亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇檢測方法研究

        2020-07-28 02:56:10劉桂英吳金浩王志松
        水產(chǎn)科學(xué) 2020年4期

        劉桂英,田 金,肖 瑤,吳金浩,宋 倫,高 穎,王志松

        ( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧 大連 116023 )

        皮質(zhì)醇含量是反映腎上腺皮質(zhì)功能的重要指標(biāo)之一,海洋動物血清中的皮質(zhì)醇激素含量隨應(yīng)激強度呈現(xiàn)規(guī)律性變化,是可以用來衡量應(yīng)激水平的重要生理指標(biāo)[1]。皮質(zhì)醇分泌過多或者不足,均會導(dǎo)致機體免疫功能下降,增加動物發(fā)生病害的幾率[2]。機體分泌皮質(zhì)醇受外部環(huán)境影響,如擁擠和劇烈振蕩脅迫造成草魚(Ctenopharyngodonidellus)血液內(nèi)皮質(zhì)醇含量大幅度升高[3-4];船舶噪聲影響有機體中的皮質(zhì)醇水平,破壞有機體的繁殖發(fā)育和生長[5];環(huán)境壓力促使魚類生成皮質(zhì)醇激素,影響機體的新陳代謝等功能[6]。關(guān)于皮質(zhì)醇的研究主要集中在海洋脊椎動物[7-13],而海洋棘皮動物皮質(zhì)醇的相關(guān)研究報道較少。仿刺參的體腔液類似于血液,研究仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇的含量來評價仿刺參(Apostichopusjaponicus)的應(yīng)激水平,對于了解仿刺參的應(yīng)激能力和免疫水平等生理功能具有重要意義。

        目前測定血清皮質(zhì)醇有化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法、蛋白競爭法和高分辨質(zhì)譜法等[14-18],常用的是化學(xué)發(fā)光法,它具有檢測迅速、操作簡單等優(yōu)點,但受血清蛋白結(jié)合的影響,不能反映實際發(fā)揮功能的皮質(zhì)醇的情況;若基質(zhì)不同,結(jié)合蛋白不同,會導(dǎo)致皮質(zhì)醇的測定結(jié)果不準(zhǔn)確[19-20]。因此,研究仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇的測定方法,對進一步探索皮質(zhì)醇對仿刺參生理行為的影響,具有科學(xué)指導(dǎo)意義。

        筆者基于超高效液質(zhì)聯(lián)用的檢測方法,結(jié)合固相萃取的前處理技術(shù),建立仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇的檢測方法。通過優(yōu)化前處理技術(shù),采用梯度洗脫的分離方式,以建立快速、靈敏、穩(wěn)定的仿刺參體腔液皮質(zhì)醇檢測方法。

        1 材料與方法

        1.1 試驗仿刺參

        仿刺參取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院實驗基地,分別為3齡仿刺參和幼參若干,自基地運回后,于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)10 d,暫養(yǎng)期間水溫保持在(25.0±0.5) ℃,鹽度約30,光照周期為14L∶10D。每日16:00過量投喂幼參1次,3齡參此溫度下進入夏眠不攝食。飼料為遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院自研飼料,主要由魚粉、鼠尾藻(Sargassumthunbergii)粉、馬尾藻(Sargassumsp.)粉、海帶(Saccharinajaponica)粉和酒糟等組成。每日清污換水1次,24 h連續(xù)充氣。

        1.2 儀器與試劑

        Xevo TQD型超高效液相色譜質(zhì)譜儀(美國 Waters公司)、氮吹濃縮儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)、Milli-Q超純水儀(美國 Milliopore公司)、離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、固相萃取柱(美國安捷倫公司,300 mg,3 mL)。

        1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

        準(zhǔn)確稱取適量(精確至1.0 mg)皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解,配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃保存,臨用時稀釋成所需用量。

        1.4 樣品前處理

        取樣時,將仿刺參置于冰盤中,自腹面剖開約1 cm,用1 mL無菌注射器吸取體腔液, 3齡參每頭吸取5 mL體腔液組成一個樣品; 因幼參體腔液含量少, 為保證樣品充足,每頭吸取1 mL, 5頭幼參的體腔液共5 mL合為一個樣品。將抽取的體腔液置于50 mL聚丙烯塑料離心管中,加入10 mL甲酸乙腈混合溶液(在10 mL乙腈中加入20 μL的甲酸),充分搖勻,渦旋,加入1 g的氯化鈉和4 g無水硫酸鈉,充分渦旋混勻1 min,超聲10 min,靜置,以5000 r/min,4 ℃離心15 min,取乙腈相上清液4 mL,放入空的聚丙烯塑料離心管中,加入1 mL水,混勻,將待測溶液全部轉(zhuǎn)入,過固相萃取柱,重力自流,抽干小柱,收集全部流出液,45 ℃水浴濃縮,氮吹儀氮吹至液面高度恒定,用去離子水定容至1 mL,上清液經(jīng)水相濾膜0.22 μm過濾至進樣瓶中,供超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析。

