張夢(mèng)佳 董誠(chéng)明 朱畇昊

摘 要： 為探究夏枯草中GGPPS基因的生物學(xué)特性及功能，該文在夏枯草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性引物，采用逆轉(zhuǎn)錄 PCR 技術(shù)獲得夏枯草中GGPPS基因的全長(zhǎng)核苷酸序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;采用 qPCR 法分析PvGGPPS基因在不同外源性物質(zhì)誘導(dǎo)下在夏枯草果穗中的表達(dá)量以及該基因在夏枯草不同組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明：PvGGPPS基因開(kāi)放閱讀框1 092 bp，編碼363個(gè)氨基酸，理論分子量為38 815.68 D，等電點(diǎn)為5.69。PvGGPPS蛋白具有異戊烯基焦磷酸合酶家族的特征結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明PvGGPPS蛋白與丹參、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有較高的親緣關(guān)系。qPCR分析表明，PvGGPPS基因在葉中表達(dá)量高于果穗及莖。對(duì)果穗施加7種外源性物質(zhì)處理24 h后，GA3 處理組該基因表達(dá)量升高。PvGGPPS基因在夏枯草不同組織中表達(dá)量差異較大，且受外源物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究PvGGPPS基因?qū)ο目莶葺祁惓煞趾铣赏緩街械墓δ芗氨磉_(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 夏枯草， PvGGPPS， 基因克隆， 誘導(dǎo)表達(dá)， 表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： Q943 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2020）06-0882-09

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID） ：

Abstract： In order to explore the biological characteristics and functions of GGPPS gene in Prunella vulgaris， the specific primers were designed based on the sequencing of P. vulgaris transcriptome. The full-length nucleotide sequence of GGPPS gene was obtained in P. vulgaris by reverse transcription PCR technology， and the bioinformatics analysis was done. qPCR was used to analyze the expression of PvGGPPS gene in ear induced by different exogenous substances and in different organs in P. vulgaris. The results showed that the PvGGPPS gene had an open reading frame of 1 092 bp and encoded 363 amino acids， with a theoretical molecular weight of 38 815.68 D and an isoelectric point of 5.69. PvGGPPS protein had the characteristic domain of isopentenyl pyrophosphate synthase family. Phylogenetic tree showed that PvGGPPS protein was closely related to Salvia miltiorrhiza and Coleus forskohlii GGPPS protein. qPCR analysis showed that the expression of PvGGPPS gene in leaves was higher than that in ears and stems. The expression level of PvGGPPS gene was increased in the ear after GA3 treatment for 24 h， one of seven exogenous substances treated. The expression of PvGGPPS gene in different tissues of Prunella vulgaris was quite different and was induced by exogenous substances treatment. The results of this study lay a foundation for further study on the function and expression regulation of PvGGPPS gene in the synthesis pathway of terpenoids from P. vulgaris.

Key words： Prunella vulgaris， PvGGPPS， gene cloning， induced expression， expression analysis

夏枯草（Prunella vulgaris）為唇形科植物夏枯草的干燥成熟果穗，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清肝明目、消腫散結(jié)的功效（《中華人民共和國(guó)藥典》，2015），廣泛分布于全國(guó)各地。夏枯草中含有三萜類、黃酮類、有機(jī)酸類、香豆素類、甾體類等多種化學(xué)成分（汪曉河等，2019）。夏枯草中次生代謝成分齊墩果酸和熊果酸具有明顯的消炎、抗腫瘤和抗HIV等藥理作用（張金華等，2018），應(yīng)用前景巨大。夏枯草作為藥食兩用之品，具有重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，尤其是作為涼茶原材料的需求量巨大，使得夏枯草市場(chǎng)需求量呈增加態(tài)勢(shì)，夏枯草資源逐漸變得緊張。快速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法為基因的鑒定和功能分析提供了更多的途徑，吸引著越來(lái)越多的研究者把目光投入到分子領(lǐng)域。然而，目前已有的夏枯草分子水平相關(guān)研究還不夠全面和準(zhǔn)確，夏枯草分子相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)也不夠完善。

