陳星星 夏瑩 黃龍全 張劍韻

摘 要： 茶樹中富含茶氨酸、兒茶素和咖啡堿等重要功能成分，具有較高的價值功效，茶樹在生命周期中經(jīng)常遭受逆境脅迫，維生素B6（VB6）在植物體內(nèi)參與逆境應(yīng)答，吡哆醛激酶（pyridoxal kinase，PLK）是VB6補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵酶。為進(jìn)一步了解PLK在茶樹生物合成中的功能和作用機(jī)理，該研究基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫，以龍井43為材料，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的方法從茶樹中克隆出CsPLK的基因。結(jié)果表明：該基因序列長為1 179 bp，編碼393個氨基酸;CsPLK蛋白和已知物種中PLK蛋白具有較高的同源性，都是核糖激酶超家族成員;通過構(gòu)建pET-CsPLK載體進(jìn)行原核表達(dá)，并鑒定出重組蛋白有很強(qiáng)的催化活性;組織表達(dá)特異性分析表明，葉中的表達(dá)量比莖、根的高，在根中最低;熒光定量PCR表示，低溫誘導(dǎo)CsPLK上調(diào)表達(dá)，干旱誘導(dǎo)CsPLK下調(diào)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因在茶樹中有明顯的逆境應(yīng)答，推測CsPLK在茶樹的生長發(fā)育、逆境脅迫發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 茶樹， 基因鑒定， 逆境脅迫， 組織特異性

中圖分類號： S571.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）06-0873-09

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID） ：

Abstract： Tea plant is rich in important functional ingredients such as theanine， catechin and caffeine， with high value and efficacy. Tea plants are often subjected to stress in their life cycle， and VB6 is involved in the stress response in plants， Pyridoxal kinase （PLK） is a key enzyme in the vitamin B6 （VB6） salvage pathway. In order to further understand the function and mechanism of PLK in tea plant biosynthesis， this study based on the tea plant genome database， and using longjing 43 as material， the CsPLK gene was cloned from tea plant by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The results were as follows： The sequence of CsPLK was 1 179 bp in length， encoding 393 amino acids; CsPLK protein and PLK protein of known species had high homology， both were members of the ribokinase superfamily; The pET-CsPLK vector was constructed for prokaryotic expression， and the recombinant protein was identified to have strong catalytic activity， indicating that the gene cloned from tea tree is PL kinase; Tissue expression specificity analysis showed that the expression level in leaves was higher than that in stems and roots， and the lowest in roots; Real-time PCR showed that CsPLK was up-regulated expressed by low temperature and CsPLK was down-regulated by drought. This study reveals that CsPLK had an obvious stress response in tea plants， suggesting that CsPLK played an important role in the growth and development of tea plants and the stress resistance.

Key words： tea plant， gene identification， abiotic stress， tissue specificity

維生素B6（VB6）是一類可以相互轉(zhuǎn)換的吡啶類化合物的總稱，包括吡哆醇（pyridoxine，PN）、吡哆胺（pyridoxamine，PM）、吡哆醛（pyridoxal，PL）以及它們相應(yīng)的磷酸酯形式：磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5-phosphate，PNP）、磷酸吡哆胺（Pyridoxamine-5-phosphate，PMP）和磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5-phosphate，PLP）。其中PLP是140多種酶的輔酶，涉及廣泛的代謝和調(diào)節(jié)過程（Schulman & Richert，1957;Smolin & Benevenga，1982;Amadasi et al.， 2007）。植物是VB6自養(yǎng)型生物，擁有“DXP非依賴途徑”（DXP independent pathway），以谷氨酰胺、5-磷酸-核糖（或5-磷酸-核酮糖）和3-磷酸-甘油醛（或磷酸二羥丙酮）為底物，在PDX1和PDX2構(gòu)成的PLP合酶復(fù)合體的作用下，直接從頭合成（de novo synthetic）PLP（Julliard & Douce，1991;Franco et al.， 2001）。除了VB6的從頭合成，植物體內(nèi)還存在VB6補(bǔ)救途徑（salvage pathway）（Tanaka et al.， 2005），該途徑通過一系列酶的作用，實(shí)現(xiàn)不同VB6的相互轉(zhuǎn)化和PLP的補(bǔ)救合成，以及維持VB6狀態(tài)的穩(wěn)定。PL激酶（PL kinase，PLK）是PLP的補(bǔ)救合成途徑重要的一種酶，PLK在金屬陽離子和ATP的存在下催化PL的磷酸化生成PLP?？蒲腥藛T陸續(xù)從擬南芥（Lum et al.， 2002）、小麥（Huabo et al.， 2004）和油菜（Yu & Luo，2010）克隆出PL激酶基因，開啟了從植物中研究PLK基因的熱潮。

