王偉東，常慶瑞，王玉娜

(西北農林科技大學資源環(huán)境學院，陜西楊凌 712100)

葉綠素、類胡蘿卜素和花青素是植物體中的主要色素，廣泛存在于高等植物的根、莖、葉、花和果實中，并會隨著環(huán)境變化而呈現(xiàn)出不同顏色，它們的相對含量能夠反映植物生理狀態(tài)和物候狀況[1]?；ㄇ嗨貫橹参锶~片中的第三大色素，是一種水溶性黃酮類化合物[2]，在小麥、玉米等農作物的胚芽鞘、莖稈等部位也有積累[3]?；ㄇ嗨鼐哂卸喾N功能，如有較強的抗氧化性，不僅有助于葉片損傷修復[4]，而且可以用于藥物，預防冠心病、血栓等慢性病治療[5-6]；花青素也可以通過吸收光能而減少葉綠素對光的吸收，潛在地調節(jié)光合作用，從而起到光保護的作用[7]。因此，了解花青素的存在，檢測花青素的含量對于農田管理和檢測具有重要作用[8]。

傳統(tǒng)測量花青素含量的方法主要有微波法[9]、高效液相色譜法[10]以及分光光度計法[11]等，但是這些方法在檢測花青素含量時不但浪費人力物力，而且毀壞葉片，也不能迅速、即時地大面積監(jiān)測，因此需要一種精確且高效的方法來預測花青素含量[12]。高光譜能夠快速、準確、無破壞性地重復檢測花青素，故而在農業(yè)生產(chǎn)應用和植物生理研究方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿13]。

高光譜遙感反演預測植被理化指數(shù)的方法在過去幾十年里取得重大進步，但大多集中在葉綠素和類胡蘿卜素，對于花青素的研究甚少[14-15]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，通過選擇對花青素敏感的綠光波段和對葉綠素敏感的紅光波段與近紅外波段組合，構建不同的光譜指數(shù)，可以有效地對一種或多種植物葉片花青素含量進行反演，例如紅綠指數(shù)、花青素含量指數(shù)、調整花青素含量指數(shù)、花青素反射指數(shù)以及調整花青素反射指數(shù)等[16-17]，但是當作物種類發(fā)生變化時，葉片中葉綠素和花青素的含量發(fā)生變化，高光譜敏感波段也隨之改變，上述指數(shù)則不適用，需要進一步修正，尋找新的光譜指數(shù)。近年來，偏最小二乘法(PLS)作為一種新型的多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析方法，被廣泛用于植物色素高光譜預測中，該方法在使用時可以最大地利用光譜信息，以取得較好的預測效果。小麥作為當今世界重要的糧食作物，但關于小麥花青素的研究卻很少。本研究以關中地區(qū)的冬小麥為對象，利用SVC HR-1024i便攜式光譜儀獲取光譜數(shù)據(jù)，用Dualex Scientific+便攜式測定器獲取花青素相對含量數(shù)據(jù)，基于光譜數(shù)據(jù)分析不同生育時期的冬小麥葉片光譜特征，以不同波段任意組合的RSI、DSI、NDSI光譜指數(shù)為自變量構建一元回歸模型，利用PLS構建多元回歸模型，最終確定冬小麥葉片花青素相對含量的最優(yōu)預測模型，以期為冬小麥農田信息快速獲取與生長狀況監(jiān)測提供科學依據(jù)和有效手段。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與樣品采集

本研究于2016-2017年度冬小麥田間試驗進行。研究區(qū)位于陜西省楊凌區(qū)西北農林科技大學教學試驗農場(108°10′E，34°14′N)和咸陽市乾縣梁山鎮(zhèn)齊南村(108°07′E，34°38′N)，供試品種為小偃22。楊凌試驗點共設20個小區(qū)，小區(qū)面積為27.5 m2(5 m×5.5 m)，試驗設氮、磷兩種養(yǎng)分處理，每種養(yǎng)分設5個施肥水平，每個水平設2個重復，其中施氮水平分別為0、45、90、135和180 kg N·hm-2，施磷水平分別為0、22.5、45、67.5和90 kg P2O5·hm-2。乾縣試驗點共設36個小區(qū)，小區(qū)面積為90 m2(9 m×10 m)，試驗設氮、磷、鉀三種養(yǎng)分處理，每種養(yǎng)分設6個施肥水平，每個處理設2個重復，其中施氮水平分別為0、30、60、90、120和150 kg N·hm-2，施磷水平分別為0、22.5、45、67.5、90和112.5 kg P2O5·hm-2，施鉀水平分別為0、22.5、45、67.5、90和112.5 kg K2O·hm-2；另設，5個大田試驗，每個大田面積為150 m2(15 m×10 m)，設0、60、120、180和240 kg·hm-25個施氮水平，每個水平設2個重復。各處理的肥料均在冬小麥播前一次性施入，生育期不追肥，其他栽培管理措施同一般高產(chǎn)麥田。

