楊華 牛翠

[摘要] 目的 探討改良CarbaNP法和碳青霉烯酶失活法（CIM）在耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌檢測中的應(yīng)用價值。 方法 收集2014年1月～2015年6月河北省邢臺市第三醫(yī)院臨床分離的120株鮑曼不動桿菌和100株銅綠假單胞菌。采用全自動微生物儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗;采用改良CarbaNP法和CIM法檢測細(xì)菌碳青霉烯酶，后采用基因檢測進(jìn)行驗證。 結(jié)果 120株鮑曼不動桿菌中，碳青霉烯類抗生素耐藥株和敏感株分別占61.67%和38.33%;100株銅綠假單胞菌中，碳青霉烯類抗生素耐藥株和敏感株分別占60.00%和40.00%。在鮑曼不動桿菌中，OXA-23基因攜帶率為94.59%（70/74），以其為標(biāo)準(zhǔn)，改良CarbaNP法和CIM法與基因檢測法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。改良CarbaNP法和CIM法分別與基因檢測結(jié)果比較，CIM法的敏感性和特異性均略高于改良CarbaNP法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。在銅綠假單胞菌中，VIM-1陽性攜帶率為93.33%（56/60），以其為標(biāo)準(zhǔn)，改良CarbaNP法和CIM法與基因檢測法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。改良CarbaNP法和CIM法分別與基因檢測結(jié)果比較，CIM法的敏感性和特異性均略高于改良CarbaNP法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05） 結(jié)論 改良CarbaNP法和CIM法在鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素快速檢測中均具有一定價值，以后者檢測效能較好。

[關(guān)鍵詞] 鮑曼不動桿菌;銅綠假單胞菌;改良CarbaNP;碳青霉烯酶失活法

[中圖分類號] R446.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）06（a）-0024-05

[Abstract] Objective To investigate the application value analysis of modified CarbaNP method and carbapenems enzyme inactivation method （CIM） in the detection of carbapenem-resistant antibiotics Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. Methods A total of 120 strains of Acinetobacter baumannii and 100 strains of Pseudomonas aeruginosa were collected from Xingtai Third Hospital， Hebei Province from January 2014 to June 2015. Bacteria identification and drug susceptibility test were carried out with automatic microbiological instrument. Modified CarbaNP method and CIM method were used to detect bacterial carbapenems， and then gene test was used for validation. Results Among the 120 Acinetobacter baumannii strains， carbapenems antibiotic resistant strains and sensitive strains accounted for 61.67% and 38.33%， respectively. Among the 100 strains of Pseudomonas aeruginosa， carbapenems antibiotic resistant strains and sensitive strains accounted for 60.00% and 40.00% respectively. In Acinetobacter baumannii， the OXA-23 gene carrying rate was 94.59% （70/74）， which was taken as the standard， and there was no significant difference between the modified CarbaNP method and the CIM method and the gene detection method （P > 0.05）. The modified CarbaNP method and the CIM method were compared with the results of the genetic test respectively which showed that the sensitivity and specificity of the modified CarbaNP method and the CIM method were slightly higher than that of the modified CarbaNP method， but the differences were not statistically significant （P > 0.05）. In Pseudomonas aeruginosa， the positive carrying rate of VIM-1 was 93.33% （56/60）， which was taken as the standard， and there was no significant difference between the modified CarbaNP method and the CIM method and the gene detection method （P > 0.05）. The modified CarbaNP method and the CIM method were compared with the results of the genetic test respectively which showed that the sensitivity and specificity of the modified CarbaNP method and the CIM method were slightly higher than that of the modified CarbaNP method， but the differences were not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion The modified CarbaNP method and CIM method have some value in the rapid detection of carbapenem-resistant Antibiotics acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa， and the latter has better detection efficiency.

[Key words] Acinetobacter baumannii; Pseudomonas aeruginosa; Modified CarbaNP; Carbapenems enzyme inactivation method

鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌是臨床常見的一種非發(fā)酵條件下致病的革蘭陰性桿菌，當(dāng)患者免疫力下降，其可侵襲機體，引發(fā)呼吸道、泌尿道及傷口等處感染，嚴(yán)重時可進(jìn)展為敗血癥、膿毒血癥等，威脅患者生命[1-2]。近年來數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，院內(nèi)鮑曼不動桿菌檢出率不斷升高，僅次于銅綠假單胞菌，甚至在某些醫(yī)院其檢出率已超過銅綠假單胞菌[3]。亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類抗菌藥物是臨床抗革蘭陰性桿菌感染的最后防線，但近年來由于此類藥物廣泛且大量的應(yīng)用，大多數(shù)鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌可產(chǎn)生碳青霉烯酶，導(dǎo)致對碳青霉烯類抗生素耐藥，使臨床抗感染治療及醫(yī)院感染控制面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[4-5]。因此盡快檢測并鑒定其耐藥性，為臨床選擇合適抗生素，減少醫(yī)療消耗及耐藥株是目前醫(yī)院感染控制的主要任務(wù)之一。目前，臨床多采用改良Hodge法和商品化Etest試紙條等檢測碳青霉烯酶，操作步驟復(fù)雜、耗時長、假陰性和假陽性率較高，因此臨床急需一種簡單、快速且診斷效能較高的檢測方法[6]。改良CarbaNP法和碳青霉烯酶失活法（CIM）是檢測細(xì)菌碳青霉烯酶的兩種新型方法，但尚未在臨床廣泛推廣運用[7]。本研究收集河北省邢臺市第三醫(yī)院（以下簡稱“我院”）臨床分離的120株鮑曼不動桿菌和100株銅綠假單胞菌，旨在探討改良CarbaNP法和CIM法在耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌檢測中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2014年1月～2015年6月于我院臨床標(biāo)本分離的120株鮑曼不動桿菌和100株銅綠假單胞菌，分別來自于急診室、呼吸內(nèi)科、肝膽外科、神經(jīng)外科及重癥加強護(hù)理病房等科室，包括血液、痰液、尿液、咽拭子、膽汁及引流液等標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥物敏感檢測 ?嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程（第3版）》[8]操作規(guī)程完成臨床標(biāo)本的采集、接種和分離，經(jīng)純培養(yǎng)后，采用VITEK-2 COMPACT全自動細(xì)菌分析儀（購自法國梅里埃公司）對菌種進(jìn)行鑒定和藥敏檢測，統(tǒng)一采用美洛培南和亞安培南紙片法（藥敏紙片購自北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：201312DT）檢測是否碳青霉烯類抗生素耐藥，任意一種抗生素耐藥即可判定為碳青霉烯類抗生素耐藥，后用無菌紙片將其保存于-20℃冰箱。

1.2.2 改良CarbaNP法 ?參照CLSI M100-S25文件[9]推薦方法進(jìn)行檢測，每株菌2管——A管（對照管）和B管（試驗管）。結(jié)果判讀：①陰性（非產(chǎn)碳青霉烯）：A管和B管均為紅色;②陽性（產(chǎn)碳青霉烯）：A管紅色、B管變?yōu)辄S色/橙色;③無效：A管和B管均變?yōu)辄S色/橙色。其中陽性和陰性對照分別為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706。

1.2.3 CIM法 ?參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行CIM實驗，結(jié)果判讀：①陽性（產(chǎn)碳青霉烯）：藥敏片周圍無抑菌環(huán);②陰性（非產(chǎn)碳青霉烯）：藥敏片周圍有抑菌環(huán)。其中陽性和陰性對照分別為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706，空白對照為無菌水浸泡的美洛培南紙片。

1.2.4 碳青霉烯酶基因檢測 ?嚴(yán)格按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，生產(chǎn)批號：201311PX）說明書完成DNA提取，并以此為模版檢測鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶相關(guān)編碼基因，其中引物設(shè)計參考文獻(xiàn)[11]，在本研究中檢測的鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯酶基因包括：A類：KPC和GES;B類：IMP和VIM;D類：OXA-23，銅綠假單胞菌耐碳青霉烯酶基因包括VIM-1、IMP-4、KPC-2和NDM-1，后續(xù)具體操作參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行耐藥基因PCR擴增，并將產(chǎn)物送至上海吉凱生物有限公司進(jìn)行測序鑒定。引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥情況

120株鮑曼不動桿菌中，74株碳青霉烯類抗生素耐藥，占比為61.67%;46株碳青霉烯類抗生素敏感，占比為38.33%。100株銅綠假單胞菌中，60株碳青霉烯類抗生素耐藥，占比為60.00%;40株碳青霉烯類抗生素敏感，占比為40.00%。

2.2 碳青霉烯酶相關(guān)編碼基因檢測結(jié)果

74株碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌中，碳青霉烯酶A類基因檢測均為陰性，碳青霉烯酶B類基因中，IMP基因陽性1株，碳青霉烯酶D類基因中，OXA-23基因陽性70株;46株碳青霉烯類抗生素敏感中，OXA-23基因陰性44株，碳青霉烯酶A類和B類均為陰性;60株碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌中，VIM-1陽性56株，IMP-4陽性1株，KPC-2和NDM-1檢測均為陰性;40株碳青霉烯類抗生素敏感銅綠假單胞菌中，VIM-1陰性37株，KPC-2和NDM-1檢測均為陰性。

2.3 改良CarbaNP法和CIM法檢測結(jié)果

120株鮑曼不動桿菌中，改良CarbaNP陽性64株，陰性56株;CIM法陽性66株，陰性54株。100株銅綠假單胞菌中，改良CarbaNP陽性55株，陰性45株;CIM法陽性56株，陰性44株。