茶樹（Camellia sinensis）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，富含茶氨酸、兒茶素和咖啡堿等重要功能成分。VB6不僅在茶樹的初生代謝和功能成分的生物合成過程中發(fā)揮重要作用，同時VB6在植物體內(nèi)參與逆境應(yīng)答，但目前關(guān)于茶樹中VB6生物合成鮮有報道。因此，研究茶樹中VB6補(bǔ)救途徑中的PL激酶在茶樹生長發(fā)育和逆境調(diào)控中的作用具有重要意義。本研究以茶樹龍井43的cDNA為模板克隆出PL激酶基因，通過原核表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證，并分析不同組織中的基因表達(dá)差異，同時設(shè)置干旱和低溫脅迫分析CsPLK的逆境應(yīng)答，為利用VB6代謝調(diào)控提高茶葉品質(zhì)和增強(qiáng)茶樹抗性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 茶樹CsPLK的克隆與分析

所用材料為龍井43茶樹幼苗，種植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)分析平臺。

使用全能型植物RNA提取試劑盒（康維世紀(jì)），提取茶樹葉片、根和莖的總RNA，用Nanodrop ND 1 000檢測RNA的濃度與純度，1.0%凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量。用HifiScript cDNA合成試劑盒（康維世紀(jì)）對上述總RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

以擬南芥PLK序列為模板，從中國科學(xué)院昆明植物研究所茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中，通過比對獲得候選序列并設(shè)計(jì)特異性引物，由安徽通用生物公司合成。上游引物：gGAATTCATGTCCGAGAAATTGACA;下游引物：gcTCTAGATTAGTTGTATCTCTCAGCC。下劃線部分為EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)。

以上述cDNA為模板，建立擴(kuò)增體系：Primer Star MIX 酶（TaKaRa 公司）12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、cDNA模板1 μL 、上下游引物各1 μL。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，分離回收正確的PCR 產(chǎn)物連接載體pEasy-blunt（北京全式金生物有限公司），并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，命名為pPLK，送至通用生物公司進(jìn)行測序。

使用ExPASy網(wǎng)站的在線分析工具（http：//web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_ tool）分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn);使用DNAMAN進(jìn)行序列比對分析。

1.2 CsPLK表達(dá)載體構(gòu)建和功能鑒定

使用柱式質(zhì)粒DNA提取試劑盒（Sangon Biotech）提取轉(zhuǎn)化了CsPLK基因的pPLK菌株的質(zhì)粒和pET-22b（+）載體質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I（TAKARA）于37 ℃分別進(jìn)行雙酶切3 h，使用膠回收試劑盒（Sangon Biotech）回收雙酶切之后的目的片段和載體片段，利用T4 DNA連接酶（TAKARA），于16 ℃連接16 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans T1大腸桿菌中，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后送至通用生物公司進(jìn)行測序。

提取連接上CsPLK基因的pET-22b（+）菌株質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）（TransGen）表達(dá)菌株中，涂板過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，選擇驗(yàn)證正確的菌落加入0.2 mmol·L-1 IPTG，在16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h→4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min→棄去上清，加入PBS重懸→超聲波細(xì)胞破碎儀，5 s、3 s、破碎99次→4 ℃、12 000 ×g離心10 min，所得上清液即為粗酶液。將含有重組質(zhì)粒pET-PLK的粗酶液命名為Pro-CsPLK，含有空質(zhì)粒pET-22b的粗酶液命名為Pro-22b。

采用Lum et al.（2002）的方法，略做改動后測定CsPLK酶活性，反應(yīng)體系3 mL。向含有0.2 mmol·L-1 PL、0.2 mmol·L-1 ATP和0.1 mmol·L-1 ZnCl2的70 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）中，加入含0.5 mg Pro-CsPLK蛋白，37 ℃水浴反應(yīng)30 min。添加高氯酸終止反應(yīng)后12 000 ×g離心10 min，在上清中加入苯肼溶液并定容到3 mL。2.5 min時在410 nm處測定其吸光值為X，同時加入粗酶液和高氯酸的反應(yīng)管中測定吸光值為Y，（X-Y）為每一組樣品的最終吸光值。以Pro-22b代替Pro-CsPLK，其余條件相同，作為空白對照。

