尉曉蔚 劉閣,2 楊帆 楊佳慧 王本杰 于煒婷 趙德偉**

（1.大連大學附屬中山醫(yī)院骨科實驗室，遼寧大連 116001；2.大連交通大學機械工程學院，遼寧大連 116028）

因創(chuàng)傷、壞死、炎癥、退變、腫瘤等引起的骨軟骨聯(lián)合病變是骨科常見疾病，其治療一直缺乏有效手段[1-3]。對于小面積的骨軟骨損傷，馬賽克成形術是主要治療方法，但存在取材有限、供區(qū)損傷等問題[4]；對于大面積的骨軟骨缺損，最常用的方法是關節(jié)置換[5]。但應用假體存在感染、松動、下沉等并發(fā)癥。組織工程雙相支架替代軟骨和骨層是目前研究的熱點，一般由低強度和生物降解支架組成上層軟骨和高強度材料組成底層骨[6]。

鉭金屬抗腐蝕，對機體無刺激，有很強的延展性和堅韌度，是生物適應性最好的金屬之一[7,8]。但其熔點接近3000℃，傳統(tǒng)工藝方法很難得到孔隙均勻且開孔率高的多孔鉭金屬。美國捷邁是目前唯一能夠生產(chǎn)多孔鉭金屬的器械公司，其產(chǎn)品大量應用于骨科領域[9]，但價格昂貴，屬于國際壟斷。本課題組采用多孔碳化硅支架聯(lián)合化學氣相沉積技術成功制備了多孔鉭金屬[10]。本研究采用纖維蛋白黏合劑將膠原膜及自主研發(fā)的多孔鉭金屬進行界面結合，并探討其修復山羊大面積骨軟骨缺損的效果，為大面積骨軟骨聯(lián)合病變的臨床治療提供新的組織工程學方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑、材料

普通級實驗山羊32 只，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心，10月齡，均為雄性，體重約15 kg，實驗動物許可證為SYXK（遼）2018-0005。

按照本課題組建立的方法制備多孔鉭金屬支架[10]。該實驗中制備的多孔鉭金屬為直徑10 mm、高10 mm 的圓柱?？山到忉t(yī)用膠原膜購于瑞士Geistlich Pharma AG 公司。纖維蛋白黏合劑購自廣州倍繡生物技術有限公司。

1.2 膠原膜/國產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架的制備

1.3 掃描電鏡觀察及能譜分析

將國產(chǎn)多孔鉭金屬、膠原膜、膠原膜/國產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架表面真空噴金固定，置于掃描電鏡下觀察微觀形貌并進行能譜微區(qū)點或面的成分譜線分析。

1.4 力學檢測

采用萬能力學測試機分別測定膠原膜拉力、壓力，國產(chǎn)多孔鉭金屬壓力，膠原膜和國產(chǎn)多孔鉭金屬之間界面的結合力、剪切力。

1.5 骨軟骨缺損動物模型的制備

所有山羊的左后肢用于骨軟骨缺損模型的建立。實驗動物麻醉后，將術區(qū)消毒鋪巾，暴露股骨頭，用外徑為10 mm的不帶鋸齒的環(huán)鉆在全層軟骨中央部位鑿孔，造成軟骨缺損，并同時滴注生理鹽水，防止局部過熱致周圍軟骨壞死；然后用外徑為10 mm的帶鋸齒的環(huán)鉆在軟骨缺損區(qū)正下方鑿孔，深度約為10 mm，制備軟骨下骨缺損。沖洗關節(jié)腔內碎屑，測量鑿孔直徑為10 mm，深度為12 mm，則骨軟骨聯(lián)合缺損模型制備成功。

1.6 動物觀察及分組

將實驗動物采用隨機數(shù)字表法分為單純膠原膜組、單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組、雙相支架組、單純骨軟骨缺損組4組，每組各8只。建模成功后，單純骨軟骨缺損組不做任何治療，而其余3組將不同支架植入骨軟骨缺損中。所有山羊的右后肢作為空白對照。術后用生理鹽水徹底沖洗，依次縫合關節(jié)囊、皮下軟組織以及皮膚。每只動物術后常規(guī)注射青霉素160萬U，肌內注射，1次/d，治療1周。麻醉恢復后讓其自由活動，后肢不做特殊處理。

