張瑤 陳麗展 吳朔 張艷 歐陽海峰△

(1.西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710000；2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710000)

致癌表皮生長因子受體(EGFR)和間變性淋巴瘤激酶(ALK)在肺癌的靶向治療方面已顯示出有較好的前景[1-2]，但肺癌仍然是全球癌癥死亡的主要原因，每年約有160萬人死于肺癌[3]。免疫檢查點已成為非小細胞肺癌(NSCLC)及許多惡性腫瘤免疫治療的新靶點[4]。此外，靶向程序性死亡受體1(PD-1)/程序性死亡配體1(PD-L1)的單克隆抗體，如納武單抗、派姆單抗等，已在臨床試驗中發(fā)揮了重要的抗腫瘤作用[5-6]。關于PD-L1表達與NSCLC患者存活之間的關系已有報告[7-8]，但對于NSCLC患者在接受抗癌治療后的PD-L1表達變化研究卻較為少見。本研究旨在調(diào)查PD-L1在接受抗癌治療的NSCLC患者組織中的表達變化，以期為NSCLC患者的免疫治療提供更多的理論基礎。

1 資料和方法

1.1樣本收集 收集2015年1月至2018年12月于空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科行病理學確診為NSCLC的76例患者的腫瘤組織，其中男46例，女30例，年齡39～89歲，中位年齡為67歲。本研究獲得我院倫理委員會批準和患者知情同意?；颊呓邮艿目拱┲委熡腥碇委熀头侨碇委煟渲?，全身治療包括細胞毒性化療、放化療、EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)和間變淋巴瘤激酶基因(ALK)抑制劑，非全身治療包括手術切除(無輔助化療)，放射治療和切除。通過ARMS技術聯(lián)合Taqman探針檢測EGFR突變[9-10]。利用免疫組化分析PD-L1表達的變化，僅接受免疫檢查點抑制劑或姑息性放療的患者被排除在外。

1.2PD-L1表達的免疫組化分析 所有腫瘤組織標本均經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片。切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟和水化后，用0.3%H2O2的甲醇溶液處理30 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，在Tris-EDTA緩沖液(pH9.0)中在95 ℃下高壓滅菌40 min抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，在4 ℃下與兔抗人PD-L1單克隆抗體(1∶1 000稀釋，美國Spring Bioscience公司)一起溫育過夜，PBS沖洗3次。在室溫下加入過氧化物酶標記的兔聚合物抗體(EnVision，K4002，美國Dako公司)孵育30 min，然后在室溫下用3,3’二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(K3468，美國Dako公司)孵育4 min，再用PBS沖洗，DAB顯色，Mayer蘇木精溶液輕度復染。由兩位病理學家獨立評估PD-L1的表達，為了獲得合格的標本，評估了標本中的巨噬細胞作為PD-L1免疫染色的內(nèi)部對照實驗。根據(jù)之前報道，如果標本中有超過1%的腫瘤細胞被染色，則被考慮為PD-L1陽性表達，如果標本中有超過50%的腫瘤細胞被染色，則被考慮為PD-L1強陽性表達[11]。因此，我們根據(jù)PD-L1染色的腫瘤細胞百分比確定了兩個組：A組(陰性)：0%；B組(陽性)：≥1%。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Kaplan-Meier法對可能影響患者預后的指標進行單因素分析并繪制生存曲線。通過Log-rank時序檢驗比較兩組生存曲線的差異。運用Cox風險回歸模型進行多因素分析，使用Wilcoxon符號秩檢驗比較了患者治療前和治療后PD-L1表達的分布。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1患者的一般資料比較 A組EGFR野生突變的人數(shù)顯著低于B組(P=0.039)，但兩組在年齡、性別、吸煙狀況、組織學及診斷階段等方面沒有顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者的臨床特征比較