1.3 茶樹CsPLK表達(dá)模式分析

以生長健壯、長勢一致的1年生龍井43為材料，取生長在（25±1） ℃、含水率為（55±3）%的茶樹幼苗的的嫩根、嫩莖、頂端第2至第3片成熟葉進(jìn)行組織表達(dá)差異性分析。參照Liu（2015）和Lin et al.（2016）的方法進(jìn)行低溫（4 ℃）和干旱處理。調(diào)節(jié)人工氣候室的溫度使之維持在（4±1） ℃，實(shí)驗(yàn)組與對照組均為生長在溫室（25±1） ℃中的茶樹幼苗。對照組保持溫室（25±1） ℃生長不變，實(shí)驗(yàn)組中的茶苗迅速移入低溫氣候室（4 ℃）中，其他環(huán)境條件保持不變，進(jìn)行低溫處理，分別在2、8、12、24、48 h時取茶苗上枝條頂端第2至第3片成熟葉為材料;將茶樹幼苗放置在（25±1） ℃的人工氣候室中，實(shí)驗(yàn)組與對照組土壤含水率為（55±3）%，對照組澆水使土壤含水率維持在（55±3）%，實(shí)驗(yàn)組停止?jié)菜?，其他環(huán)境條件保持一致，進(jìn)行干旱處理，分別在6、12 d時取樣（頂端第2至第3片成熟葉）后，給實(shí)驗(yàn)組澆水使其土壤含水率恢復(fù)至（55±3）%，在恢復(fù)6 d時取樣（頂端第2至第3片成熟葉），用于檢測CsPLK在干旱脅迫后復(fù)水過程的表達(dá)模式。每個處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。所有樣品液氮速凍后保存于-80 ℃，提取RNA，檢測CsPLK的表達(dá)模式。

采用熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR）測定CsPLK的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參基因。CsPLK的上游引物為AAGGTTGTCCCTGTTG，下游引物為TTGTGGGTGACGAATA。GAPDH的上游引物為TTGGCATCGTTGAGGGTCT，下游引物為CAGTGGGAACACGGAAAGC。

使用UltraSYBR Mixture熒光定量試劑盒（康維世紀(jì)）進(jìn)行熒光定量PCR，30 μL反應(yīng)體系由2×ULtraSYBR 15 μL、正向引物1.5 μL、反向引物1.5 μL、cDNA模板1.5 μL、ddH2O 10.5 μL構(gòu)成，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，30個循環(huán)。3次技術(shù)重復(fù)，用2-ΔΔCT法計(jì)算結(jié)果。對照組和處理組之間的差異顯著性采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析：*表示0.01≤P<0.05 ，* *表示P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsPLK基因的克隆

以擬南芥PLK的基因序列（NM_001344222）為模板，在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫搜索比對得到一條相似性最高（57.86%），且含有完整編碼框的基因序列。在NCBI分析該段序列發(fā)現(xiàn)第37至第343位氨基酸是吡哆醛激酶功能域，屬于核糖激酶超家族。隨后設(shè)計(jì)克隆引物，以茶樹總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模版，PCR擴(kuò)增得到一條清晰明亮的單一條帶，大小約為1 200 bp（圖1），測序正確后，將此序列命名為CsPLK，其編碼框長1 179 bp，編碼含有393個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的分子量為43.9 kDa，理論等電點(diǎn)6.51（圖2）。

2.2 茶樹CsPLK的序列分析

使用DNAMAN構(gòu)建CsPLK在原核表達(dá)中的圖譜（圖3）。將CsPLK與其他植物中的PLK進(jìn)行序列比對（圖4）。發(fā)現(xiàn)CsPLK與植物的PLK序列具有高度的一致性，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、M. DNA 標(biāo)記; 1. CsPLK。油菜（Brassica napus）、大豆（Glycine max）、煙草（Nicotiana tabacum）、小麥（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）PLK的一致性分別為77.39%、79.71%、76.23%、82.95%、71.30%和71.59%，有很高的親緣性。