樣品采集于冬小麥拔節(jié)期、抽穗期、開花期和灌漿期進行。采樣時，每小區(qū)選取2個樣點，在樣點附近采摘10株植株冠層相同葉位(沿主莖自上而下第一片)的葉片，共摘取10片，用保鮮袋密封，裝入藍冰保溫箱，帶回實驗室進行光譜及花青素含量定量研究。

1.2 花青素相對含量測定

Dualex Scientific+(Force-A，Orsay，法國)是一種新型便攜式植物葉片測定儀器，對植物葉片花青素進行無損精準測定[18]。測定時每個樣點從10片葉片中選擇新鮮葉片6片，從葉柄至葉尖分段測量6次，求平均值作為該葉片花青素含量，再將6片葉片值平均得該樣點葉片花青素相對含量。

1.3 葉片高光譜圖像獲取與處理

采用SVC HR-1024i 型全波段地物光譜儀進行葉片高光譜反射率測量，測量波長范圍350～ 2 500 nm，光譜測定使用儀器內置光源，為消除環(huán)境變化對儀器的影響，每隔0.5 h進行一次參考板校正。測定時，對測定過花青素的6片冬小麥葉片，使用葉片夾夾住葉片，從葉柄至葉尖分段測量3次，取平均值為該葉片的光譜反射率，取6條光譜平均值作為該樣點的光譜反射率。利用SVC HR-1024i PC 儀器自帶軟件對光譜數(shù)據(jù)進行預處理，并重采樣至1 nm。經(jīng)研究花青素對葉片光譜的響應波段主要在可見光和紫外波段，因此本研究主要選擇350～1 000 nm波段進行分析[19]。由于光譜儀采集的是離散的數(shù)據(jù)，故采用式(1)對原始光譜數(shù)據(jù)進行一階導數(shù)計算。

(1)

式中，Ri為波長inm處的光譜反射率，R′是Ri的一階導數(shù)，λi為第i個通道的波長。

1.4 光譜指數(shù)選擇

本研究利用Matlab軟件計算350～1 000 nm波段范圍內任意兩波段組合的3種光譜指數(shù)[20-23]，即差值指數(shù)(diffierence spectral index,DSI)、比值指數(shù)(ratio spectral index,RSI)和歸一化指數(shù)(normalized diffierence spectral index,NDSI)，并計算3種光譜指數(shù)與冬小麥葉片花青素相對含量的相關系數(shù)(r)，再利用Matlab制作3種光譜指數(shù)的相關性等勢圖，根據(jù)r絕對值最大原則，選取波段組合的光譜指數(shù)進行花青素相對含量分析。

1.5 預測模型建立與優(yōu)化

對每個生育時期采集的122個樣本按花青素值進行排序，采用分層抽樣的方法抽取92個作為建模樣本集，剩余30個作為檢驗樣本集。利用JMP Trial 14軟件中的偏最小二乘(partial least squares，PLS)構建模型。模型精度驗證和預測能力評判采用決定系數(shù)(r2)和均方根誤差(RMSE)兩個指標來評價各生育時期不同模型的擬合和預測能力。r2越接近1，RMSE越小，表示模型擬合能力和預測能力越好[24]。

2 結果與分析

2.1 冬小麥葉片花青素含量及其光譜特征

經(jīng)統(tǒng)計分析，冬小麥灌漿期葉片花青素平均含量明顯高于拔節(jié)期、抽穗期和開花期(表1)，其次是拔節(jié)期的花青素含量，其他兩個時期的花青素含量相近。

表1 冬小麥葉片花青素描述性統(tǒng)計Table 1 Descriptive statistics of anthocyanins in winter wheat leaves

