王文學(xué)，王逸虹，劉易科，張宇慶，佟漢文，陳 泠，何偉杰，鄒 娟，朱展望，高春保,

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華中地區(qū)小麥病害生物學(xué)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/湖北省小麥工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430064；2.長(zhǎng)江大學(xué)/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434025)

系統(tǒng)選擇是對(duì)已經(jīng)基本穩(wěn)定的品種(系)進(jìn)行選擇，并對(duì)選育后代進(jìn)行鑒定試驗(yàn)而選育新品種的育種方法[1]。我國(guó)近代育種歷史中，采用系統(tǒng)選擇方法育出了大批作物品種，并在生產(chǎn)上應(yīng)用。江蘇里下河地區(qū)農(nóng)科所通過(guò)系統(tǒng)選擇先后育成了揚(yáng)麥1號(hào)、揚(yáng)麥2號(hào)、揚(yáng)麥3號(hào)、揚(yáng)麥4號(hào)等小麥品種。在水稻中，通過(guò)系統(tǒng)選擇先后育成了揚(yáng)稻1號(hào)、揚(yáng)稻2號(hào)等品種。隨著育種水平的提高，雜交育種被廣泛利用，系統(tǒng)選擇在現(xiàn)代育種中的地位不斷下降，但系統(tǒng)選擇可保留原有品種優(yōu)點(diǎn)，利用品種剩余變異克服原品種某些缺點(diǎn)，并可進(jìn)一步提高品種的一致性與穩(wěn)定性。因此，此育種方法仍被作為一種輔助手段在育種中應(yīng)用。如江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)寧麥9號(hào)進(jìn)行系統(tǒng)選擇，育成的寧麥13、寧麥14等品種克服了寧麥9號(hào)抗倒性差、千粒重較低的缺點(diǎn)，取代了寧麥9號(hào)，在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用[2-3]。

植物新品種必須要滿足特異性、一致性和穩(wěn)定性(distinctness, uniformity and stability, DUS)才能取得品種權(quán)[4]。DNA分子標(biāo)記技術(shù)可用來(lái)直接檢測(cè)品種間DNA水平上的差異，不受環(huán)境影響和季節(jié)限制，檢測(cè)周期短、準(zhǔn)確率高，已經(jīng)被應(yīng)用于多種領(lǐng)域。因SSR(simple sequence repeats)分子標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、共顯性分離、位點(diǎn)專(zhuān)化性、標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組且分布均勻等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家對(duì)其應(yīng)用較為廣泛，并取得了一定成果[5-11]。韓鳳龍等[12]篩選出了6對(duì)骨干引物，它們具有較好的品種鑒別力和穩(wěn)定性，可用于河南省小麥品種特異性和一致性鑒定。滕海濤等[13]認(rèn)為，要保證對(duì)不同品種進(jìn)行區(qū)分，需要建立核心引物。王立新等[14]根據(jù)小麥DUS測(cè)試的需求，篩選出105對(duì)引物，并將其分為21對(duì)核心引物、29對(duì)一級(jí)備用引物和55對(duì)二級(jí)備用引物。其中21對(duì)核心引物分辨力較高，可以完成約80%品系的特異性檢測(cè)，約95%品系的種子純度檢測(cè)和約60%品系的一致性、穩(wěn)定性檢測(cè)。分子標(biāo)記的應(yīng)用極大地方便了品種DUS測(cè)試，可在基因型水平上反映品種間遺傳相似性[15]，結(jié)合田間性狀鑒定，可有效鑒定品種特異性。

鄂麥28是用揚(yáng)麥15/華2566雜交組合通過(guò)系譜法和改良集團(tuán)育種法選育而成的小麥新品系，2016-2018年參加湖北省小麥區(qū)域試驗(yàn)，平均產(chǎn)量5 306.70 kg·hm-2，比對(duì)照鄭麥9023增產(chǎn)4.97%。該品系具有中抗赤霉病、抗穗發(fā)芽、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等突出特點(diǎn)，推廣應(yīng)用價(jià)值較大。為進(jìn)一步改良鄂麥28，對(duì)其群體進(jìn)行了大規(guī)模的系統(tǒng)選擇。本研究對(duì)鄂麥28系統(tǒng)選擇的30個(gè)品系進(jìn)行田間鑒定試驗(yàn)和小麥21對(duì)核心SSR標(biāo)記檢測(cè)，以有效利用其剩余變異，促進(jìn)其生產(chǎn)利用。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為鄂麥28及其系統(tǒng)選擇的18S268、18S270等30個(gè)品系。2016-2017年度選擇鄂麥28單穗800個(gè)。2017-2018年度在襄陽(yáng)原種場(chǎng)種植穗行，田間選擇穗行65個(gè)，經(jīng)產(chǎn)量比較和室內(nèi)考種，保留30個(gè)品系進(jìn)行產(chǎn)量試驗(yàn)和分子標(biāo)記檢測(cè)。