2.4 改良CarbaNP法和CIM法在鮑曼不動桿菌中的檢測效能比較

在鮑曼不動桿菌中，OXA-23基因攜帶率為94.59%（70/74），以其為標(biāo)準(zhǔn)，在檢測鮑曼不動桿菌碳青霉烯類抗生素耐藥方面上，基因檢測法與改良CarbaNP法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 2.736，P = 0.098）。見表2?；驒z測法與CIM法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 2.551，P = 0.110）。見表3。改良CarbaNP法和CIM法分別與基因檢測結(jié)果比較，CIM法的敏感性（90.74%，49/54）和特異性（98.48%，65/66）均略高于改良CarbaNP法的敏感性（83.93%，47/56）和特異性（95.31%，61/64），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 1.149， P = 0.284;χ2 = 1.096，P = 0.295）。見表2～3。

2.5 改良CarbaNP法和CIM法在銅綠假單胞菌中的檢測效能比較

在銅綠假單胞菌中，VIM-1陽性攜帶率為93.33%（56/60），以其為標(biāo)準(zhǔn)，在檢測銅綠假單胞菌碳青霉烯類抗生素耐藥方面上，基因檢測法與改良CarbaNP法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 0.364，P = 0.546）。見表4。基因檢測法與CIM法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 0.324，P = 0.569）。見表5。改良CarbaNP法和CIM法分別與基因檢測結(jié)果比較，CIM法的敏感性（95.56%，43/45）和特異性（98.18%，54/55）均略高于改良CarbaNP法的敏感性（86.96%，40/46）和特異性（92.59%，50/54），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 3.751，P = 0.053;χ2 = 1.945，P = 0.163）。見表4～5。

3 討論

近年，鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌分離率呈上升趨勢，多見于有基礎(chǔ)疾病、有重大外科手術(shù)史或長期住院患者，不利于疾病的恢復(fù)及預(yù)后[13]。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計，院內(nèi)鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌感染可明顯提高患者死亡率，可高達(dá)40%，并與多重耐藥相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制主要包括產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜孔蛋白通透性下降，外排泵的過度表達(dá)和藥物作用靶位改變3種，前者是其主要機制[15]。碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少一類-β內(nèi)酰胺酶（亞胺培南或美羅培南），主要由碳青霉烯酶編碼基因決定，根據(jù)Amble分子分類法，將其分為絲氨酸酶-A類，包括KPC，金屬酶-B類，包括VIM和IMP和D類，包括OXA[16]。研究發(fā)現(xiàn)，D類的水解作用是鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類的最重要原因，尤以O(shè)XA-23多見[17]。而IMP和VIM在銅綠假單胞菌中常見[18]。本研究選取KPC、GES、IMP、VIM與OXA-23作為鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶檢測基因，選取VIM-1、IMP-4、KPC-2和NDM-1作為銅綠假單胞菌碳青霉烯酶檢測基因，發(fā)現(xiàn)OXA-23基因攜帶率為94.59%，VIM-1基因攜帶率為93.33%，與前述結(jié)論基本一致，并作為本研究鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，而其他鮑曼不動桿菌雖表現(xiàn)為碳青霉烯類藥物耐藥，但其耐藥基因表型不是D類，可能是由其他機制介導(dǎo)。

鑒于臨床鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌感染的嚴(yán)峻形勢，2015年CLSICarba NP試驗作為碳青霉烯酶的生化檢測方法，多用于流行病學(xué)調(diào)查和感染控制，并展現(xiàn)了其在腸桿菌和綠膿種的價值，但對不動桿菌產(chǎn)生的大量D類碳青霉烯酶不敏感，與蛋白抽提液有關(guān)，改良CarbaNP法則用高滲5 mol/L NaCl取代蛋白抽提液，使細(xì)菌完全溶解，菌量和酶釋放量明顯增加[19-23]。CIM法是由Kim van der Zwaluw等研究的一種新型碳青霉烯酶表型檢測方法，目前在對VIM、IMP、OXA-23、KPC、NDM和OXA-48基因介導(dǎo)的碳青霉烯酶耐藥與基因檢測結(jié)果符合率基本一致[24]。在本研究鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶檢測中，改良CarbaNP法與基因檢測法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），CIM法和基因檢測法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示改良CarbaNP法和CIM法在鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶檢測中均具有一定價值，與前述結(jié)論基本一致。但本研究還發(fā)現(xiàn)，CIM法敏感性和特異性均略高于改良CarbaNP法，提示CIM法在鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶檢測中優(yōu)于改良CarbaNP法，但本研究標(biāo)本量有限，暫未發(fā)現(xiàn)其顯著性差異，后續(xù)可繼續(xù)探討。

綜上認(rèn)為，改良CarbaNP法和CIM法在鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素快速檢測中均具有一定價值，以后者檢測效能較好。

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