香葉基香葉基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS），是植物萜類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶之一（唐美瓊等，2017;方潔，2017）。目前已經(jīng)在擬南芥、丹參、地黃等多種植物中克隆到GGPPS基因（化文平，2008;Li et al.，2015;趙樂(lè)等，2017;張藝丹，2018）。GGPPS在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，GGPPS通過(guò)催化三分子IPP和一分子DMAPP反應(yīng)生成GGPP。GGPP不僅是二萜類物質(zhì)的前體物，還是類胡蘿卜素、葉綠素、生育酚、脫落酸、赤霉素等物質(zhì)的共同前體物，是植物多條重要次生代謝通路的節(jié)點(diǎn)（韓立敏，2015;梁敏華等，2018）。本研究在前期獲得的夏枯草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，克隆得到夏枯草GGPPS基因，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的分析探討GGPPS基因?qū)ο目莶葜休祁惓煞趾铣傻挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

夏枯草樣品采自河南省確山縣夏枯草GAP種植基地，由河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為夏枯草（Prunella vulgaris）。

總RNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），熒光定量試劑盒（QIAGEN），DNA Marker（TaKaRa公司），PCR產(chǎn)物回收試劑盒（上海生工），PCR儀（美國(guó) Bio-Rad 公司C1000 Touch ThermalCycler），熒光定量PCR儀（美國(guó) Applied Biosystems公司 Step One Plus）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取與cDNA第一條鏈的合成 利用康為試劑植物總RNA 提取試劑盒提取夏枯草不同組織的總RNA，1% 瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性。cDNA 的合成步驟按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA置于-20 ℃ 備用。

1.2.2 cDNA全長(zhǎng)克隆 根據(jù)夏枯草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋信息，選取表達(dá)豐度（FPKM）較高、E-value值較低且序列長(zhǎng)度完整的GGPPS基因的核苷酸序列，利用Primer Premer 5.0軟件設(shè)計(jì)GGPPS基因的特異性引物。

以夏枯草葉片cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增：cDNA 2.0 μL，2 × Es Taq mix 10 μL，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，dd H2O 6 μL至體積為20.0 μL。反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min（朱畇昊等，2016）。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增的目的條帶切膠回收純化，并連接到pMD19-T載體上，藍(lán)白斑篩選，菌落經(jīng)PCR檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。夏枯草中GGPPS基因的特異性引物見(jiàn)表1。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用多種在線工具對(duì)夏枯草中GGPPS基因及編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用ORF finder在線軟件分析開(kāi)放閱讀框;運(yùn)用DNAMAN軟件翻譯目的基因氨基酸序列，比對(duì)同源蛋白的序列;利用ExPASy Proteomics Server Protparam在線軟件分析目的蛋白的理化性質(zhì);在線軟件SinalP4.1 Server用于預(yù)測(cè)信號(hào)肽;運(yùn)用軟件SMART分析目的蛋白功能域。在線軟件NPSA server和Swiss-Model分別用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu);運(yùn)用在線工具BaCeIlo和ChloroP預(yù)測(cè)細(xì)胞定位和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)。運(yùn)用MEGA 7軟件對(duì)目的基因及同源基因的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.4 夏枯草GGPPS基因的表達(dá)特性分析 采集新鮮的夏枯草葉片、果穗和莖，用自來(lái)水清洗干凈，濾紙吸干水分，置液氮中冷凍后，放-80 ℃超低溫冰箱備用。在夏枯草生長(zhǎng)旺盛的時(shí)期（6月份），對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)一致的夏枯草果穗進(jìn)行處理，分別噴灑50 μmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）、17.14 μmol·L-1吲哚乙酸（IAA）、100 μmol·L-1乙烯利（ETH）、100 μmol·L-1硝普鈉（SNP）、1 mmol·L-1無(wú)水氯化鈣、10 μmol·L-1水楊酸（SA）、2.88 μmol·L-1赤霉素（GA3）。以噴灑前（0 h）的果穗為對(duì)照，24 h后采集處理組樣品。

對(duì)夏枯草果穗、莖、葉及噴施7種外源物質(zhì)的果穗中GGPPS基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR） 檢測(cè)，qPCR檢測(cè)的反應(yīng)體系：2× SYBR Green PCR Master Mix10 μL，QN Rox Reference Dye 0.1 μL，正反向引物均為0.4 μL，模板cDNA 2 μL，RNase-Free Water 7.1 μL至終體積為20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性20 s后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（95 ℃，1 s;56 ℃，20 s;95 ℃，1 s），60 ℃，20 s;95 ℃，1 s。夏枯草actin基因作為內(nèi)參，擴(kuò)增完成后進(jìn)行溶解曲線測(cè)定，2-ΔΔCt法分析GGPPS相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 夏枯草GGPPS基因的cDNA全長(zhǎng)克隆

