周喜旺，劉鴻燕，王 娜，魏志平，王曉明，張耀輝，岳維云，汪石俊，曹世勤，宋建榮

(1.天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅天水 741001； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅蘭州 730070)

小麥條銹病是由專性寄生菌條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的全世界范圍內(nèi)小麥上的最主要病害，小麥條銹菌新小種的出現(xiàn)是導(dǎo)致小麥品種抗銹性喪失的主要原因[1]。目前，新毒性小種CYR34已成為甘肅省的第一流行小種[2-3]，使甘肅隴南小麥生產(chǎn)上利用的含有Yr10和Yr26基因的抗源或品種抗病性逐漸喪失[4-5]，而新的抗源材料又嚴(yán)重缺乏，因此，發(fā)掘新抗源并加以有效利用，對控制該區(qū)小麥條銹病發(fā)生流行及小麥安全生產(chǎn)具有重要意義。

迄今為止，國際上已在82個(gè)位點(diǎn)正式命名了85個(gè)抗條銹病基因[6](Yr1～Yr82，其中Yr3有3個(gè)等位基因，Yr4有2個(gè)等位基因)，如Yr65[7]、Yr76[8]、Yr78[9]和Yr80[10]等為近年定位的抗病基因。由于小麥條銹病菌的高度變異性, 許多曾在小麥生產(chǎn)上發(fā)揮重大作用的抗病基因已喪失抗性，目前僅有全生育期抗銹基因Yr5、Yr15和Yr61對當(dāng)前條銹菌流行小種CYR32、CYR33和CYR34具有一定的抗病性[11]，成株期抗銹基因Yr18具有相對持久的抗條銹性[12-13]。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為抗病基因的檢測、標(biāo)記及定位提供了可能，其中SSR標(biāo)記由于其位點(diǎn)豐富、操作簡單、重復(fù)性好、多為共顯性、實(shí)驗(yàn)成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)[14]，被廣泛應(yīng)用于小麥抗病基因定位和分子標(biāo)記輔助育種。

小麥種質(zhì)資源BJ399是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所從歐洲引進(jìn)的普通小麥品種，農(nóng)藝性狀優(yōu)良。在天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所甘谷試驗(yàn)站經(jīng)連續(xù)多年田間抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)該品種整個(gè)生育期對田間自然誘發(fā)的條銹病表現(xiàn)免疫至近免疫，對白粉病表現(xiàn)高抗?；诖?，本研究利用條銹菌生理小種CYR34對其雜交后代群體進(jìn)行遺傳分析和抗條銹病基因染色體定位，旨在明確BJ399的抗條銹病遺傳基礎(chǔ)，為該抗源在甘肅隴南地區(qū)的有效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

利用抗條銹病材料BJ399和感病品種銘賢169配制雜交組合，分別獲得F1、F2和BC1代材料，以上材料均由天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中梁試驗(yàn)站提供；供試菌種為生理小種CYR34的單孢菌系，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所小麥病害課題組提供。

1.2 苗期條銹病抗性鑒定

將試驗(yàn)材料播于白色塑料缽內(nèi)，待幼苗長至2葉1心期，采用抖孢子粉法接種條銹菌單孢菌系CYR34，接種后幼苗置于10 ℃黑暗條件下保濕24 h，之后置于溫室(平均溫度12～18 ℃，光照10～12 h/d，光強(qiáng)5 000～8 000 lx)誘導(dǎo)發(fā)病，待感病對照品種銘賢169充分發(fā)病后，調(diào)查親本和后代材料的反應(yīng)型，反應(yīng)型記載采用0、0；、 1、 2、3、4共6級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[15]。用卡方測驗(yàn)進(jìn)行適合度檢測，以明確BJ399對生理小種CYR34的抗病基因數(shù)、互作方式及抗病特點(diǎn)。

1.3 基因組DNA的提取和抗感池的構(gòu)建

采用改良的CTAB法[16-17]提取兩親本和F2代分離群體單株的基因組DNA。用分離群體分組分析法(bulked segregation analysis，BSA)鑒定與抗病基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記。根據(jù)抗病性鑒定結(jié)果，建立抗感池，將10株高抗單株DNA等量混合構(gòu)成抗病池，10株高感單株DNA等量混合構(gòu)成感病池。

