梅 晨 ， 孫愛(ài)華 ， 李淑芳 ， 龔玉梅 ， 王宏俊

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 海淀 100097)

副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum, Apg)是雞傳染性鼻炎(IC)的病原[1]，為革蘭陰性菌，主要引起育成雞生長(zhǎng)停滯及蛋雞產(chǎn)蛋率下降[2]，給養(yǎng)雞業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前控制雞傳染性鼻炎的方法主要是采用全菌滅活疫苗[4-6]配合抗生素治療或預(yù)防的綜合措施。

外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)是細(xì)菌特有的一種生理結(jié)構(gòu)，革蘭陰性菌及少量革蘭陽(yáng)性菌都可以產(chǎn)生OMVs[7]。OMVs是一種雙層膜球狀囊泡狀結(jié)構(gòu)，其大小在20～250 nm[8]。OMVs在細(xì)菌的生長(zhǎng)、生存、毒力等生理活動(dòng)中扮演重要角色，由于OMVs不能復(fù)制且含有脂多糖、外膜蛋白、磷脂及少量DNA等成分，能有效激活免疫系統(tǒng)，被認(rèn)為是極具潛力的新型疫苗之一[8]，但其作用機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)擬探討副雞禽桿菌外膜囊泡的相關(guān)生物活性，為雞傳染性鼻炎新型疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 副雞禽桿菌A型hp8株, B型BJ株和C型668株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 囊泡的提取及純化 常規(guī)兼性厭氧條件下培養(yǎng)hp8株副雞禽桿菌，挑取單菌落于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃溫箱震蕩厭氧培養(yǎng)12 h，按1∶50轉(zhuǎn)接，37 ℃溫箱震蕩厭氧培養(yǎng)4～6 h，4 ℃，8 000 r/min離心10 min。取上清，0.45 μmol/L濾膜過(guò)濾，4 ℃，35 000 r/min超速離心3 h，棄上清。用2 mL 20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH值7.5)重懸沉淀，存放于-20 ℃。即為粗提的外膜囊泡。

用HEPES溶液將Optiprep配置成不同梯度濃度(60%、40%、35%、30%、25%、20%)，取上述粗提外膜囊泡與60%的Optiprep溶液按1∶3體積比稀釋至45%，吸取2 mL置于離心管底部，再依次加入上述40%及更低濃度的Optiprep溶液各 2 mL。4 ℃,35 000 r/min離心3 h。離心后吸取肉眼可見(jiàn)的黃色層，即為目標(biāo)囊泡所在溶液。重懸富含囊泡溶液樣品于10倍體積DPBSS，4 ℃,35 000 r/min離心3 h，去除溶液中Optiprep，以2 mL的DPBSS懸浮囊泡，即為純化的外膜囊泡。BCA法計(jì)算OMVs的濃度，透射電鏡觀察其形態(tài)及結(jié)構(gòu)。

1.3 OMVs對(duì)HD-11細(xì)胞NO生成量的影響 一氧化氮(Nitricox-ide，NO)是一種生物信使分子，其生成依賴于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)，在抵抗入侵的細(xì)菌、真菌等微生物及在炎癥反應(yīng)中起著十分重要的作用[10-11]。試驗(yàn)分為OMVs處理組(5 μg/mL)和對(duì)照組，兩組細(xì)胞分別在處理后24 h、48 h時(shí)取培養(yǎng)上清液，根據(jù)NO試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟及計(jì)算公式[12]，測(cè)定并計(jì)算各組OD550值，利用SPSS比較各組NO產(chǎn)生水平。

