病多發(fā)于冬春季節(jié)，但近幾年發(fā)生了變化，在天氣炎熱時(shí)也偶有發(fā)生[1]。該病的臨床表現(xiàn)主要以排黃色水樣稀糞、嘔吐、脫水，新生仔豬發(fā)病率及死亡率高為特征。至今，PEDV在中國(guó)、越南、美國(guó)、匈牙利、加拿大、法國(guó)等多個(gè)國(guó)家均有報(bào)道，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。近年來(lái)，我國(guó)許多地區(qū)PEDV毒株均出現(xiàn)變異趨勢(shì)，使PED防制難度增加，導(dǎo)致該病在國(guó)內(nèi)流行，造成仔豬大量死亡，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，威脅了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展[3-4]。

PEDV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，存在分別由S基因、E基因、M基因和N基因編碼的纖突蛋白(Spike protein，S)、小包膜蛋白(Envelope, E)、膜糖蛋白(Membrane,M)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid, N)4種結(jié)構(gòu)蛋白[5]。其中M蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒的中和抗體，在病毒粒子組裝和出芽過(guò)程中具有重要的作用[6]。M基因PEDV毒株間高度保守，可以體現(xiàn)田間毒株的多樣性及其與臨床毒株之間的遺傳關(guān)系，對(duì)PEDVM基因的檢測(cè)和分析有助于了解目前我國(guó)PEDV流行毒株的流行類型，同時(shí)可以作為PEDV分子分群的重要依據(jù)[7-8]。近幾年廣東PED多發(fā)，疫苗保護(hù)率越發(fā)低下。因此，本試驗(yàn)于2016年5月-2018年12月在廣東省部分地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的規(guī)模豬場(chǎng)采集了45份因嚴(yán)重腹瀉而死亡的仔豬小腸樣品，檢測(cè)并鑒定了22份PEDV陽(yáng)性病料，對(duì)其M基因進(jìn)行克隆測(cè)序以及遺傳進(jìn)化分析，探究廣東省PEDV的流行變異情況，以期為當(dāng)?shù)胤揽卦摬≈贫ǚ乐拼胧┨峁﹨⒖肌?/p>

1 材料與方法

1.1 病料樣品 45份疑似感染PEDV的仔豬小腸樣品采集自廣東省云浮、清遠(yuǎn)等發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的規(guī)模化豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑,購(gòu)自Invitrogen公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL-2 000 DNA Marker、ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒,購(gòu)自Axygen公司；氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇等試劑均為分析純，購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參考黃冬妮論文中PEDVM基因引物進(jìn)行合成[9]，即M-F：5′- TCACTTGTCACCGGTTGTGT-3′，M-R：5′-GAGATAATGGCACCCGTTTG-3′,預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為867 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 病毒總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增 將采集的小腸樣品反復(fù)研磨勻漿，按TRIzol試劑使用說(shuō)明書(shū)提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系50 μL，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s、55 ℃ 35 s、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 目的基因的克隆與序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆至pMD19-T載體中，重組陽(yáng)性質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序的PEDVM基因應(yīng)用DNASTAR 5.0軟件與 GenBank登錄的參考病毒株比對(duì)分析，并應(yīng)用MEGA7軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1M基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)采集的45份仔豬小腸樣品采用RT-PCR擴(kuò)增PEDVM基因，結(jié)果顯示，22份樣品擴(kuò)增出867 bp的片段，與預(yù)期的M基因相符(圖1)。

圖1 PEDV M基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2M基因序列分析結(jié)果 按樣品采集地將22株廣東流行PEDV毒株M基因序列分別命名為：CH/GDQY/2015(廣東清遠(yuǎn))、CH/GDLD/2015(廣東龍洞)、CH/GDLC/2015(廣東龍川)、CH/GDLF/2015(廣東陸豐)、CH/GDQX/2015(廣東清新)、CH/GDZJ/2016(廣東紫金)、CH/GDGY/2016(廣東高要)、CH/GDHD/2016(廣東惠東)、CH/GDHS/2016(廣東鶴山)、CH/GDYF/2016(廣東云浮)、CH/GDYJ/2016(廣東陽(yáng)江)、CH/GDXN/2016(廣東興寧)、CH/GDST/2017(廣東汕頭)、CH/GDHY/2017(廣東惠陽(yáng))、CH/GDHD/2017(廣東惠東)、CH/GDSH/2017(廣東四會(huì))、CH/GDYD/2018(廣東英德)、CH/GDLC/2018(廣東龍川)、CH/GDQX/2018(廣東清新)、CH/GDZJ/2017(廣東紫金)、CH/GDGM/2018(廣東高明)、CH/GDZQ/2018(廣東肇慶)。