在可見光范圍內，冬小麥葉片反射光譜在不同時期的變化趨勢基本一致(圖1左)。在550 nm波段附近形成反射峰，反射率峰值在0.16～0.2之間；在680～720 nm波段范圍，花青素反射率急劇升高，各時期最終在720～1 000 nm波段范圍形成一個反射率大于0.4的高反射平臺。在一階導數(shù)光譜中，紅邊波段得到顯著增強，其一階導數(shù)光譜是整個波段范圍的最大值(圖1右)。

圖1 不同生育時期冬小麥葉片光譜反射率和一階導數(shù)光譜

2.2 冬小麥葉片花青素含量的高光譜模型

2.2.1 基于敏感波段的冬小麥葉片花青素預測模型

經(jīng)對冬小麥花青素相對含量與光譜反射率進行相關性分析，在可見光范圍內，拔節(jié)期在400 nm波段左右二者呈顯著負相關，在550 nm波段附近呈極顯著正相關，其他波段的相關性較差；抽穗期、開花期和灌漿期在500～700 nm波段呈顯著正相關，相關系數(shù)最高分別為0.558 0、0.860 1和0.544 6，在近紅外光范圍內開花期呈極顯著負相關，其他時期相關性均較低(圖2)。經(jīng)對冬小麥葉片花青素含量與一階導數(shù)光譜的相關性分析，各生育時期在480～550和680～700 nm波段范圍均呈顯著正相關，在550～670和700～760 nm波段附近均呈負相關，最高相關性出現(xiàn)在開花期的755 nm波段處，r達到-0.899 4。

其次，每篇開場白中都有一定的話題與己方立場相關。而且，辯手所提出的立場都是己方動議的總體原因。Yoni Cohen-Idov用一個話題說明了己方立場：政府在公共場合設立監(jiān)控錄像的行為，“超越了其維護法律尊嚴和保障社會秩序的權利”，所以，我們提議取消這項政策。

圖2 冬小麥葉片花青素含量與原始光譜和一階導數(shù)光譜的相關性

根據(jù)前人經(jīng)驗[21]，分別從原始光譜和一階導數(shù)光譜中選擇與花青素相關性最高的波段作為自變量，構建葉片花青素一元回歸預測模型(表2)。通過比較發(fā)現(xiàn)，以拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期原始光譜敏感波段構建的模型的擬合性均較低，其他模型決定系數(shù)r2均超過0.5。其中，開花期的一階導數(shù)光譜在預測集和驗證集中，r2均最大(分別為0.852 4和0.901 6)，RMSE均最小(分別為 0.006 4和0.005 1)，說明利用一階導數(shù)光譜對該生育時期的葉片花青素預測效果較好。由于使用一階導數(shù)光譜敏感波段擬合的模型較簡單、方便和準確，因此在精度許可的情況下，該方法可作為一種監(jiān)測花青素的快速方法。

表2 基于敏感波段的冬小麥葉片花青素含量預測模型Table 2 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on sensitive bands

2.2.2 基于光譜指數(shù)的冬小麥葉片花青素預測模型

利用Matlab軟件計算350～1 000 nm波段范圍內任意兩波段組合的RSI、DSI、NDSI三種光譜指數(shù)，并計算3種光譜指數(shù)與冬小麥葉片花青素相對含量的相關系數(shù)(r)，同時采用Matlab制作3種光譜指數(shù)的相關等勢圖(以開花期為例)。從圖3可以看出，開花期的3種光譜指數(shù)均有r大于0.8的區(qū)域，表明這些波段組合而成的光譜指數(shù)與花青素含量密切相關，并且相關性較強的波段區(qū)域較為一致，約位于500～720 nm波段范圍，其中RSI的相關性最高，達到 0.934 5。其他生育時期與開花期趨勢變化具有相似性，相關性較強區(qū)域基本在500～720 nm波段。拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期相關性最強的指數(shù)分別為RSI、NDSI、RSI。

依據(jù)相關系數(shù)大小選擇3種光譜指數(shù)作為自變量(表3)，分別建立花青素含量一元預測模型(表4)。從表4可以看出，拔節(jié)期、開花期和灌漿期決定系數(shù)最高的為RSI模型，抽穗期為NDSI模型；在所有模型中，開花期RSI模型的決定系數(shù)最高(0.867 9)，RMSE最小(0.006 0)，說明以開花期RSI構建的模型擬合性最好。