1.7 大體觀察及評分

觀察動物整體活動情況，對比觀察左右髖關節(jié)活動范圍。評價各組實驗動物股骨頭部位骨軟骨缺損的修復效果。并于術后第16 周將實驗動物處死、取材，觀察關節(jié)有無腫脹、破潰，關節(jié)腔內有無感染或積液。從缺損邊緣修復情況、軟骨表面平整度、缺損填充、新生軟骨的顏色和透明度等方面分析，并記錄國際軟骨修復學會評分（International Cartilage Re?pair Society score,ICRS）[11]。

1.8 病理觀察及定量分析

術后16 周處死實驗動物，股骨頭標本經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定48 h，乙醇梯度脫水，常規(guī)浸潤、包埋，再經(jīng)德國EXAKT 切片機切片。磨至厚度約20 μm，拋光后行VG染色，觀察多孔鉭金屬周圍新骨再生以及膠原膜處軟骨形成情況，并于光鏡下觀察。采用改良O'Driscoll 評分評價軟骨修復情況[12]。應用常規(guī)Image-Pro Plus 6.0軟件計算新生成骨面積。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析均符合正態(tài)分布，以表示。多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雙相支架掃描電鏡觀察及能譜分析結果

本課題組制備的多孔鉭金屬孔徑為200～500 μm，開孔率為75%～85%。掃描電鏡下可見多孔鉭金屬為相互交通的多孔狀三維立體結構（圖2A）。能譜分析結果顯示，多孔鉭金屬中碳、硅及鉭分別占12.3%、9.5%和78.2%。采用市場化的纖維蛋白黏合劑將膠原膜及自主研發(fā)的多孔鉭金屬進行界面結合，掃描電鏡下顯示結合面均勻、平滑，黏合牢固（圖2B）；膠原膜內可見絲狀膠原分布均勻，結構清晰可見（圖2C）。能譜分析結果顯示，膠原膜由碳、氧和鈣3種元素組成，分別占65.8%、32.7%及1.5%。

2.2 雙相支架材料的力學性能

為了模擬體內的壓力，本實驗分別測試了材料與界面之間的抗壓和抗拉能力。膠原膜的平均抗拉強度和抗壓強度分別為3.64 MPa和3.40 MPa。本課題組制備的多孔鉭金屬的平均抗壓強度為43.0 MPa。采用市場化的纖維蛋白黏合劑進行界面結合，測試結果顯示界面結合強度約為0.23 MPa，界面剪切強度約為0.18 MPa。

隨著水利工程實施主體向基層一線轉移，縣（區(qū)）質量監(jiān)督工作面臨不少困難和問題，特別是在近年的工程質量監(jiān)督管理中，發(fā)現(xiàn)的一些問題在一定程度上影響工程的質量、進度和安全，不容忽視，必須予以解決。

2.3 各組實驗動物術后大體表現(xiàn)及ICRS評分比較

單純采用膠原膜修復骨軟骨缺損時，由于膠原膜本身機械強度低，所以植入16 周后取材時可見材料下陷。材料與周圍軟骨組織的整合性差，軟骨發(fā)生明顯退變（圖3A）。單純國產(chǎn)多孔鉭金屬修復骨軟骨缺損時，材料與周圍骨組織的整合性好，但是對于軟骨組織的修復幾乎沒有（圖3B）。膠原膜/國產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架植入16周后取材時可見手術部位無感染、水腫或積液，缺損部位的關節(jié)面近乎平整，修復組織與周圍軟骨組織結合緊密，未見退化磨損跡象（圖3C）。單純骨軟骨缺損組幾乎未見自身修復，同時軟骨發(fā)生明顯退變（圖3D）。正常關節(jié)軟骨呈淺藍白色，半透明，光滑而有光澤（圖3E）。