2.3 CsPLK基因原核表達(dá)載體構(gòu)建

使用EcoR I和Xba I限制性內(nèi)切酶對含有目的基因的pPLK載體和pET-22b（+）載體進(jìn)行雙酶切（圖5）。使用T4連接酶16 ℃連接目的基因與載體片段，轉(zhuǎn)化至Trans T1大腸桿菌中，涂板過夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，可以看出目的基因成功連接至pET-22b（+）載體上（圖6）。

2.4 CsPLK蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

采用T7啟動子/T7 RNA聚合酶表達(dá)系統(tǒng)茶樹PLK、擬南芥PLK（26397694）、 油菜PLK（92111351）、大豆PLK（68131817）、煙草PLK（85068609）、小麥PLK（304561310）、玉米PLK（226502934）。圖中☆、◇表示兩種不同的活性位點(diǎn);紅色劃線部分為loopI、loop Ⅱ;黃色方框是GTGD基序。

pET-22b（+）-Rosetta（DE3）對CsPLK在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)。在IPTG的誘導(dǎo)下，插入T7啟動子后的編碼區(qū)能夠在表達(dá)菌株Rosetta（DE3）中被高效轉(zhuǎn)錄。原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳顯示，在45 kDa附近成功誘導(dǎo)出了目的蛋白，且在上清中大量表達(dá)，與預(yù)測蛋白大小一致（圖7）。

2.5 CsPLK的酶活測定及部分酶學(xué)性質(zhì)分析

以PL為底物，在pH 6.5和37 ℃條件下，對原核表達(dá)的重組茶樹PL激酶進(jìn)行功能鑒定。圖8結(jié)果顯示，pro-CsPLK的酶活力約為4.853 μmol PLP·mg-1·min-1，對照組pro-22b約為0.529 μmol PLP·mg-1·min-1，pro-CsPLK酶活力是對照的9.17倍。這表明CsPLK具有較強(qiáng)的PL激酶活性，原核表達(dá)的蛋白確為茶樹PLK蛋白。

PL激酶在金屬陽離子存在下才能催化反應(yīng)，pH值是影響酶活性的一個非常重要的因素，所以對PL激酶的最適的金屬離子及pH值進(jìn)行測定。顯示該酶的最適pH大約在6.4左右（圖9），Zn2+的催化活性最強(qiáng)（圖10）。

2.6 CsPLK的組織表達(dá)差異性分析

采取熒光定量PCR對茶樹根、嫩莖、嫩葉進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在茶樹葉片組織中CsPLK的表達(dá)量最高，莖和根中的表達(dá)量相似，約為葉片組織的1/4（圖11）。

2.7 逆境條件下CsPLK基因的表達(dá)情況

低溫脅迫處理48 h過程中，CsPLK表達(dá)先上升，在處理8 h時到達(dá)頂點(diǎn)后逐漸下調(diào)，但仍高于未處理前的水平（圖12：a）。干旱脅迫處理后，CsPLK表達(dá)量下降，第12天時表達(dá)量降到最低，復(fù)水后第6天表達(dá)量上升，且高于干旱處理前水平（圖12：b）。這表明CsPLK參與茶樹對低溫和干旱脅迫的響應(yīng)，但其在兩種脅迫下表達(dá)模式不同。

