霍雨艷 饒冬梅

摘 要

目的：構建在哺乳動物細胞中表達的-Omi/HtrA2基因融合表達載體，為后續(xù)研究Omi/HtrA2基因過表達對結腸癌細胞HT29的影響奠定基礎。方法：PCR擴增HtrA2基因編碼框，用KpnI和BamHI將TS- HtrA2及目的載體pEC3.1（+）兩步法雙酶切，然后進行連接轉化，構建基因重組載體radE5- HtrA2，包裝重組腺病毒，RT-PCR 檢測重組腺病毒基因mRNA的表達并提取蛋白進行Western blot 檢測。結果：重組真核表達載體radE5- HtrA2經限制性內切酶分析，雙酶切之后的條帶與理論值相符，測序結果未見堿基變異，提取轉染后細胞總蛋白進行Western blot 檢測，可測到目標條帶。結論：成功構建了基因重組載體radE5- HtrA2，并能在結腸癌細胞HT29中正常表達，為后續(xù)研究Omi/HtrA2基因功能奠定基礎。

關鍵詞

omi/HtrA2;結腸癌;重組質粒;轉染

中圖分類號： R735.35 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.16.084

0 前言

絲氨酸蛋白酶Omi又稱Htr A2，在機體各組織器官中普遍表達，并在細胞質和線粒體中與多種底物蛋白發(fā)生反應[1]。目前研究發(fā)現Omi/HtrA2與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，在腫瘤中高表達，其表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后關系密切[2]。Omii通過其IAP結合位點與IAPs的BIR域結合，以便使已結合caspase的BIR域釋放caspase，使其恢復活性而使細胞凋亡[3]。本研究通過構建Omi表達載體轉染入結腸癌細胞HT29中，檢測其表達情況，為后續(xù)研究該基因高表達對結腸癌細胞HT29的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 HT29細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)在DMEM（GibcoBRL）+10%滅活胎牛血清（FBS）（Gibco）+雙抗（青霉素100U/ml+鏈霉素100ug/ml）的培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2的培養(yǎng)條件，用25cm2的組織培養(yǎng)瓶單層培養(yǎng)，并定期用1%胰酶-EDTA溶液分離細胞進行傳代培養(yǎng)，傳代比例1：2～1：3。

1.2 實驗材料試劑與儀器設備

HT29細胞（佳木斯大學友情提供），DMEM（GibcoBRL），10%滅活胎牛血清（FBS）（Gibco），雙抗（Sigma），胰酶（Sigma），PBS（Sigma），熒光顯微鏡（OLYMPUS ），37℃細胞培養(yǎng)箱（SANYO），低速離心機（TD5A- WS式），Adenovirus Expression System重組腺病毒構建系統(tǒng)（genesil），T4 DNA Ligase及部分內切酶（NEB公司），部分內切酶（Takara），HEK 293（美國ATCC），質粒提取試劑盒（維特潔），PCR儀（ABI）。

1.3 HtrA2基因表達載體構建

1.3.1 PCR擴增HtrA2基因

引物對：HtrA2-f：5'-GG GGTACC acccctgacctccgg-3'K pnI ?HtrA2-r：5'-GG GATCC GGCAGCTCATTTTC--3'EcoRI，Product：Length=2006bp;模板：pX-CMV- HtrA2載體;循環(huán)參數：預變性94℃ 5min，變性94℃ 20s，退火58℃ 25s，延伸72℃ 2min 30 cycles，72℃ 3min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 連接PCR產物至T（中間過渡）載體

反應體系：Pmd-19T simple vector 0.5μl，HtrA2 （PCR產物） 4.5μl，Ligation Mixture 5μl，16℃，過夜。連接產物轉化至DH5α中，挑取克隆進行BamHI，KpnI雙酶切鑒定。

1.3.3 亞克隆HtrA2至穿梭載體pEC3.1（+）

用KpnI和BamHI將TS- HtrA2及目的載體pEC3.1（+）兩步法雙酶切，然后進行連接，連接產物命名為pEC3.1-HtrA2（見圖1），載體結構：---attL1—CMV—HtrA2—IRES---EGF P—stop---attL2-連接產物轉化至DH5α中，挑取克隆進行鑒定。