單純膠原膜組、單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組以及雙相支架組的ICRS 評分均高于單純骨軟骨缺損組，雙相支架組的ICRS 評分均高于單純膠原膜組、單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組，且差異均有統(tǒng)計學意義；而單純膠原膜組與單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組ICRS評分差異均無統(tǒng)計學意義（表1）。

2.4 各組術后病理表現(xiàn)及定量分析結果比較

膠原膜植入關節(jié)骨軟骨缺損區(qū)域后形成新生組織。在軟骨缺損位點的邊緣處可見新生的軟骨細胞，缺損區(qū)可見大量拱狀排列的纖維組織（圖4A）。在單純植入國產(chǎn)多孔鉭金屬16 周后，多孔鉭的孔隙幾乎全部被新生的類骨質所填充（圖4B）。雙相支架組的標本切片可見新生類軟骨樣組織，以扁平細胞為主，纖維結構疏松，呈層狀排列；而多孔鉭的孔隙幾乎全部被新生的類骨質所填充，類軟骨樣組織與多孔鉭之間無明顯的界限（圖4C）。單純骨軟骨缺損組造模后16周水平切片顯示膜內骨化過程以及在骨缺損位點的邊緣處有少量的新生骨細胞，但缺損區(qū)的主要是被大量的纖維結締組織所填充；軟骨缺損區(qū)凹陷，為薄層纖維組織覆蓋，與修復組織連接處的關節(jié)軟骨可見縱行裂隙（圖4D）。正常關節(jié)軟骨呈白色，半透明，光滑且有光澤（圖4E）。

圖2 掃描電鏡下膠原膜/國產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架的特征

圖3 不同植入物植入骨軟骨缺損實驗動物16周后股骨頭的大體表現(xiàn)

表1 各組術后大體評分及組織學評分比較（n=8，）

表1 各組術后大體評分及組織學評分比較（n=8，）

注：△與單純骨軟骨缺損組比較，P＜0.05；▲與雙相支架組比較，P＜0.05；○與單純膠原膜組、單純骨缺損組比較，P＜0.05

單純膠原膜組、單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組以及雙相支架組的改良O'Driscoll評分均高于單純骨軟骨缺損組，雙相支架組的改良O'Driscoll評分均高于單純膠原膜組、單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組，且差異均有統(tǒng)計學意義；而單純膠原膜組與單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組改良O'Driscoll評分差異均無統(tǒng)計學意義。單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組、雙相支架組的新生骨組織均多于單純膠原膜組及單純骨軟骨缺損組，且差異均有統(tǒng)計學意義；而單純膠原膜組與單純骨軟骨缺損組、單純國產(chǎn)多孔鉭金屬組與雙相支架組的新生骨組織差異均無統(tǒng)計學意義（表1）。

圖4 不同植入物植入骨軟骨缺損實驗動物16周后股骨頭病理表現(xiàn)（VG染色）

3 討論

臨床上針對骨軟骨聯(lián)合病變往往只能單純修復缺損骨。對于軟骨缺損幾乎沒有修復，尤其在骨軟骨缺損較深時。較大的骨軟骨缺損修復存在更大的挑戰(zhàn)，目前尚無“金標準”技術存在。軟骨缺損的臨床治療效果均不盡如人意。目前組織工程領域出現(xiàn)了很多材料。由于膠原、硫酸軟骨素及糖胺聚糖都是軟骨的天然組成成分，所以這些材料一直是研究的熱點[13]。Getgood等[14]使用了新的膠原蛋白-糖胺聚糖-鈣磷酸雙相支架可早期修復外科手術在山羊中造成的骨軟骨缺損模型。他們發(fā)現(xiàn)生物材料的成分膠原蛋白-糖胺聚糖可以提供更有利于軟骨修復的環(huán)境。Sanjurjo-Rodríguez等[15]在Ⅰ型膠原/Ⅱ型膠原/肝素支架上培養(yǎng)的人骨髓間充質干細胞的體外模型中，發(fā)現(xiàn)其修復人類軟骨病變總體評估較其他支架更高。商品化的膠原膜主要應用于骨質增高之后及支持軟骨組織形成，比如牙槽重建或者腭裂修補術等[16,17]。但是關于將這種膠原膜用在大型動物體內修復大面積軟骨缺損的報道幾乎沒有。本組體內實驗結果顯示，膠原膜可以促進山羊軟骨新生，或許未來可以應用在大面積軟骨缺損后修復的臨床領域。