3 討論與結(jié)論

本研究利用已知的擬南芥PLK的基因序列為模板，在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中比對得到一條相似性最高（57.86%）的為候選茶樹PLK序列，其編碼的氨基酸序列含有一個典型的吡哆醛激酶功能域，屬于核糖激酶超家族的成員。利用PCR技術(shù)從茶樹龍井43中克隆出PLK基因，命名為CsPLK。多序列的同源比對結(jié)果表明，CsPLK與擬南芥、煙草、大豆等植物中的PLK氨基酸序列相似性達(dá)到70%以上，有很強(qiáng)的親緣性。CsPLK的Asp151、Tyr161、Gly313和陰離子孔基序GTGD（Gly313-Asp3171）與已經(jīng)證實(shí)的PLK的ATP結(jié)合位點(diǎn)完全一致，這幾個氨基酸殘基高度保守，三個ATP磷酸基團(tuán)通過由高度保守的序列基序GTGD和附近螺旋N末端形成的陰離子孔以及結(jié)合需要的金屬陽離子，促進(jìn)氫鍵與蛋白質(zhì)殘基互相作用，使PLK活性位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而提高PLK活性（Kim & Hong，2016）?？蒲腥藛T分別對牛（Neary & Diven，1970）、豬（Gao et al.， 1998）、羊（Maras et al.， 1999）和擬南芥（Lum et al.， 2002）的PLK進(jìn)行酶動力學(xué)研究時，得出Zn2+是PLK發(fā)揮活性作用的最適金屬離子，本研究通過對不同的二價金屬離子測定酶活性，發(fā)現(xiàn)活化效率依次是Zn2+> Co2+>Mn2+> Mg 2+> Ca2+，得出PL激酶在Zn2+存在下的催化活性最強(qiáng)，與前人結(jié)論一致。CsPLK的Ser 68、Thr 103、Tyr143和Asp317與已經(jīng)驗(yàn)證的與PL形成氫鍵相互作用的氨基酸殘基一致，這些氨基酸殘基也高度保守，決定底物特異性（Scholz & Kwok， 1989）。茶樹中的CsPLK和其他物種PLK一樣具有高度保守的與功能密切相關(guān)的loopI和loop Ⅱ結(jié)構(gòu)，CsPLK的loopI結(jié)構(gòu)為Gly155-Val162，與大多數(shù)植物和微生物長度一致，為8個氨基酸，而高等動物為12個氨基酸，loopI對防止ATP無效的水解，以及在保護(hù)和促進(jìn)底物結(jié)合方面有重要作用，至于不同物種中l(wèi)oopI的氨基酸不同，是否與生物進(jìn)化有關(guān)目前尚不清楚，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究;CsPLK的loop Ⅱ區(qū)域在植物中高度保守，與酶的底物特異性和底物親和力有關(guān)（Campobasso et al.， 2000;Cheng et al.， 2002）。

本研究通過構(gòu)建原核表達(dá)載體以及體外酶活測定，得出茶樹中的CsPLK在pH為6.4和金屬陽離子為Zn2+時有很強(qiáng)的催化活性，催化PL的磷酸化生成PLP，表明原核表達(dá)產(chǎn)物為CsPLK蛋白。通過對茶樹體內(nèi)CsPLK的組織差異性分析，發(fā)現(xiàn)在茶樹的葉、莖、根中均有表達(dá)，并且在葉片中表達(dá)量最高，推測可能與葉片中含有豐富的葉綠體有關(guān)。植物有VB6的從頭合成途徑， 利用DXP非依賴途徑直接合成PLP從而被細(xì)胞利用，合成的場所是細(xì)胞質(zhì)， 葉綠體中可能是通過PLP的補(bǔ)救a. 低溫脅迫; b.干旱脅迫。

途徑來合成PLP，而PL激酶是PLP補(bǔ)救途徑中的關(guān)建酶，所以PL激酶基因在茶樹葉片中的表達(dá)量比較高。

越來越多的研究說明植物PLK基因的表達(dá)受各種生物或非生物脅迫的影響，從而參與植物的逆境應(yīng)答，其中擬南芥中的PL激酶基因的表達(dá)在冷脅迫下顯著增加（Lum et al.， 2002），甘藍(lán)型油菜中的PL激酶的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)（Yu & Luo，2010），小麥中的PL激酶基因表達(dá)不受滲透脅迫的調(diào)節(jié)（Huabo et al.， 2004）。在本研究中，茶樹CsPLK基因受低溫脅迫后能夠快速誘導(dǎo)表達(dá)，即使在低溫處理的48 h后依然高于未處理前表達(dá)量;在干旱脅迫下主要表現(xiàn)為抑制，但復(fù)水后能夠快速誘導(dǎo)植物進(jìn)行響應(yīng)，且此期間的CsPLK具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，干旱后復(fù)水響應(yīng)也是植物抗旱機(jī)理研究中重要的內(nèi)容之一。以上結(jié)果表明，茶樹中CsPLK與低溫、干旱逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)，同時可以得出CsPLK在不同物種間的逆境應(yīng)答有明顯的差異性。

本研究對茶樹中VB6補(bǔ)救合成途徑中的CsPLK基因進(jìn)行了初步的鑒定與表達(dá)分析，得出CsPLK參與低溫和干旱逆境應(yīng)答，此研究結(jié)果為利用VB6代謝調(diào)控來提高茶樹抗性從而提高茶樹品質(zhì)的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)，也充實(shí)了植物抗性生理的研究。后續(xù)可通過克隆茶樹上VB6補(bǔ)救途徑的其他基因來全面研究VB6在茶樹逆境應(yīng)答中的作用。

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（責(zé)任編輯 何永艷）