曠歷瓊，王 娜

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 1.消化科；2.干部保健診療中心，新疆 烏魯木齊 830001

結(jié)腸癌在世界范圍內(nèi)普遍存在，并且是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。早期結(jié)腸癌缺乏明確且典型的癥狀，大多數(shù)患者診斷時(shí)已處于晚期[2]，因此，錯(cuò)過了治療的最佳時(shí)機(jī)，預(yù)后較差。柚皮苷(4,5,7-三羥基黃烷酮-7-鼠李葡糖苷)是一種天然糖苷，屬于生物類黃酮，衍生自葡萄柚和其他柑橘類水果[3]。研究表明，柚皮苷可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長，且隨其濃度增加抑制作用增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。柚皮苷能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，降低侵襲能力[5]。Aplasia Ras homolog member I(ARHI)基因在人結(jié)腸癌中存在表達(dá)下調(diào)或缺失，在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌基因功能[6]。ARHI在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常胃黏膜上皮組織，過表達(dá)ARHI誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，阻滯細(xì)胞周期[7]。ARHI基因在卵巢癌中低表達(dá)，過表達(dá)ARHI基因可以抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長，使SKOV3細(xì)胞阻滯于S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。但柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，且柚皮苷是否通過調(diào)控ARHI基因表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡，目前尚未可知。因此，本研究考察了柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖和凋亡的影響及其相應(yīng)的分子機(jī)制，旨在為柚皮苷治療結(jié)腸癌提供臨床前證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，柚皮苷購自美國Sigma公司，胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，pcDNA-ARHI、pcDNA-ARHI陰性對(duì)照pcDNA、si-ARHI、si-ARHI陰性對(duì)照si-NC購自上海GenePharma公司，Lipofectamine 2000試劑(貨號(hào)11668030)、Annexin-V-碘化丙啶(Propudium iodide，PI)凋亡試劑盒(貨號(hào)88-8005-72)購自美國Invitrogen公司，細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)(貨號(hào)ab226977)、p21(貨號(hào)ab227443)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)(貨號(hào)ab196495)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(貨號(hào)ab53154)、ARHI(貨號(hào)ab107051)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(貨號(hào)ab9485)抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(貨號(hào)ab205718)購自美國Abcam公司，PrimeScript RT Master Mix試劑盒(貨號(hào)RR036A)、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(貨號(hào)RR420A)購自日本TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理將SW620細(xì)胞在含有質(zhì)量濃度為100 g/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃和體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在達(dá)到90%匯合時(shí)傳代。培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，將細(xì)胞分為對(duì)照組、柚皮苷-低組、柚皮苷-中組、柚皮苷-高組。其中，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的SW620細(xì)胞，柚皮苷低、中、高組分別使用5、10、20 μmol/L濃度[5]的柚皮苷作用于SW620細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞備用。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與處理根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine 2000將所有寡核苷酸轉(zhuǎn)染到SW620細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞分為pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-ARHI組(轉(zhuǎn)染pcDNA-ARHI)、對(duì)照組(正常培養(yǎng)的SW620細(xì)胞)、柚皮苷組(20 μmol/L柚皮苷處理SW620細(xì)胞)、柚皮苷+si-NC組(20 μmol/L柚皮苷和轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞)、柚皮苷+si-ARHI組(20 μmol/L柚皮苷和轉(zhuǎn)染si-ARHI的細(xì)胞)，處理48 h后，收集細(xì)胞備用。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖將SW620細(xì)胞接種到96孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下孵育48 h，將20 μl MTT試劑添加到每孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后加入150 μl二甲基亞砜，搖床震蕩培養(yǎng)10 min，置于酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率(%)。

1.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)檢測CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、ARHI蛋白表達(dá)SW620細(xì)胞中加入放射免疫沉淀緩沖液，提取細(xì)胞的蛋白，通過BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。等量的蛋白(30 μg)用質(zhì)量濃度為100 g/L的SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜。室溫條件下用質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶封閉，2 h后將膜與抗CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、ARHI(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)抗體4 ℃孵育，過夜。然后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑和Image J軟件分析蛋白條帶。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將SW620細(xì)胞接種到96孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，經(jīng)不同的處理后，將細(xì)胞輕輕重懸于500 μl Annexin V結(jié)合緩沖液中，然后加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕搖動(dòng)，室溫孵育10 min，通過流式細(xì)胞儀分析SW620細(xì)胞凋亡。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測ARHI mRNA表達(dá)分別用TRIzol溶液提取各組SW620細(xì)胞的總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒從1 μg總RNA中合成cDNA。qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒，在ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)系統(tǒng)中進(jìn)行。使用的引物序列如下：ARHI：正向5′-GATTACCGCGTCGTGGTAGTC-3′，反向5′-TCAATGGTCGGCAGGTACTCA-3′；GAPDH：正向5′-TGACGCTGGGGCTGGCATTG-3′，反向5′-GCTCTTGCTGGGGCTGGTGG-3′。采用公式2-ΔΔCt確定ARHI mRNA水平。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖的影響MTT和Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，柚皮苷-低組、柚皮苷-中組、柚皮苷-高組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖抑制率顯著增加，CyclinD1蛋白水平顯著降低，p21蛋白表達(dá)量明顯升高，均呈濃度依賴性(P<0.05)(見表1、圖1)。

表1 柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖的影響

圖1 增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.2 柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，柚皮苷-低組、柚皮苷-中組、柚皮苷-高組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的凋亡率顯著增加，Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高，均呈濃度依賴性(P<0.05)(見圖2、表2)。

圖2 柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡的影響 A：凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B：細(xì)胞凋亡流式圖