圖1 鄂麥28與親本揚(yáng)麥15和華2566典型單株

1.2 方法

1.2.1 田間鑒定試驗(yàn)

2018-2019年在襄陽(yáng)市原種場(chǎng)(襄陽(yáng)市襄州區(qū)古驛鎮(zhèn)，北緯32°17′6.3762″)和湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所南湖農(nóng)場(chǎng)(武漢市洪山區(qū)，北緯30°29′3″)種植鄭麥9023(對(duì)照)及鄂麥28系選的30個(gè)品系。襄陽(yáng)市原種場(chǎng)屬鄂北崗地麥區(qū)，冬季陰冷潮濕，夏季高溫干旱，春秋常年較干旱，土壤黃棕壤，肥力中上等。南湖農(nóng)場(chǎng)屬江漢平原麥區(qū)，小麥生育期降雨偏多，抽穗揚(yáng)花期光照相對(duì)不足，赤霉病流行較重，秋季雨量偏少。

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，武漢和襄陽(yáng)的小區(qū)面積分別為6和6.67 m2。武漢試驗(yàn)調(diào)查記錄各小區(qū)抽穗期、開(kāi)花期和成熟期；抽穗完全后測(cè)量株高，調(diào)查單位面積有效穗數(shù)，收獲時(shí)取樣調(diào)查穗粒數(shù)，并測(cè)量千粒重及小區(qū)產(chǎn)量。襄陽(yáng)試驗(yàn)小麥?zhǔn)斋@后計(jì)產(chǎn)。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測(cè)

待收獲后取少量鄂麥28和30個(gè)品系的種子，在發(fā)芽盒中發(fā)芽，取少量新鮮嫩葉，采用CTAB法[16]提取其基因組DNA，用21對(duì)核心SSR引物(表3，含Genomic-SSR引物18對(duì)和EST-SSR 引物3對(duì)，均為單位點(diǎn)引物，分別位于21條染色體，引物類(lèi)型退火溫度等詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14])進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)21對(duì)引物比對(duì)結(jié)果計(jì)算品系間的遺傳相似系數(shù)(GS)。GS≤0.90時(shí)品系之間具有特異性，GS在0.91～0.95之間時(shí)品系比較相似，GS大于0.95時(shí)品系為高度相似[17-18]。1.2.3 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增結(jié)果分析

PCR反應(yīng)體系為康為世紀(jì)的2×Es Taq MasterMix (Dye)反應(yīng)體系15 μL：7.5 μL 2×PCR 反應(yīng)緩沖液，10 μmol·L-1的引物 1 μL，模板DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50～68 ℃(根據(jù)引物不同，見(jiàn)表1)退火1 min，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠200 V電泳1.2 h，采用硝酸銀染色法顯色后進(jìn)行人工讀帶。擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型與鄂麥28相同記為“1”，不同的依次記為“2”、“3”、“4”，以此方法標(biāo)記帶型編號(hào)。

1.2.4 遺傳相似系數(shù)(GS)的計(jì)算方法

GSij=2Nij/(Ni+Nj)。式中Nij為第i和第j兩品系相同帶型的DNA位點(diǎn)總數(shù)，Ni和Nj為鄂麥28和參試品系相對(duì)比的DNA位點(diǎn)總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間鑒定結(jié)果

2.1.1 產(chǎn)量及及其構(gòu)成表現(xiàn)

由表1可知，30個(gè)品系產(chǎn)量變化范圍為 4 788.33～6 541.00 kg·hm-2，穗粒數(shù)變化范圍為36.00～48.53，千粒重變化范圍為32.93～ 46.67 g，每公頃穗數(shù)變化范圍為313.33萬(wàn)～451.67萬(wàn)。產(chǎn)量的變異系數(shù)為7.73%，產(chǎn)量構(gòu)成因素與產(chǎn)量的相關(guān)性均未達(dá)到顯著。穗數(shù)變異系數(shù)為9.37%，穗粒數(shù)和千粒重變異系數(shù)均較小。

表1 不同小麥品種(系)在武漢和襄陽(yáng)的產(chǎn)量調(diào)查結(jié)果Table 1 Yield of different wheat materials in Wuhan and Xiangyang