1.4 SSR分析

小麥SSR引物根據(jù)R?der等[18]、Pestsova等[19]、Song等[20]和Somers等[21]報(bào)道的序列從https://wheat.pw.usda.gov網(wǎng)站查找并由北京賽百盛公司合成，以抗病親本、感病親本、抗病池、感病池的DNA為模板篩選SSR引物，尋找在抗病親本、抗病池、感病親本、感病池間有多態(tài)性的引物，進(jìn)一步將多態(tài)性引物在F2代分離群體中分析驗(yàn)證，檢測SSR標(biāo)記與抗病基因的連鎖程度。初步確定抗病基因所在染色體位置后，再選取其所在基因組區(qū)域的其他SSR引物進(jìn)一步篩選多態(tài)性。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為10 μL，其中5 μL 2×MasterMix(天根生化科技有限公司)、2 μL ddH2O、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL(50 ng·μL-1)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性50 s，58～62 ℃退火50 s(依據(jù)引物的退火溫度)，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀染色后置于膠片觀察燈上照相。

1.5 遺傳距離估算和連鎖分析

用JoinMap 4.0軟件計(jì)算SSR分子標(biāo)記與抗條銹病基因之間的遺傳距離，用MapDraw V2.1軟件繪制該基因的遺傳連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 BJ399對條銹病的抗性鑒定結(jié)果和遺傳分析

表1 BJ399對條銹菌小種CYR34的抗性遺傳分析Table 1 Genetic analysis of resistance to CYR34 in wheat germplasm BJ399

2.2 抗條銹病基因 YrBJ399的分子標(biāo)記定位 結(jié)果

隨機(jī)選取分布在整個(gè)小麥基因組上的400對SSR引物分別在抗病親本BJ399、感病親本銘賢169、抗病池和感病池DNA上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于2AS染色體上的SSR標(biāo)記Xgwm425在抗、感親本和抗、感池間存在多態(tài)性，用Xgwm425分別在10株純合抗病株和10株純合感病株上進(jìn)行小群體上驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Xgwm425和抗病基因YrBJ399有連鎖關(guān)系。進(jìn)一步選取2AS染色體上的其他SSR標(biāo)記進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Xwmc296和Xgwm558均具有多態(tài)性，分別將這3個(gè)SSR標(biāo)記(表2)在F2分離群體上進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)均與YrBJ399存在連鎖關(guān)系，且3個(gè)標(biāo)記都為共顯性標(biāo)記，在F2代群體上的分離均符合1∶2∶1的孟德爾遺傳(表3)。標(biāo)記Xwmc296和Xgwm425在BJ399/銘賢169分離群體部分單株上的擴(kuò)增結(jié)果見圖1和圖2。

表2 與BJ399抗條銹病基因連鎖的分子標(biāo)記引物序列Table 2 SSR primer sequences linked with stripe rust resistant gene derived from BJ399

表3 SSR標(biāo)記在(BJ399×銘賢169)F2代群體的分離Table 3 Segregation ratios of SSR markers in(BJ399×Mingxian 169) F2

M:50 bp ladder; 1:BJ399; 2:銘賢169; 3:抗病池; 4:感病池; 5～9:純合抗病單株; 10～13:雜合單株; 14～18:純合感病單株。

M:50 bp ladder; 1:BJ399; 2:銘賢169; 3:抗病池; 4:感病池; 5～9:純合抗病單株; 10～14:雜合單株; 15～19:純合感病單株。

2.3 連鎖分析

利用JoinMap 4.0軟件對3個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)與抗條銹病基因YrBJ399連鎖分析，結(jié)果表明3個(gè)標(biāo)記都位于抗病基因YrBJ399的一側(cè)，抗病基因和分子標(biāo)記在染色體上的排列順序?yàn)閅rBJ399-Xwmc296-Xgwm425-Xgwm558，最近標(biāo)記Xwmc296與抗條銹病基因YrBJ399的遺傳距離為9.5 cM，標(biāo)記Xgwm425與抗條銹病基因YrBJ399的遺傳距離為14.3 cM，由于3個(gè)SSR標(biāo)記均位于小麥2AS染色體上，因此，抗病基因YrBJ399被初步定位于2AS染色體上，靠近著絲點(diǎn)。據(jù)此繪制抗條銹基因YrBJ399的遺傳連鎖圖(圖3)。