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)夏枯草GGPPS基因約為1 100 bp，經(jīng)克隆測(cè)序后序列使用ORF Finder預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框，克隆所得序列含有1個(gè)1 092 bp的完整開(kāi)放閱讀框，命名為PvGGPPS，NCBI基因登陸號(hào)為MK993565。夏枯草GGPPS基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 夏枯草GGPPS蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 夏枯草GGPPS蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè) PvGGPPS蛋白預(yù)測(cè)編碼363個(gè)氨基酸，理論分子量為38 815.68 D，等電點(diǎn)為5.69，帶負(fù)電的氨基酸殘基（Asp + Glu）有 44個(gè)，帶正電的氨基酸殘基（Arg + Lys）有37個(gè)，推測(cè)其為酸性蛋白;根據(jù)其不穩(wěn)定系數(shù)為39.06，推測(cè)其為穩(wěn)定蛋白（表2）。

2.2.2 夏枯草GGPPS蛋白的亞細(xì)胞定位和功能域分析 通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析（表3），發(fā)現(xiàn)PvGGPPS蛋白定位在葉綠體中。利用SMART在線軟件對(duì)PvGGPPS蛋白進(jìn)行功能域預(yù)測(cè)，圖2結(jié)果顯示：PvGGPPS蛋白具有異戊烯基焦磷酸合酶家族的特征結(jié)構(gòu)域polyprenyl_synt，位于第101位到第357位。

2.2.3 夏枯草GGPPS蛋白的疏水性、跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 對(duì)PvGGPPS蛋白進(jìn)行疏水性預(yù)測(cè)，由圖3的預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出該蛋白疏水氨基的數(shù)量大于親水氨基酸的數(shù)量，可推測(cè)其為疏水性蛋白。PvGGPPS蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白有2個(gè)跨膜螺旋區(qū)，位置分別為從176位到195位;從250位到266位（圖4）。

2.2.4 夏枯草GGPPS蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用在線軟件對(duì)PvGGPPS蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明該蛋白是由54.27%的α-螺旋、14.05%的延伸鏈、5.51%的β-轉(zhuǎn)角和26.17%的不規(guī)則卷曲組成混合型蛋白。利用Swiss-Model在線軟件預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，得到的預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示PvGGPPS蛋白與擬南芥中AtGGPPS11蛋白（5e8l.1）的相似度為75.25%。

2.2.5 夏枯草GGPPS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和多序列比對(duì) 通過(guò)BLAST序列比對(duì)，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載丹參（Salvia miltiorrhiza）、毛喉鞘蕊花（Plectranthus barbatus）、芝麻（Sesamum indicum）、米團(tuán)花（Leucosceptrum canum）、野甘草（Scoparia dulcis）、銹毛旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum）、紫花風(fēng)鈴（Handroanthus impetiginosus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、皺葉菸草（Nicotiana tomentosiformis）、煙草（Nicotiana attenuata）、大腸桿菌（Escherichia coli）、曼地亞紅豆杉（Taxusx media）、銀杏（Ginkgo biloba）、玉米（Zea mays）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、鐵皮石斛（Dendrobium officinale）、馬尾松（Pinus massoniana）、水稻（Oryza sativa）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）、湖生紅球藻（Haematococcus lacustris）、鈍頂螺旋藻（Arthrospira platensis）的GGPPS蛋白的氨基酸序列與PvGGPPS蛋白的氨基酸序列通過(guò)MEGA 7軟件采用鄰近法（N-J法，bootstarp值設(shè)為1 000，其余為默認(rèn)條件）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并選取部分植物的氨基酸序列利用DNNMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖6），可以看出PvGGPPS蛋白與丹參、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有較高的親緣關(guān)系，進(jìn)化關(guān)系具有較高的保守性;與雙子葉植物進(jìn)化關(guān)系較近， 與菌類、蘚類、藻類、裸子植物、單子葉植物的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。多序列比對(duì)顯示PvGGPPS與6個(gè)物種間蛋白質(zhì)氨基酸序列一致性達(dá)87.03%，序列中存在異戊烯基焦磷酸合酶家族的兩個(gè)富含天冬氨酸的特征性序列：DDxxxxD和DDxxD（王中等，2018），分別為位于第157到第164位的“DDLPCMD”和第296到第300位的“DDILD”，起到底物結(jié)合與碳鏈延伸的功能;且含有1個(gè)CxxxC基序（D為天冬氨酸殘基，C為半胱氨酸，x 為任意氨基酸殘基）（圖7）。