1.3.4 通過LR體外同源重組將HtrA2表達框轉移至pGSad eno（radE5）腺病毒（見圖2）表達載體上

（1）LR體外同源重組：將它命名為radE5- HtrA2。

（2）蛋白酶K消化重組酶，加入1μL蛋白酶K，37℃反應15min。

（3）將5μL上步反應產物轉化感受態(tài)細胞DH5а，涂布于含Ampr抗性（終濃度為100μg/ml）的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取3個單克隆菌落接種于50ml含Ampr抗性（終濃度為100ug/ml）的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床（250rpm）培養(yǎng)過夜。

（4）用中提試劑盒提取質粒，對提取的質粒進行酶切鑒定。

1.4 包裝重組腺病毒

（1）準備進行轉染的線性化腺病毒DNA

用PacI酶切重組腺病毒質粒;酚：氯仿：異戊醇抽提，乙醇沉淀。

（2）將PacI線性化的腺病毒DNA轉染HT29

（3）培養(yǎng)的HT29，出現明顯的CPE現象，且有>50%脫壁時即收細胞進行裂解收病毒，裂解上清感染HT29。

（4）放大培養(yǎng)重組腺病毒

當細胞有明顯的CPE現象，且有>50%脫壁時即收細胞進行裂解，收病毒于1 ml 無菌PBS中。

（5）腺病毒radE5-HTRA2感染HT29細胞

感染前一天接種6孔細胞培養(yǎng)板，第二天細胞量達到70%-80%密度;感染前將細胞更換培養(yǎng)基為無血清無雙抗的DMEM，將病毒放在冰盒上慢慢融化，按確定的最適體積加入細胞中，分別設MOI=0.1、MOI=1、MOI=10、MOI=100、MOI=500組輕輕混勻，5% CO2 ?37℃ Incubator中培養(yǎng)過夜。觀察感染病毒后熒光表達，計數熒光百分率，細胞分別在轉染后24h、72h、96h收集細胞樣品進行RT-PCR和Western blot檢測。

2 結果

2.1 PCR擴增HtrA2基因凝膠電泳結果

目的基因長度：2006bp，由下圖可見，擴增的基因為目的基因。（見圖1）

2.2 連接PCR產物至T載體進行酶切鑒定結果

由圖2看出克隆1，克隆2，克隆3均為正確條帶，小條帶大小為1Kbp，選取克隆1（TS-HtrA2）測序。測序結果顯示，擴增得到的HtrA2片段有一堿基突變，但不影響氨基酸序列，故可以此克隆進行后續(xù)實驗。

2.3 亞克隆HtrA2至穿梭載體pEC3.1（+）后酶切鑒定

BamH，KpnI雙酶切鑒定結果如下（見圖3）（應該切出一約2Kbp的條帶），圖片可見克?、佗诰鶠檎_克隆，命名為pEC3.1-HtrA2。

2.4 PI-SceI/I-CeuI雙酶切radE5-HtrA2電泳

通過LR體外同源重組將HtrA2表達框轉移至pGSadeno腺病毒表達載體（radE5）上，PI-SceI/I-CeuI雙酶切radE5-Htr A2電泳圖譜（見圖4），酶切分析：正確的克隆將切出一條3kb的小條帶，且大帶大于15kb（說明載體為腺病毒載體），由圖4可知目的克隆是正確的，質粒構建成功。

2.5 RT-PCR測定HtrA2重組腺病毒基因蛋白表達

逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定HtrA2重組腺病毒基因蛋白表達良好（見圖5）。

2.6 Western檢測HtrA2重組腺病毒基因蛋白表達

Western-blot 檢測rAdE5-HTRA2感染HT29細胞后蛋白表達良好（見圖6）。

3 討論

結腸癌是一種常見的惡性消化道疾病，近幾年在國內發(fā)病率逐年升高。結腸癌患者生存率偏低，治療效果及預后均較差，嚴重影響健康[4]。目前臨床上治療結腸癌主要以手術為主，早期可通過手術切除進行根治，但大部分結腸癌患者發(fā)現時已是晚期，常規(guī)手術無法根治，因此尋找新的治療手段具有重要意義[5-6]。結腸癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關，包括癌基因和抑癌基因的表達[7-9]。