圖3 抗條銹基因 YrBJ399 的遺傳連鎖圖譜

3 討 論

本研究對種質(zhì)資源BJ399的遺傳分析表明，BJ399對目前中國條銹菌流行小種CYR34具有良好的抗病性，是一個(gè)優(yōu)異的抗病種質(zhì)資源，BJ399對CYR34的抗銹性由1對顯性基因控制，該基因暫命名為YrBJ399, 利用SSR分子標(biāo)記篩選到3個(gè)與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記Xwmc296、Xgwm425和Xgwm558，初步將抗病基因YrBJ399定位到染色體2AS上，并構(gòu)建了分子標(biāo)記連鎖 圖譜。

目前定位于小麥2AS染色體上的抗條銹基因有Yr17、YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026、YrSph和YrR61等。Yr17[22-23]來源于偏凸山羊草，已被轉(zhuǎn)育到普通小麥品系VPM1中；YrElm1-4來源于柔軟濱麥草，楊敏娜等[24]將YrElm1-4定位到2AS，距其最近的SSR標(biāo)記Xwmc522的遺傳距離為5.9 cM；馬東方等[25]將中梁16中的抗銹基因YrZL16定位到2AS，與SSR標(biāo)記 Xbarc212和Xwmc177緊密連鎖，遺傳距離分別為5.4 cM和6.6 cM，并推測YrZL16來源于水源11；Lu等[26]推測YrZM175來源于BPM27，距其最近的SSR標(biāo)記Xgwm636的遺傳距離為4.9 cM；侯麗媛等[27]在小麥與中間偃麥草滲入系CH5026中發(fā)現(xiàn)抗病基因YrCH5026，并判斷YrCH5026來源于中間偃麥草Z1141，與其緊密連鎖的標(biāo)記為Xwmc382和Xgpw7101；YrSph[28]來源于印度圓粒小麥，為隱性基因；YrR61[29]來源于美國軟紅冬麥，為成株期抗病基因。而種質(zhì)資源BJ399起源于歐洲，屬普通小麥品種(張學(xué)勇，私人通訊)。從抗病基因來源看，YrBJ399是不同于Yr17、YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026、YrSph及YrR61的抗病基因。

從抗病基因所在染色體位置分析，YrElm1-4位于標(biāo)記Xgwm636和Xwmc522區(qū)間，YrZL16位于標(biāo)記 Xbarc212和Xwmc177區(qū)間，YrZM175位于標(biāo)記Xwmc382和Xgwm636區(qū)間，標(biāo)記 Xbarc212和Xwmc177、Xwmc382和Xgwm636都位于2AS中上部，標(biāo)記Xgwm636和Xwmc522位于2AS中部[21]。YrCH5026和YrBJ399雖都位于2AS著絲粒附近，但YrCH5026位于標(biāo)記Xwmc382和Xgpw7101區(qū)間，與標(biāo)記Xwmc382的遺傳距離為6.0 cM，YrBJ399與最近標(biāo)記Xwmc296的連鎖距離為9.5 cM，SSR標(biāo)記Xwmc382與Xwmc296的相對遺傳距離為33.0 cM[21]，故YrCH5026與YrBJ399明顯不同。此外，用與YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026連鎖的標(biāo)記在本研究的抗感親本、抗感池上進(jìn)行擴(kuò)增，在抗感親本和抗感池間均無多態(tài)性。Yr17單基因系苗期接種CYR34，其抗病性表現(xiàn)為中抗(反應(yīng)型2)，而BJ399對CYR34的抗病性表現(xiàn)為免疫或近免疫。綜合以上結(jié)果，推測BJ399所含的2AS上的抗條銹病基因YrBJ399與已知的Yr基因不同，可能為新的抗條銹病基因。

CYR34對Yr10和Yr26具有聯(lián)合毒性，該小種的發(fā)展對我國各主要麥區(qū)尤其甘肅隴南麥區(qū)的小麥生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[5]。對國外引進(jìn)的重要抗源材料進(jìn)行抗病基因組成和抗病特點(diǎn)研究，是合理利用抗病品種的基礎(chǔ)[30]。在當(dāng)前優(yōu)勢小種CYR34的流行壓力下，BJ399對CYR34表現(xiàn)出良好的抗病性，因此是一個(gè)具有巨大應(yīng)用潛力的抗源材料，在小麥抗條銹病育種中應(yīng)合理利用。由于本研究中所獲得的標(biāo)記與抗病基因的遺傳距離較遠(yuǎn)，需繼續(xù)尋找與抗病基因連鎖更為緊密的標(biāo)記，以便更好地應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種中。