眾所周知，理想的人工骨材料應與松質骨微結構相似，具有良好的生物相容性和多孔相通性，為支持血管和神經(jīng)的生長、營養(yǎng)物質的輸送提供空間，誘導骨長入[18-20]。多孔支架的孔隙率和孔徑大小是決定植入成功與否的重要因素[21]。研究發(fā)現(xiàn)，孔徑為50～400 μm 的多孔材料最有利于人體的新骨生長[22]。本研究制備的多孔鉭金屬孔徑為200～500 μm，開孔率為75%～85%，孔徑大小與松質骨十分接近。擁有足夠的機械強度的同時，彈性模量介于皮質骨與松質骨的彈性模量之間，這使材料植入后的應力阻擋作用幾乎可以忽略，從而有利于骨骼重塑形。Stiehler 等[23]發(fā)現(xiàn)人類間充質干細胞培養(yǎng)在鉭片上有很好的骨誘導特性。另外有研究發(fā)現(xiàn)實心鉭對人類成骨細胞的黏附、生長及功能分化有利[24]。本課題組前期研究結果顯示，本組制備的多孔鉭金屬孔隙率高達80%以上，孔徑大小與松質骨十分接近。本組制作的以多孔碳為支架的多孔鉭植入物和宿主機體之間產(chǎn)生一個穩(wěn)定而理想的連接與整合[25-27]。體內命運是最終形成骨軟骨重要的評價標準。Mrosek等[28]發(fā)現(xiàn)多孔鉭金屬復合骨膜可以促進骨小梁滲入軟骨下骨。本組體內實驗結果顯示，植入16周后，雙相支架成功修復了幾乎半個股骨頭的骨軟骨缺損。證實這種雙相支架對于修復山羊負重區(qū)大面積骨軟骨缺損較為有效。

骨軟骨聯(lián)合缺損包含關節(jié)軟骨損傷以及軟骨下骨的損傷。為了修復骨軟骨缺損，軟骨、骨以及兩者之間的界面必須均被考慮到[29]。如何將兩相支架進行固定成為生物材料修復骨軟骨缺損關鍵性的挑戰(zhàn)。臨床結果證明縫合和膠合固定兩種方法比較有效。使用可吸收縫合線進行縫合被證明是可行的，但是在負重區(qū)該方法效果不好[30]。組織膠，如纖維蛋白封閉劑和氰基丙烯酸酯膠，已被證明在支架固定中有效。因此，這種方法被推薦用于多相支架在大缺陷中的固定。本實驗采用商品化的纖維蛋白黏合劑將膠原膜及自主研發(fā)的多孔鉭金屬進行界面結合，結果顯示結合面均勻、平滑，黏合牢固，具有較好的界面結合強度和剪切強度。本實驗證明，纖維蛋白黏合劑可以用于負重區(qū)大面積缺損時的骨與軟骨界面的結合。

機械性人工關節(jié)的應用現(xiàn)狀需要改進。在實驗室形成仿生關節(jié)一直是骨組織工程的前沿性發(fā)展方向。本研究對于在負重區(qū)的大面積骨軟骨缺損的成功修復顯示了臨床轉化的潛能，為大面積骨軟骨聯(lián)合病變的臨床治療提供新的組織工程策略。未來應評估膠原膜/國產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架在大動物負重區(qū)生理功能及機械性能更長時間隨訪結果。