與鄭麥9023相比，武漢試驗(yàn)中18S329等20個(gè)品系表現(xiàn)增產(chǎn)，襄陽(yáng)試驗(yàn)中18S279等23個(gè)品系增產(chǎn)。其中，18S268、18S272、18S281、18S309、18S311、18S314、18S317、18S318、18S323、18S325、18S276、18S278、18S279、18S293、18S329、18S331、18S333等17個(gè)品系在兩地均增產(chǎn)，兩地增產(chǎn)幅度均超過(guò)5%的品系有18S268、18S309、18S314、18S317、18S318、18S279、18S293、18S329、18S331等9個(gè)品系。18S325和18S276在武漢增產(chǎn)顯著，但在襄陽(yáng)增產(chǎn)不明顯。18S278在襄陽(yáng)增產(chǎn)顯著，而在武漢增產(chǎn)不明顯。18S318增產(chǎn)幅度在兩地均超過(guò)10%，豐產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性均較好。18S329的產(chǎn)量在武漢鑒定試驗(yàn)中居第一位，增產(chǎn)24.23%，其穗粒數(shù)和穗數(shù)均最高，千粒重中等；在襄陽(yáng)試驗(yàn)中增產(chǎn)7.93%，產(chǎn)量表現(xiàn)優(yōu)異。18S279的產(chǎn)量在襄陽(yáng)鑒定試驗(yàn)中居第一位，增產(chǎn)14.74%；在武漢鑒定試驗(yàn)中增產(chǎn) 7.05%，產(chǎn)量表現(xiàn)優(yōu)異，千粒重較高，穗粒數(shù)和穗數(shù)中等。

2.1.2 其他性狀表現(xiàn)

30個(gè)品系株高變化范圍為83.67～93.33 cm，變異系數(shù)為2.65%，品系之間差異不大(表2)。18S349、18S323、18S337、18S282、18S279、18S272、18S333、18S278、18S336等9個(gè)品系株高高于對(duì)照品種，其余21個(gè)品系矮于對(duì)照品種。30個(gè)品系中，18S299生育期比對(duì)照品種早2 d，18S278抽穗開(kāi)花較早，其余品系生育期與對(duì)照品種一致或晚1～4 d。

表2 武漢試點(diǎn)小麥不同品種(系)株高和生育期Table 2 Plant height and growth stages of different wheat materials in Wuhan

2.2 鄂麥28選系的相似性

根據(jù)王立新等[14]的方法，在19～21個(gè)核心SSR標(biāo)記相同的品系中，均有GS大于0.95的可能性，需利用備用引物進(jìn)行更多位點(diǎn)比對(duì)，以確定GS大于0.95的品系，即3個(gè)及以上核心標(biāo)記不同的品系可以確定其特異性。鄂麥28及其30個(gè)后代家系經(jīng)21對(duì)核心SSR引物擴(kuò)增，再經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果(圖2、表3)表明，18S270、18S281、18S306、18S309、18S311、18S314、18S323、18S325、18S276、18S329、18S331、18S337等12個(gè)品系標(biāo)記結(jié)果與鄂麥28完全一致，GS 為 1，不具有特異性。其中18S325、18S314、18S329、18S331等4個(gè)品系產(chǎn)量性狀優(yōu)異，可作為鄂麥28優(yōu)系進(jìn)行繁殖推廣。18S268、18S272、18S288、18S307、18S317、18S318、18S277、18S293、18S333、18S350等10個(gè)品系有一個(gè)變異位點(diǎn)，18S282和18S285有兩個(gè)變異位點(diǎn)。這12個(gè)品系遺傳相似系數(shù)較高，特異性需進(jìn)一步檢測(cè)。18S268、18S293、18S317、18S318四個(gè)品系產(chǎn)量性狀優(yōu)良，在田間也表現(xiàn)出一定的差異，可作為新品系進(jìn)一步利用。18S279、18S349、18S278、18S336、18S299分別有3、4、5、6、7個(gè)位點(diǎn)變異，18S312變異位點(diǎn)最多，為12個(gè)。這6個(gè)品系遺傳相似系數(shù)小于0.90，可以確定其特異性。其中18S279產(chǎn)量表現(xiàn)優(yōu)異，兩地均增產(chǎn)；18S278在襄陽(yáng)增產(chǎn)顯著，在武漢增產(chǎn)不明顯，抽穗開(kāi)花較早，成熟期與對(duì)照一致；其余4個(gè)品 系不同程度減產(chǎn)。這兩個(gè)品系可作為新品系利用。

M:DNA marker; 1泳道：鄂麥28典型單株；2～31泳道：鄂麥28的30個(gè)選系。

表3 鄂麥28及其30個(gè)選系21對(duì)SSR核心引物檢測(cè)結(jié)果Table 3 Genotypes of Emai 28 and its 30 re-selected lines at 21 wheat core SSR loci