2.2PD-L1在治療前后表達的差異 76例患者在進行抗癌治療前，有38例患者的腫瘤細胞具有陽性PD-L1染色(B組，圖1)，占50%。

2.3患者治療情況 在本研究中，46例患者接受了全身治療，其中細胞毒性化療(包括輔助化療)者25例、放化療者8例、細胞毒性化療和EGFR-TKI者10例、EGFR-TKI者3例、ALK抑制劑者0例；30例患者接受了非全身性抗癌治療，其中手術切除(無輔助化療)者27例、放射治療者2例、切除者1例。進行抗癌治療后，有36例患者的腫瘤細胞具有陽性PD-L1染色，占47%，這與治療前相似(P=0.706)。與此同時，我們在15例(20%)患者的腫瘤組織標本中觀察到PD-L1的表達顯著增加，在18例(24%)患者的腫瘤組織標本中觀察到PD-L1的表達顯著減少(圖2)。在43例接受細胞毒性化療的患者中，有8例(19%)患者顯示PD-L1表達顯著增加，8例(19%)患者顯示PD-L1表達顯著減少。在使用EGFR-TKI治療的13例患者中，有5例(38%)患者顯示PD-L1表達顯著增加，1例(8%)患者顯示出PD-L1表達顯著減少。在30例接受了非全身性抗癌治療的患者中，只有2例(7%)患者顯示出PD-L1表達顯著增加，9例(30%)患者顯示出PD-L1表達顯著減少。與接受非全身性抗癌治療患者相比，接受EGFR-TKI治療患者的PD-L1表達顯著增加(P=0.031)。

2.4兩組預后比較 在患有Ⅰ期或Ⅱ期癌癥的患者中，診斷的隨訪時間中位數(shù)為45.6個月。B組患者的生存率低于A組(B組和A組的中位數(shù)分別為75.6個月，103.1個月，P=0.065)。見圖3。

注：A.陰性表達；B.陽性表達。圖3 兩組Kaplan-Meier曲線分析結(jié)果

3 討 論

PD-L1，也稱B7-H1或CD274，是B7超家族中重要的成員，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，廣泛表達于多種免疫細胞表面，如T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，除此之外，PD-L1還在多種癌組織中過表達；在病理狀態(tài)下，PD-L1與其受體 PD-1 結(jié)合，可顯著抑制T細胞的增殖和活化，使腫瘤發(fā)生免疫逃逸。

本研究中通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，43%的NSCLC患者在接受抗癌治療后，腫瘤組織標本中的PD-L1的表達發(fā)生變化，且與非全身治療的患者相比，用EGFR-TKI治療的患者的PD-L1表達顯著增加，同時，預后分析顯示，PD-L1陽性表達和陰性表達對患者的預后沒有顯著性影響。程小珍等報道，肝癌患者在經(jīng)過治療之后，PD-L1表達顯著下降。J·F·Gainor等[13]回顧性地分析了EGFR突變的NSCLC患者在接受EGFR-TKI治療前和治療后活組織檢查樣本的PD-L1表達狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)15%的患者在EGFR-TKI治療前顯示腫瘤細胞PD-L1表達，而25%的患者在EGFR-TKI治療后顯示腫瘤細胞PD-L1表達(P=0.181)。潘貝晶等[14]通過研究142例女性三音性乳腺癌患者的資料，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的PD-L1表達與OS、PFS沒有明顯的相關性。以上結(jié)果均與本研究結(jié)果一致，并支持EGFR-TKI治療可能增加EGFR突變的NSCLC患者中PD-L1表達的假設。筆者推測，EGFR-T790M突變，HGF分泌、MET擴增、IGF-1R活化、HER2擴增、EMT、PTEN缺失等機制促使患者對EGFR-TKI治療產(chǎn)生耐藥，而EGFR-TKI耐藥細胞通則進一步促進PD-L1的表達，然而，目前對于耐藥細胞促進PD-L1表達的機制尚不明確。

綜上所述，在接受抗癌治療后，部分NSCLC患者的腫瘤組織標本的PD-L1的表達會發(fā)生變化，且EGFR-TKI治療似乎促進了NSCLC患者的PD-L1表達。