國(guó)強(qiáng)，賈志勇，岳彥波

內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，內(nèi)蒙古 包頭014010

胃癌是較常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率位居全部惡性腫瘤前列，發(fā)病年齡一般為50歲，但是，近年來(lái)，胃癌的發(fā)病人群正趨于年輕化[1]。胃癌的發(fā)病原因較多，發(fā)病隱匿，早期癥狀往往被患者誤認(rèn)為是消化道潰瘍，且常見(jiàn)的計(jì)算機(jī)體層攝影（computerized tomography，CT）、血常規(guī)等檢查方法較難發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)，患者往往處于晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，給治療帶來(lái)極大困難。研究證明，胃癌細(xì)胞中的p53基因能夠通過(guò)自我更新從而抑制腫瘤的復(fù)發(fā)，并調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的分裂、腫瘤的生成，抑制相關(guān)基因在胃癌中的表達(dá)[2]。奧沙利鉑為胃癌術(shù)后常見(jiàn)化療藥物，相關(guān)研究表明，其能夠通過(guò)下調(diào)胃癌組織中p53的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡[3‐5]。本研究通過(guò)提取胃癌患者胃癌組織和胃癌細(xì)胞株，并使用奧沙利鉑藥物作用于胃癌細(xì)胞株后，對(duì)p53蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在為胃癌的臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃腺癌細(xì)胞株BGC‐823購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，奧沙利鉑購(gòu)自Sigma公司，1640培養(yǎng)基、Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，細(xì)胞凋亡‐Hoechst染色試劑盒、兔抗人p53蛋白和多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

參照CCK8試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行檢測(cè)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化處理，接種于96孔板培養(yǎng)，24 h貼壁生長(zhǎng)后加入含有藥物的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，依據(jù)奧沙利鉑不同濃度（0、3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）進(jìn)行分組。每孔加入CCK8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，分別于奧沙利鉑處理24、48、72 h時(shí)，采用Thermo FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值，采用CCK8法對(duì)奧沙利鉑處理24、48、72 h時(shí)的胃癌細(xì)胞的增殖抑制率進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 p53蛋白檢測(cè)方法及結(jié)果判定

將奧沙利鉑置于37℃水浴箱中孵育15 min，去除多余奧沙利鉑溶液后蘇木素復(fù)染1 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzine，DAB）顯色5～15 min；于顯微鏡下觀察檢測(cè)結(jié)果，分別于奧沙利鉑處理24、48、72 h時(shí)，記錄不同濃度（3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）下胃癌細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)情況。p53的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，觀察并計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞增殖抑制率的比較

奧沙利鉑處理24、48、72 h時(shí)，隨著奧沙利鉑作用濃度（3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）的增高，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸增高，且同一濃度（3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）下的奧沙利鉑處理時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸增高。（表 1）

2.2 p53蛋白表達(dá)情況的比較

奧沙利鉑處理24、48、72 h時(shí)，隨著奧沙利鉑作用濃度（3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml）的增高，胃癌細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平逐漸增高，且同一濃度下的奧沙利鉑處理時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，胃癌細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表1 不同濃度奧沙利鉑處理后胃癌細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，x± s）

表2 不同濃度奧沙利鉑處理后胃癌細(xì)胞中 p53蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

表2 不同濃度奧沙利鉑處理后胃癌細(xì)胞中 p53蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

注：a與0 μg/ml比較，P＜0.05；b與3.2 μg/ml比較，P＜0.05；c與6.4 μg/ml比較，P＜0.05；d與12.8 μg/ml比較，P＜0.05

濃度（μg/ml）0 3.2 6.4 12.8 25.6 F值P值24 h 10.98±1.04 8.88±1.44a 12.43±1.08a b 25.14±2.84a b c 32.45±2.43a b c d 299.464＜0.01 48 h 17.13±2.54 16.27±2.56a 22.12±2.67a b 34.26±3.45a b c 41.18±3.62a b c d 421.398＜0.01 72 h 28.33±3.56 29.67±1.76a 36.36±1.25a b 49.37±3.15a b c 52.98±3.45a b c d 487.173＜0.01

3 討論

胃癌一般在偶然檢查中發(fā)現(xiàn)，給患者及家屬帶來(lái)巨大的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。胃癌的發(fā)病原因復(fù)雜，涉及抑癌基因和致癌基因的表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)改變等[6]。許多研究者致力于研究胃癌的發(fā)病原因及機(jī)制，結(jié)果仍不理想，因此，盡快準(zhǔn)確地診斷和治療胃癌具有重要意義[7]。p53是一種重要的抑癌基因，能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的激活，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。奧沙利鉑是一種新型鉑類化合物，對(duì)胃癌具有較好的療效。有研究證明，奧沙利鉑可通過(guò)改變p53的表達(dá)進(jìn)而提高臨床療效[9‐10]。奧沙利鉑在人類多種腫瘤中均表現(xiàn)出廣譜的體外細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑處理24、48、72 h時(shí)，隨著奧沙利鉑作用濃度的增高，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸增高，且同一濃度奧沙利鉑處理時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸增高，胃癌細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平逐漸增高。這說(shuō)明奧沙利鉑可以通過(guò)誘導(dǎo)p53表達(dá)，對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮效應(yīng)，表明p53具有增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性、減少不良反應(yīng)、減少化療藥物劑量的作用。既往研究表明，p53基因在DNA受到損傷的情況下能夠迅速激活[12]，與腫瘤患者的放化療敏感性、轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況密切相關(guān)。

綜上所述，奧沙利鉑化療能夠上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，提高胃癌細(xì)胞的增殖抑制率，且p53蛋白的表達(dá)水平和胃癌細(xì)胞的增殖抑制率與奧沙利鉑的作用濃度關(guān)系密切，值得臨床關(guān)注。