將獲得的22株廣東地區(qū)PEDV流行株M基因的測(cè)序結(jié)果與GenBank 中PEDV參考株M基因進(jìn)行同源性分析(用于M基因序列比對(duì)的PEDV參考株見(jiàn)圖2)。結(jié)果顯示，22株廣東流行株間M基因核苷酸序列同源性為97.5%～100.0%，其中CH/GDZQ/2018與CH/GDZJ/2017、CH/GDGY/2016、CH/GDHS/2016的同源性最低為97.5%；CH/GDQX/2018 與CH/GDZJ/2017的同源性最高為100%。22株廣東流行株與華南地區(qū)參考株M基因核苷酸序列同源性為97.7%～99.9%，其中流行株CH/GDZQ/2018與參考株GDJM-1205的同源性最低為97.7%；CH/GDLC/2015、CH/GDSH/2017、CH/GDHD/2017分別與參考株CHN/SH、GDXS5的同源性最高為99.9%。此外，22株流行株與國(guó)內(nèi)參考株LJB/03的同源性為96.9%～97.5%，與國(guó)內(nèi)較早分離株CH/S和經(jīng)典毒株的CV777的同源性分別為97.5%～98.1%、97.7%～98.2%；除了分離株CH/GDSH外，22株流行株與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)參考株的同源性為96.9%～99.7%。結(jié)果表明，22株廣東PEDV流行株的同源性較高，親緣關(guān)系緊密，而與經(jīng)典毒株和國(guó)內(nèi)較早分離株同源性較低。推測(cè)近年來(lái)廣東PEDV流行株可能形成獨(dú)特進(jìn)化分支。

圖2 基于M基因的廣東省PEDV系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將獲得的22株廣東PEDV流行株M基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中的PEDV參考株M基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示(圖2)，22株廣東PEDV流行株與部分國(guó)外毒株以及華南地區(qū)分離株均屬于II、III群，但是親緣關(guān)系較近，處于同一分支；與大部分均屬于I群的代表性毒株、疫苗株非一系，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，如國(guó)內(nèi)早期分離株CH/S、經(jīng)典毒株CV777、韓國(guó)株KRPEDV-9-Vaccine、泰國(guó)株M_NIAH100541_08、日本株JMe2、英國(guó)株Brl/87等。以上結(jié)果均表明，近年來(lái)廣東PEDV流行株M基因發(fā)生基因變異，在廣東已成為優(yōu)勢(shì)毒株，并發(fā)展形成獨(dú)特進(jìn)化分支。

3 討論

典型的PED具有明顯的季節(jié)性，一般多發(fā)于冬春季節(jié)，但是近年來(lái)在天氣炎熱的時(shí)候偶有發(fā)生。我國(guó)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)通過(guò)免疫接種PEDV、TGEV和PRo V二聯(lián)疫苗或三聯(lián)疫苗來(lái)預(yù)防豬的腹瀉,取得了一定的效果。但自2006年開(kāi)始,腹瀉滅活苗和弱毒苗廣泛使用的豬場(chǎng)也暴發(fā)了嚴(yán)重的腹瀉,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失較大[9-10]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)2016-2018年廣東省內(nèi)各地分離得到的22株P(guān)EDV流行株M基因序列的遺傳進(jìn)化分析，了解到廣東PEDV流行株存在基因變異的現(xiàn)象，形成了獨(dú)特的流行進(jìn)化分支，為廣東省對(duì)PED的防制以及疫苗的研制提供理論依據(jù)。