表2 柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡的影響

2.3 柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中ARHI基因表達(dá)的影響qRT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，柚皮苷-低組、柚皮苷-中組、柚皮苷-高組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中ARHI mRNA和ARHI蛋白表達(dá)量明顯增加，并呈濃度依賴性(P<0.05)(見圖3、表3)。

表3 柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中ARHI基因表達(dá)的影響

圖3 ARHI蛋白表達(dá)

2.4 ARHI過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響Western blotting、MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與pcDNA組比較，pcDNA-ARHI組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的ARHI蛋白表達(dá)量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達(dá)量明顯增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)(見圖4、表4)。

表4 ARHI過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖4 ARHI和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 抑制ARHI表達(dá)逆轉(zhuǎn)了柚皮苷(20 μmol/L)對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的作用Western blotting、MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，柚皮苷組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的ARHI蛋白表達(dá)量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達(dá)量明顯增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與柚皮苷+si-NC組比較，柚皮苷+si-ARHI組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的ARHI蛋白表達(dá)量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達(dá)量明顯減少，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)(見表5、圖5)。

表5 抑制ARHI表達(dá)逆轉(zhuǎn)了柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的作用

圖5 ARHI和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

近年來，由于危險(xiǎn)因素的變化以及篩查測試和治療方法的改進(jìn)，結(jié)腸癌患者的發(fā)病率和死亡率有所下降，但各個(gè)國家和地區(qū)的5年生存率差異較大[9]。在中國，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年增加[10]。目前，化學(xué)療法是最常見的癌癥治療策略，抗癌藥的副作用仍是惡性腫瘤化學(xué)療法中的主要問題[11]。因此，仍需尋找新的結(jié)腸癌治療藥物，增加患者的治療選擇。本研究評(píng)估了不同濃度柚皮苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，柚皮苷具有一定抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，而調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞中ARHI的表達(dá)可能解釋了其抗腫瘤作用。

柚皮苷是從天然植物中提取的類黃酮物質(zhì)，具有多種有益的藥理學(xué)性質(zhì)，如抗癌、抗氧化、抗炎、抗衰老、保護(hù)心腦血管、保護(hù)藥物性肝損傷[12-14]。根據(jù)一些體外和體內(nèi)研究的報(bào)道，生長抑制和誘導(dǎo)凋亡是柚皮苷在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌和胃癌等腫瘤進(jìn)展中的共同作用[15]。Zhou等[16]考察了柚皮苷在甲狀腺癌中的抗腫瘤功能，結(jié)果表明，柚皮苷以劑量和時(shí)間依賴方式抑制甲狀腺癌TPC-1和SW1736細(xì)胞增殖，而以劑量依賴性誘導(dǎo)TPC-1和SW1736細(xì)胞凋亡。此外，柚皮苷劑量依賴性地提高細(xì)胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)-3和Bax的表達(dá)，并降低了CyclinD1和Bcl-2的表達(dá)。Cai等[17]報(bào)道指出，在0.5～2 mg/kg的范圍內(nèi)，柚皮苷劑量依賴性地抑制卵巢腫瘤的體內(nèi)生長，且促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞的凋亡。另外，柚皮苷顯著降低Bcl-2、CyclinD1、c-Myc和survivin的表達(dá)，其機(jī)制可能與Caspase-7、Caspase-3、Bcl-2等介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。柚皮苷在乳腺癌細(xì)胞MCF7和肺癌細(xì)胞A549中表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性[18]，口服柚皮苷可預(yù)防AOM/DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠潰瘍性結(jié)直腸炎癥和致癌作用，且無明顯的副作用，柚皮苷可以開發(fā)成為一種有希望的潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)直腸腫瘤的治療劑[19]。在當(dāng)前研究中，柚皮苷以濃度依賴方式顯著增加SW620細(xì)胞的增殖抑制率，以及提高細(xì)胞的凋亡率和p21蛋白、Bax蛋白水平，并減少CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)量，與前述研究[16,19]一致，也為柚皮苷作為結(jié)腸癌抑制劑提供了新的證據(jù)。

本研究檢測到，不同濃度的柚皮苷明顯增加SW620細(xì)胞中ARHI mRNA和ARHI蛋白表達(dá)量，均呈濃度依賴性，提示柚皮苷發(fā)揮抗腫瘤活性的機(jī)制可能與調(diào)控結(jié)腸癌中的ARHI基因有關(guān)。ARHI基因?qū)儆赗as超家族，位于人類1p31.3染色體上，包括1個(gè)啟動(dòng)子、2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，帶有1個(gè)687 bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，可編碼26 kD的蛋白質(zhì)[20]。此前，ARHI基因已被證明是結(jié)腸癌[6]、甲狀腺癌[21]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[20]、胰腺癌和肺癌[22]等多種人類癌癥的抑癌基因，具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。與配對(duì)的非癌組織相比，結(jié)腸癌組織中ARHI mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，ARHI在結(jié)腸癌中充當(dāng)腫瘤抑制因子[23]。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，ARHI過表達(dá)顯著增加結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達(dá)量，顯著降低CyclinD1和Bcl-2蛋白水平，起著抑癌基因的作用。另外，抑制ARHI表達(dá)逆轉(zhuǎn)了柚皮苷促進(jìn)SW620細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表達(dá)的作用，和逆轉(zhuǎn)了其抑制CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)的作用，這些結(jié)果證明，柚皮苷可能通過上調(diào)ARHI表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，5、10、20 μmol/L濃度的柚皮苷可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴性，其作用機(jī)制與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞中的ARHI表達(dá)有關(guān)，這為結(jié)腸癌的臨床治療提供了有前景的藥物。