絲氨酸蛋白酶Omi，隸屬于Htr A（High Temperature Req uirement A）家族，又稱Htr A2，在機體各組織器官中普遍表達，并在細胞質和線粒體中與多種底物蛋白發(fā)生反應。Omi/Htr A2作為促凋亡蛋白，可降解細胞內重要的凋亡抑制蛋白，進而導致細胞凋亡，Omi可通過與線粒體的抗凋亡蛋白HAX-1相互作用，使HAX-1降解，從而增加細胞對凋亡刺激的敏感性[10-12]，誘導細胞凋亡。本實驗通過體外構建Omi基因表達重組載體radE5- HtrA2，轉染入結腸癌細胞HT29中并能正常表達，為后續(xù)研究Omi/HtrA2基因過表達與腫瘤細胞凋亡的關系奠定基礎，為進一步動物實驗以及結腸癌的臨床治療提供基礎研究依據。

參考文獻

[1]Ding Y1，Wang B1，Chen X1，Zhou Y1，Ge J1 ?Staurosporine suppresses survival of HepG2 cancer cells through Omi/HtrA2-mediated inhibition of PI3K/Akt signaling pathway.Tumour Biol.2017 Mar;39（3）：1010428317694317.

[2]Wang K1，Yuan Y2，Liu X1，Lau WB2，Zuo L3，Wang X3，Ma L1，Jiao K1，Shang J1，Wang W1，Ma X1，2，4，Liu H1，4.Cardiac Specific Overexpression of Mitochondrial Omi/HtrA2 Induces Myocardial Apoptosis and Cardiac Dysfunction. Sci Rep.？2016 Dec 7;6：37927.

[3]Xu Z1，Chen Y1，Xu G1，Peng C2，Liu E2，Li Y2，Niu J2，Li C3.Omi/HtrA2 pro-apoptotic marker differs in various hepatocellular carcinoma cell lines owing to ped/pea-15 expression level. Oncol Rep.？2015 Feb;33（2）：905-12.

[4]張玥，石菊芳，黃慧瑤，等.中國人群結直腸癌疾病負擔分析[J].中華流行病學雜志，2015，36（7）;709-714.

[5]程雪，紀捷，張靜敏，等，Lgr5蛋白和Her-2蛋白在結腸癌中的表達及其臨床意義[J].現代醫(yī)學，2017，45（1）：17-22.

[6]王勇，傅贊，封益飛，等.腹腔鏡完整結腸系膜切除（CME）治療局部晚期右半結腸癌的臨床療效[J].中國地方病雜志，2016（11）：1302-1303.

[7]王千里.結腸癌組織NPRL2表達及其臨床意義研究[D].鄭州：鄭州大學，2014.

[8]耿樂樂，陳彥平.Omi/HtrA2 及其在惡性腫瘤中的研究進展[J].河北醫(yī)藥，2015，37（16）： 2507-2509.

[9]饒冬梅.Omi/HtrA2表達與腫瘤關系的研究進展[J].廣東醫(yī)學，2016，37（8）：1239-1242.

[10]鄭亞萍，劉春杰.Raf1基因重組腺病毒SIRNA載體構建及其對大鼠心肌細胞肥大的影響[J].中國比較學雜志，2016，26（4）：18-23.

[11]曾萍，楊簡，楊俊等.大鼠CD47 RNAi 腺病毒載體的構建與鑒定[J].臨床心血管病雜志，2019，33（9）：892-895.

[12]LUO T，LIU G，LONG M，et al.Treatment of cadmumrinduced renal oxidative damage in rats by admin-stration of alpha lipoic acid J.Environ Sci Pollut ResInt，2017，24（2）：183218.