2.3 夏枯草GGPPS基因表達(dá)分析

利用qPCR方法檢測(cè)PvGGPPS基因在夏枯草果穗、葉和莖中的表達(dá)量，以果穗為參照。結(jié)果顯示PvGGPPS基因在3個(gè)樣本中均有不同程度的表達(dá)量;在葉中高表達(dá)，其次是莖，在果穗中的表達(dá)量最少。PvGGPPS基因在葉中的相對(duì)表達(dá)量是在果穗中的95.39倍。PvGGPPS基因表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致（圖8）。

通過(guò)外源施加7種外源物質(zhì)來(lái)評(píng)價(jià)這些信號(hào)物質(zhì)對(duì)夏枯草PvGGPPS基因表達(dá)的影響。在7種外源物質(zhì)處理24 h后，可以看到GA3處理下PvGGPPS基因的表達(dá)量顯著上調(diào);SNP、MeJA、IAA、乙烯利和CaCl2處理在24 h時(shí)對(duì)該基因表達(dá)量均表現(xiàn)為明顯下調(diào)。

3 討論與結(jié)論

在多種植物GGPPS基因的研究中發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)模式在不同植物間有明顯的組織差異性（孫君等，2016;薛生玲等，2018;Wang et al.，2019）。本研究結(jié)果顯示PvGGPPS基因在夏枯草的果穗、莖、葉3個(gè)樣本中均有不同程度的表達(dá)量，在葉中高表達(dá)，其次是莖，在果穗中的表達(dá)量最少。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)PvGGPPS蛋白預(yù)測(cè)定位在葉綠體中。我們推測(cè)PvGGPPS可能主要與夏枯草葉片中葉綠素、赤霉素等的合成有關(guān)。在趙樂(lè)等（2016）的研究中發(fā)現(xiàn)地黃中的RgGGPPS1基因定位在葉綠體中，在根中的表達(dá)量最高，可能參與地黃中葉綠素等次生代謝產(chǎn)物的合成。這與本文研究結(jié)果相一致。

GGPPS基因易受植物激素誘導(dǎo)表達(dá)為其明顯的表達(dá)共性。丹參中的GGPPS基因可能受到水楊酸的誘導(dǎo)表達(dá)，卻被茉莉酸甲酯抑制表達(dá)（Kai et al.，2010）。在錢丹等（2013）的研究中發(fā)現(xiàn)不同誘導(dǎo)子處理后海南粗榧葉片中GGPPS基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，其中以MeJA誘導(dǎo)的效果最好。在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)GA3處理下PvGGPPS基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。多項(xiàng)研究表明外源激素對(duì)植物的生長(zhǎng)及某些基因的表達(dá)有一定影響（常青山等，2017;潘君飛等，2018;李璐等，2019），其中赤霉素（ GA3 ） 是一種調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的雙萜植物激素（王燦，2018）。鄭偉等（2019）的研究發(fā)現(xiàn)在太子參中三個(gè)GH3基因的表達(dá)均受外源GA3誘導(dǎo)，且GA3能夠誘導(dǎo)太子參發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源 IAA 的積累。張晨等（2018）研究發(fā)現(xiàn)在太子參塊根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中GA3 可通過(guò)影響 JA 從而促進(jìn)皂苷的積累。因此，我們推測(cè)GA3能誘導(dǎo)夏枯草萜類生物合成途徑中部分關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。本研究豐富了GGPPS基因的種類，為后期的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，夏枯草中的PvGGPPS基因主要在葉中高表達(dá)且受外源GA3的調(diào)控， 并首次對(duì)夏枯草中的GGPPS基因進(jìn)行研究，豐富了GGPPS基因家族的種類。但是對(duì)于PvGGPPS基前面序列號(hào)為NCBI登錄號(hào)。

因參與具體哪一類成分的調(diào)節(jié)及該基因?qū)ο目莶葜腥祁惓煞趾铣傻挠绊懩壳吧胁磺宄?，還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 何永艷）