        1.5 色譜條件

        色譜柱:BEH C-18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A為體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液,B為乙腈;流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序見表1,進樣體積10 μL。

        表1 二元梯度洗脫順序

        1.6 質(zhì)譜條件

        電噴霧電離(ESI+)源,正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度:650 ℃;毛細管電壓:3.20 kV;錐孔電壓:45 V;脫溶劑氣溫度:400 ℃;脫溶劑氣流量:650 L/h,錐孔氣流量:50 L/h。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

        采用樣品基質(zhì)提取液配制質(zhì)量濃度為0、5、10、20、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到目標(biāo)化合物的線性回歸方程y=197.8x-1192和相關(guān)系數(shù)r=0.9920,結(jié)果表明,皮質(zhì)醇在質(zhì)量濃度0~100 μg/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,以3倍和10倍信噪比確定該化合物的儀器檢出限和定量限,分別為0.11 μg/L和0.35 μg/L。

        2.2 回收率和精密度

        取空白樣品,分別添加20、40、100 μg/L質(zhì)量濃度水平的皮質(zhì)醇,每個質(zhì)量濃度水平測定5份平行樣品,考察方法的回收率和精密度,平均回收率分別為77%、96%和105%,精密度分別達到5.6%、3.2%和2.8%,試驗結(jié)果表明,本方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度,適合實際樣品的測定。

        2.3 實際樣品測定

        用本試驗所建立的方法,對幼參和3齡參體腔液進行檢測,幼參體腔液中未檢出皮質(zhì)醇,3齡參混合體腔液中皮質(zhì)醇的含量為6.91 μg/L,雌3齡參體腔液中皮質(zhì)醇含量為6.28 μg/L,雄3齡參體腔液中皮質(zhì)醇含量為6.21 μg/L,實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液多重反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。本試驗的樣品檢測結(jié)果與周曉夢等[21]結(jié)果不同,周曉夢等[21]是用平均體質(zhì)量(31.68±3.29) g的仿刺參,而本試驗用的是平均體質(zhì)量(15±2.59) g的仿刺參,分析可能是由于個體差異所致。

        圖1 實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液多重反應(yīng)監(jiān)測色譜

        3 討 論

        3.1 色譜條件的優(yōu)化

        因皮質(zhì)醇為極性化合物,常用的色譜柱為C-18柱,本試驗采用BEH C-18柱和BEH HILIC柱在同一條件下進行分離,通過比較發(fā)現(xiàn),BEH C-18柱的分離效果好于BEH HILIC柱,目標(biāo)化合物的峰型尖銳,且相同質(zhì)量濃度信號響應(yīng)值高。乙腈和水、甲醇和水是液質(zhì)分析常用的流動相,用這兩種流動相組成進行分析可知,乙腈和水的效果優(yōu)于甲醇和水,在水中加入了0.1%的甲酸后,增強了目標(biāo)物的離子化效率,減小了基質(zhì)效應(yīng),在相同濃度峰響應(yīng)值增高(圖1)。

        流速和柱溫對保留時間和峰型均有影響。流速增加、柱溫升高均會使皮質(zhì)醇的保留時間減小,峰寬變窄,峰型對稱尖銳,但若流速太大,柱溫太高,對色譜柱有損傷,減少色譜柱的壽命。選取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min的流速進行試驗,結(jié)果表明,在流速0.2 mL/min和柱溫30 ℃時效果最佳。

        3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        在ESI+模式下對0.5 mg/L的皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進行質(zhì)譜掃描分析,得到該化合物的分子離子峰[M+H]+,以分子離子為母離子,對其進行二級質(zhì)譜掃描,質(zhì)譜參數(shù)見表2。

        表2 皮質(zhì)醇的質(zhì)譜參數(shù)

        3.3 提取試劑的優(yōu)化

        有機提取常用試劑有乙腈、甲醇、氯仿等,根據(jù)文獻[18],先用氯仿提取皮質(zhì)醇,結(jié)果發(fā)現(xiàn),氯仿的提取率較低,改用100%甲醇、80%甲醇、100%乙腈及80%乙腈對加標(biāo)樣品進行提取,通過回收率比較提取效率,結(jié)果見圖2。由圖2可知,80%乙腈的提取效率高,為90%,由于添加甲酸能促進皮質(zhì)醇提取,故在80%乙腈中,加入不同含量的甲酸進行提取,結(jié)果發(fā)現(xiàn),80%乙腈中加入0.2%甲酸提取效率高,達到95%。為除去仿刺參體腔液的水分,加入無水硫酸鈉和氯化鈉,促使待測物由水相轉(zhuǎn)移到有機相。經(jīng)過多次優(yōu)化試驗,得到最佳的提取條件為10 mL 80%乙腈+0.2%甲酸、4 g無水硫酸鈉、1 g氯化鈉。