1.4 熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)OMVs對(duì)HD-11細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響 在25 cm2培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)雞巨噬細(xì)胞(HD-11)，使細(xì)胞生長(zhǎng)至85%。6瓶細(xì)胞分為囊泡組、脂多糖(LPS)組和對(duì)照組，每組2瓶。囊泡組加入5 μg OMVs，脂多糖組加入1 μg/mL LPS, 對(duì)照組不做任何處理，之后共培養(yǎng)24 h和48 h。分別用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA[9]，溶于20 μL DEPC水。反轉(zhuǎn)錄按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體反應(yīng)體系如下:RNA 1 μg，隨機(jī)引物1 μL，5×M-MLV TR Buffer 4 μL，核糖核酸酶抑制因子1 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)8 μL。混勻后按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，反應(yīng)結(jié)束后立即置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank上雞炎癥因子相對(duì)保守區(qū)域序列，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)基因的特異性上下游引物(見(jiàn)表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系如下：1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，12.5 μL Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix，0.375 μL ROX，9.125 μL DEPC水。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min; 95 ℃變性 30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次;72 ℃再延伸8 min。 溶解曲線反應(yīng)條件如下：95 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。所有試驗(yàn)組樣本重復(fù)3次獨(dú)立試驗(yàn)，利用SPSS比較各組炎癥因子水平。

表1 相關(guān)炎癥因子引物序列

1.5 OMVs疫苗的制備與免疫 純化的OMVs與MONTANIDETMISA 71 VG佐劑(SEPPIC公司產(chǎn)品)按3∶7的質(zhì)量比(抗原∶佐劑)混合乳化，所制備的疫苗命名為V-OMVs-A，其中OMVs蛋白濃度為100 μg/mL。將42日齡SPF試驗(yàn)雞分為OMVs免疫組(30只)和PBS對(duì)照組(30只)。OMVs組試驗(yàn)雞胸部肌肉注射V-OMVs-A疫苗，0.5 mL/只，間隔2周后二免；對(duì)照組接種PBS替代OMVs后制成的疫苗，0.5 mL/只，間隔2周后再同劑量接種1次。

1.6 血清IgG的測(cè)定 首次免疫后每周進(jìn)行雞靜脈竇采血并分離血清，根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]，采用間接ELISA測(cè)定抗OMVs的血清IgG抗體水平；將全菌抗原用包被液稀釋至1 μg/μL，包被于96孔酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜，以1∶100稀釋的血清作為一抗，1∶10 000稀釋的山羊抗雞IgG-HRP (Sigma公司)作為二抗，通過(guò)TMB底物顯色測(cè)定OD450值。

1.7 免疫保護(hù)試驗(yàn) 二免4周后，試驗(yàn)雞分別用3個(gè)血清型的副雞禽桿菌眶下竇接種攻擊。A型(hp8株)、B型(BJ株)和C型(668株)，劑量依次為A型5×105CFU/0.2 mL，B型2×105CFU/0.2 mL，C型5×105CFU/0.2 mL。連續(xù)觀察1周，記錄試驗(yàn)雞的臨床發(fā)病情況，包括流鼻涕、眼瞼腫、溢淚等。

2 結(jié)果

2.1 外膜囊泡電子顯微結(jié)構(gòu) 以乙酸雙氧鈾負(fù)染后，用透射電鏡觀察外膜囊泡形態(tài)。經(jīng)BCA方法測(cè)得提取的外膜囊泡的蛋白質(zhì)濃度為1.03 mg/mL，結(jié)果如圖1和圖2所示：可見(jiàn)多數(shù)形態(tài)呈現(xiàn)圓球狀，有膜狀結(jié)構(gòu)，OMVs直徑介于20～300 nm。

圖1 副雞禽桿菌(Apg)及其外膜囊泡(OMN)

圖2 純化的副雞禽桿菌外膜囊泡

2.2 OMVs對(duì)HD-11細(xì)胞NO生成量的影響 結(jié)果如圖3可知，24 h時(shí)OMVs組生成的NO量急速增加，為10.5 μmol/L；而對(duì)照組生成的NO量為2.5 μmol/L，差異極顯著(P<0.01)。48 h時(shí)，OMVs組生成的NO量為11 μmol/L，對(duì)照組NO量為4 μmol/L，差異極顯著(P<0.01)。表明OMVs可以刺激HD-11細(xì)胞產(chǎn)生NO，且隨時(shí)間推移生成量有所增高。