表3 對花青素敏感的光譜指數(shù)入選波段相關指數(shù)及公式Table 3 Selected bands, formulas and related indices for spectral indices sensitive to anthocyanins

表4 基于光譜指數(shù)的冬小麥葉片花青素含量預測模型Table 4 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on spectral index

2.2.3 基于PLS的冬小麥葉片花青素預測模型

用偏最小二乘法(PLS)[25]，選擇相關性較高的RSI、DSI、NDSI 3種光譜指數(shù)為自變量，構建各生育時期冬小麥葉片花青素含量的多元預測模型(表5)。從表5可以看出，PLS模型相較于單指數(shù)模型，決定系數(shù)均變大，表明模型預測效果提升。其中，抽穗期模型的決定系數(shù)r2最高，為 0.880 4，RMSE為0.006 8；開花期r2為 0.875 9，RMSE為0.005 8。這說明兩個生育時期的模型均具有較高的擬合性。

表5 基于PLS冬小麥葉片花青素含量預測模型Table 5 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on PLS

對冬小麥葉片花青素含量的多元預測模型進行檢驗(圖4)表明，拔節(jié)、抽穗、開花和灌漿期的預測值與實測值之間高度相關，其中開花期的r2和RMSE分別最大和最小，分別為0.925 7和 0.004 8；抽穗期次之，r2為0.898 2，RMSE為 0.007 2，說明基于PLS建立的冬小麥葉片花青素含量預測模型中，開花期的模型最穩(wěn)定、精度最高，是監(jiān)測冬小麥葉片花青素含量的最優(yōu)模型。

圖4 基于PLS冬小麥葉片花青素含量預測模型精度檢驗

3 討 論

本研究表明，在以原始光譜敏感波段為自變量構建的各生育時期預測模型中，僅開花期模型的r2達到0.7，預測效果較好，敏感波段為547 nm，說明綠光波段是花青素含量的敏感波段，這與前人的研究結果基本一致；以一階導數(shù)光譜敏感波段為自變量構建的各生育時期模型中，僅灌漿期模型的r2為0.3，其他生育時期模型精度均超過0.5，敏感波段分別為644、639和755 nm，均位于紅光范圍內，可見紅光對植物體生長發(fā)育有重要影響，可以利用這一特征對小麥健康狀況進行診斷。利用各生育時期冬小麥葉片一階導數(shù)光譜的敏感波段構建花青素的一元預測模型，不但簡單方便，而且精度有很大提高，可以作為一種監(jiān)測花青素含量的快速方法。

在各光譜指數(shù)模型中，灌漿期模型的預測效果相較于原始光譜模型精度有所提高，但效果仍然較差，這是由于在灌漿期時，冬小麥體內各色素轉化為植物生長所需的營養(yǎng)物質，對光的吸收和利用減弱，導致反射光譜異常，進而影響模型的精度。在拔節(jié)期、抽穗期和開花期中，RSI和NDSI模型精度均高于DSI模型，有更好的預測效果，而在這3個生育時期的兩種光譜指數(shù)的入選波段中，均有來自紅光和近紅外光范圍的波段，這是因為植物體對紅光具有強吸收作用，紅光的變化直接影響植物體生長，因此研究紅光和近紅外光對冬小麥生長發(fā)育階段的影響機制具有重要意義。

單一光譜指數(shù)往往只包含作物光譜的部分信息，用其構成的模型的精度和穩(wěn)定性都難以得到保證，因此本研究構建的PLS模型中，將3種光譜指數(shù)作為自變量建立多元估算模型，進一步提高了花青素含量的預測精度，穩(wěn)定性也得到增強，能夠快速、無損檢測冬小麥生長狀況。

4 結 論

(1)各生育時期葉片光譜反射率變化趨勢相似，在550 nm處形成反射峰，在400 nm和680 nm處形成吸收谷，在680～720 nm波段內反射率急劇升高，最終在720～1 000 nm波段形成高反射平臺。

(2)各生育時期模型中，開花期模型精度較高，表現(xiàn)穩(wěn)定，可作為預測冬小麥花青素的最佳生育時期；開花期PLS模型可作為預測冬小麥花青素的最優(yōu)模型。