        圖2 不同提取溶劑對皮質(zhì)醇提取效率

        3.4 凈化條件的優(yōu)化

        由于樣品基質(zhì)中蛋白質(zhì)和脂類含量較為豐富,干擾組分多,對凈化方法要求較高,液—液凈化法及基質(zhì)固相分散法難以達到凈化要求,其提取液仍需進一步凈化方可用于儀器檢測。因此本研究通過試驗考察對比了Oasis HLB固相萃取柱、OasisPrime固相萃取柱、Captiva EMR-Lipid固相萃取柱和Bond Elut Plexa固相萃取柱的純化效果(圖3),結(jié)果發(fā)現(xiàn),Oasis HLB固相萃取柱雖有一定的凈化效率,但比較費時,需要經(jīng)過活化、平衡和淋洗3個步驟。OasisPrime固相萃取柱和Bond Elut Plexa固相萃取柱提取效率較低。只有Captiva EMR-Lipid固相萃取柱提取效率高,操作時間短,只需將提取溶液直接過柱,保持一定的速度,就能快速去除脂肪、磷脂等雜質(zhì),減小基質(zhì)效應(yīng),節(jié)省時間和溶劑。因此,選擇使用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱作為凈化小柱。

        圖3 不同類型固相萃取柱提取皮質(zhì)醇的回收率

        3.5 基質(zhì)效應(yīng)的評價

        基質(zhì)效應(yīng)主要是由于樣品在離子化時基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物相互競爭電離所致,包括基質(zhì)增強效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。在液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜定性定量分析中,基質(zhì)效應(yīng)會對儀器的靈敏度和重復(fù)性產(chǎn)生影響,進而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。體腔液的組織成分復(fù)雜,含有蛋白質(zhì)、磷脂、氨基酸等大分子化合物,可能會抑制或增強基質(zhì)效應(yīng)。本試驗采用(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)的計算方法對皮質(zhì)醇的基質(zhì)效應(yīng)進行評價[22]。當(dāng)結(jié)果為正值時表示基質(zhì)增強效應(yīng),結(jié)果為負值時表示基質(zhì)抑制效應(yīng),絕對值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強。通常認為,基質(zhì)效應(yīng)在±20%內(nèi)為不顯著[23]。根據(jù)計算得知,仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇的基質(zhì)效應(yīng)為-15.3%,說明皮質(zhì)醇存在基質(zhì)效應(yīng),但影響不顯著,因此,為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,選擇相應(yīng)空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制校正曲線來進行定量分析。

        4 結(jié) 論

        本研究結(jié)合固相萃取前處理技術(shù),建立了仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法,該方法操作簡便,快速準(zhǔn)確,靈敏度和精密度較高,符合仿刺參體腔液皮質(zhì)醇低含量檢測的要求,為進一步研究仿刺參的應(yīng)激能力和減少仿刺參病害提供技術(shù)支持。

        国产成人亚洲精品电影| 欧美日韩一区二区三区在线观看视频| 国产精品一区二区在线观看| 无码欧亚熟妇人妻AV在线外遇| 久久久调教亚洲| 久久精品国产亚洲av麻豆床戏| 精品国偷自产在线视频九色| 色偷偷av亚洲男人的天堂| 久久亚洲第一视频黄色| 亚洲av色香蕉一区二区三区av| 肉色丝袜足j视频国产| 好吊色欧美一区二区三区四区| 2021国产最新无码视频| av天堂中文亚洲官网| 亚洲自偷自拍另类第1页| 99久久久无码国产精品试看 | 官网A级毛片| av网站国产主播在线| 日本护士xxxx视频| 亚洲国产成人久久综合一区77| 开心五月婷婷综合网站| 精品国产日韩一区2区3区| 99亚洲男女激情在线观看| 精品国产AⅤ无码一区二区| 亚洲一区二区三区码精品色| 日本三级吃奶头添泬| 亚洲欧洲巨乳清纯| 深夜福利国产| 护士人妻hd中文字幕| 日本亚洲欧美色视频在线播放| 99国产超薄丝袜足j在线观看 | 白白色发布在线观看视频| 夫妇交换性三中文字幕| 色吧综合网| av一区二区三区高清在线看| 亚洲人成在线播放网站| 成人做爰视频www| 中文字幕有码高清| 亚洲人成网站色在线入口口| 亚洲欧美一区二区三区在线| 久久精品国产亚洲黑森林|