圖3 OMVs作用不同時(shí)間對(duì)HD-11細(xì)胞NO生成影響

2.3 q-PCR檢測(cè)多因子的表達(dá) 結(jié)果如圖4所示，24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，IL-1β、IL-10、iNOS囊泡組及脂多糖組差異極顯著(P<0.01),IL-6囊泡組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，脂多糖組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，IL-2囊泡組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。48 h時(shí)，以上5種細(xì)胞因子囊泡組及脂多糖組與對(duì)照組相比，均差異極顯著(P<0.01)。

圖4 OMVs影響HD-11細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)

2.4 血清IgG抗體水平的測(cè)定 二免后第4周分別測(cè)定各組雞血清IgG水平，結(jié)果如圖5所示，OMVs免疫組的IgG抗體水平極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，推斷OMVs免疫雞后可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫。

圖5 OMVs對(duì)雞血清IgG抗體水平的檢測(cè)結(jié)果

2.5 OMVs免疫保護(hù)試驗(yàn) 二免后第4周，試驗(yàn)雞用副雞禽桿菌A、B、C三個(gè)血清型強(qiáng)毒攻擊，結(jié)果顯示，對(duì)照組所有的試驗(yàn)雞陸續(xù)發(fā)病，都表現(xiàn)出嚴(yán)重的鼻炎癥狀，發(fā)病率為100%。OMVs組A型攻毒后僅有3只試驗(yàn)雞表現(xiàn)出鼻炎癥狀，保護(hù)率為7/10，B型及C型攻毒保護(hù)率分別為1/10和3/10，提示囊泡免疫原性具有型特異性(表2)。

表2 免疫雞對(duì)Apg菌株攻毒的保護(hù)效果

3 討論

外膜囊泡(OMVs)是革蘭陰性菌普遍存在的一種生理結(jié)構(gòu)，部分革蘭陽(yáng)性菌也會(huì)產(chǎn)生。對(duì)副雞禽桿菌的OMVs各個(gè)方面的研究還不夠深入，目前仍處于探索的過(guò)程中。本文通過(guò)提取、純化副雞禽桿菌A型菌(hp8)外膜囊泡OMVs，探索其對(duì)雞巨噬細(xì)胞HD-11相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響。NO作為一類小分子細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要的指示作用。結(jié)果顯示，OMVs與HD-11細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞產(chǎn)生NO的水平極顯著升高，提示OMVs可增強(qiáng)HD-11細(xì)胞免疫活性。生成的NO可以進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放IL-6和TNF-α等炎性因子，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。IL-lβ、IL-6等主要由巨噬細(xì)胞釋放，通過(guò)qPCR檢測(cè)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，結(jié)果顯示，OMVs可促進(jìn)HD-11細(xì)胞IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、iNOSmRNA表達(dá)升高，提示巨噬細(xì)胞被極顯著激活，能夠明顯促進(jìn)炎癥反應(yīng)[14]。另外，囊泡組血清IgG與對(duì)照組相比差異顯著，說(shuō)明OMVs可以調(diào)節(jié)雞體液免疫。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，OMVs免疫后能夠提高雞對(duì)副雞禽桿菌攻擊的耐受力，表明該OMVs含有部分關(guān)鍵保護(hù)性抗原成分。

目前，已有研究探索了多種細(xì)菌OMVs作為亞單位疫苗候選抗原的可行性[15]，本研究也進(jìn)行了初步嘗試。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，A型副雞禽桿菌的OMVs接種后的雞只可以產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)作用，耐受同型菌株的攻擊。但對(duì)B型和C型交叉保護(hù)效果較差，這可能與不同亞型的副雞禽桿菌分泌囊泡中攜帶外膜蛋白成分不同有關(guān)，外膜囊泡中免疫保護(hù)性抗原成分具有型特異性。在后續(xù)試驗(yàn)中，筆者將通過(guò)比較不同亞型副雞禽桿菌囊泡外膜成分，篩選免疫保護(hù)的有效成分，并在后續(xù)試驗(yàn)中采取不同免疫方式及免疫劑量研究囊泡的保護(hù)效果，借此研究雞傳染性鼻炎亞單位疫苗。