3 討 論

雜交育種是目前小麥育種的主要方法，系統(tǒng)選擇在育種中應(yīng)用相對(duì)較少。但本研究發(fā)現(xiàn)，新育成品系仍存在較多的剩余變異，比如18S312品系，經(jīng)檢測(cè)與鄂麥28在21個(gè)位點(diǎn)中有12個(gè)位點(diǎn)變異。系統(tǒng)選擇方法雖然在新品種選育中效率較低，但可將其應(yīng)用在新品系剩余變異的挖掘利用中。在品種育成后對(duì)苗頭品種進(jìn)行較大規(guī)模的穗選或單株選擇，尤其是對(duì)于綜合性狀好、優(yōu)點(diǎn)突出、應(yīng)用前景較大的新品種，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)選擇，有望改良某些缺點(diǎn)，并提升品種的一致性和穩(wěn)定性，對(duì)該品種的推廣應(yīng)用大具有較大價(jià)值。

系統(tǒng)選擇結(jié)合雜交育種是一個(gè)快速有效的育種手段。如對(duì)雜交育種育成的小麥品種寧麥9號(hào)進(jìn)行系統(tǒng)選擇，育成了寧麥13、寧麥14等品種。這些品種，特別是寧麥13，克服了寧麥9號(hào)抗倒性差、千粒重較低的缺點(diǎn)，取代了寧麥9號(hào)，得到大面積種植[2-3]。程順和等[19]指出，在品種育成初期，由于剩余分離和天然雜交等原因，其原始群體內(nèi)個(gè)體或株系間許多重要經(jīng)濟(jì)性狀均存在遺傳差異。從原始群體中進(jìn)行再選擇，可以使許多經(jīng)濟(jì)性狀上的缺陷得到改良或使原本優(yōu)良的性狀得到加強(qiáng)。揚(yáng)麥5號(hào)優(yōu)系在產(chǎn)量、抗病性等方面均比揚(yáng)麥5號(hào)有明顯提高。揚(yáng)麥158的優(yōu)系的產(chǎn)量性狀顯著好于原始群體，揚(yáng)麥158育成初期成熟期有少量青穗、植株不整齊等缺點(diǎn)明顯改善。系統(tǒng)選擇對(duì)于這兩個(gè)品種的推廣利用起到了重要推動(dòng)作用。雜交育種親本選配原則之一是要求親本綜合性狀好、優(yōu)點(diǎn)多、缺點(diǎn)少，而系統(tǒng)育種能針對(duì)某個(gè)缺點(diǎn)進(jìn)行改良，優(yōu)中選優(yōu)，連續(xù)選優(yōu)，因此把系統(tǒng)選擇用于親本的選擇，提高親本的水平，有助于育成新品種和提高育成品種的水平。彭紹峰等[20]研究表明，同一小麥品系內(nèi)不同株系作親本對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)有顯著影響，對(duì)優(yōu)良組合親本進(jìn)行分離篩選能進(jìn)一步提高雜種優(yōu)勢(shì)水平。

分子標(biāo)記的應(yīng)用極大地方便了育種工作，利用分子標(biāo)記對(duì)系統(tǒng)選擇的后代的遺傳相似性進(jìn)行鑒定，可幫助我們從基因型的角度了解不同家系的遺傳差異，其檢測(cè)結(jié)果可有效區(qū)分各家系的特異性，具有特異性的家系還可作為新品種進(jìn)行應(yīng)用。對(duì)系統(tǒng)選擇的后代，如果在某個(gè)性狀如抗病性有明顯差異，且遺傳相似性較高，可以作為遺傳材料進(jìn)行該性狀的研究。

目前，基于SSR分子標(biāo)記的小麥DNA指紋鑒定主要有聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)2種方法。R?der等[21]利用19個(gè)小麥SSR熒光標(biāo)記，建立了歐洲主栽小麥品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)。鄭永勝等[22]從2 438個(gè)定位到小麥染色體上的SSR標(biāo)記中，篩選出了42個(gè)PCR擴(kuò)增穩(wěn)定、帶型易讀、在基因組中分布較均勻、適合對(duì)中國(guó)小麥育成品種進(jìn)行鑒定的SSR標(biāo)記，建立了基于SSR熒光標(biāo)記的高通量小麥品種DNA指紋鑒定體系。王立新等[14]提出檢測(cè)小麥特異性采用3種分子標(biāo)記的105對(duì)引物，包含21對(duì)核心引物、84對(duì)備用引物。劉麗華等[23]利用21對(duì)核心SSR引物對(duì)2009-2014年參加國(guó)家冬小麥區(qū)域試驗(yàn)的430個(gè)品系進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)這21對(duì)SSR引物能夠區(qū)分430個(gè)品系中的408個(gè)品系，引物區(qū)分能力為95%，表明21對(duì)核心引物的多態(tài)性非常高，具有較高的代表性。本研究利用21對(duì)核心引物對(duì)鄂麥28系統(tǒng)選育后代進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果有效反映了參試材料在基因組水平存在的差異，有助于準(zhǔn)確分析各優(yōu)系和原始品種之間存在的差異，對(duì)于進(jìn)一步分析各優(yōu)系的潛在利用價(jià)值有重要參考 意義。