雷 陽(yáng)，王松剛，陳 鈺，姜 堯，鄭 毅,2

( 1.福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117； 2.福建師范大學(xué) 南方海洋研究院，福建 福州 350117 )

河鲀魚(yú)肉味鮮美，廣受人們的喜愛(ài)，但因其體內(nèi)含有河鲀毒素，因此河鲀的食用受到限制。早在1990年，我國(guó)在《水產(chǎn)品衛(wèi)生管理辦法》中寫(xiě)到：河鲀魚(yú)有劇毒，不得流入市場(chǎng)。河鲀毒素是一種劇毒，其毒性是氰化物的1000余倍，不慎食入會(huì)口舌、肌肉麻痹，四肢無(wú)力，惡心嘔吐，癱瘓，嚴(yán)重者會(huì)呼吸困難，窒息而亡，并且迄今為止尚無(wú)可以解除此毒的特效藥物[1]。關(guān)于河鲀毒素的起源一直存在爭(zhēng)議，主要有內(nèi)因說(shuō)和外因說(shuō)，內(nèi)因說(shuō)主張河鲀毒素是由其自身產(chǎn)生，河鲀魚(yú)體內(nèi)存在某種機(jī)制可以將攝入的食物轉(zhuǎn)化為毒素，1998年kendo[2]證實(shí)，胚胎可以產(chǎn)生河鲀毒素，但目前該假說(shuō)由于證據(jù)不足，尚未得到研究者的普遍認(rèn)可。外因說(shuō)主要指食物鏈假說(shuō)和微生物起源假說(shuō)。王少蓉等[3]在黃鰭東方鲀(Takifuguxanthopterus)的卵巢中篩選出產(chǎn)毒能力較強(qiáng)的EL10菌株。邢磊[4]自橫紋東方鲀(T.oblongus)腸道分離到菌株HDC13、HDC35、HDC37，將3株菌混合培養(yǎng)后其產(chǎn)物對(duì)老鼠有較強(qiáng)的致死效果，這為外因說(shuō)提供有力的證據(jù)。人工養(yǎng)殖的河鲀通常低毒或無(wú)毒，這一差異與野生和養(yǎng)殖河鲀腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)有很大聯(lián)系。筆者擬通過(guò)16S rRNA基因V3～V4區(qū)的Miseq PE300測(cè)序，對(duì)野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀(T.bimaculatus)腸道微生物進(jìn)行多樣性分析，以期揭示野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道微生物中優(yōu)勢(shì)菌群的組成，為探明菌群多樣性的進(jìn)化規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年11月進(jìn)行樣品采集，3尾野生雙斑東方鲀采于廈門(mén)同安海域，3尾養(yǎng)殖雙斑東方鲀采于漳州養(yǎng)殖場(chǎng)，6個(gè)樣品規(guī)格相似。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.206—2016檢測(cè)，野生雙斑東方鲀腸道內(nèi)河鲀毒素的含量小于1.5 MU/g，養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道內(nèi)河鲀毒素含量小于0.04 MU/g。

1.2 樣品處理

用75%酒精擦拭河鲀的表面3次，然后在無(wú)菌的條件下，用滅過(guò)菌的解剖器取其腸道內(nèi)容物于滅菌的PE管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA的提取和擴(kuò)增

用E.Z.N.A. Stool DNA Kit試劑盒提取DNA。將提取的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用分光光度法(260 nm/280 nm光密度比)檢測(cè)含量和純度。檢測(cè)后將樣品保存于-20 ℃?zhèn)浜罄m(xù)試驗(yàn)使用。

以提取DNA為模板，細(xì)菌16S rDNA V3～V4擴(kuò)增引物為338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3′)和806 R(5′-GGACTACNNGGGTATCT AAT-3′)進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2 μL引物(5 μmol/L)，2 μL模板DNA和5.5 μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后按等量混合，進(jìn)行Illumina測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序原始序列上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，下機(jī)數(shù)據(jù)去除接頭序列和引物并拼接，進(jìn)一步去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列。根據(jù)接頭序列對(duì)各個(gè)樣本進(jìn)行相似度為97%的運(yùn)算分類單元(OTU)聚類，將得到的運(yùn)算分類單元與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(128)進(jìn)行對(duì)比，得到每個(gè)運(yùn)算分類單元對(duì)應(yīng)的物種分類信息。

樣本的Alpha多樣性通過(guò)Chao-1、observed-species、PD_whole_ tree、香農(nóng)指數(shù)表示，其中observed-species、Chao-1、PD_whole_ tree用來(lái)評(píng)估樣本物種豐度，而香農(nóng)指數(shù)用來(lái)評(píng)估樣本多樣性。

Chao1：即菌種豐富度指數(shù)，用以估計(jì)群落中的運(yùn)算分類單元數(shù)目。

Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)

式中，Schao1為估計(jì)的運(yùn)算分類單元數(shù)，Sobs為觀測(cè)到的運(yùn)算分類單元數(shù)，n1為只有一條序列的運(yùn)算分類單元數(shù)目，n2為只有兩條序列的運(yùn)算分類單元數(shù)目。

observed_species：隨測(cè)序深度的增加，實(shí)際觀測(cè)到運(yùn)算分類單元的個(gè)數(shù)。

goods_coverage：觀測(cè)深度。

C=1-n1/N

式中，n1為只有含一條序列的運(yùn)算分類單元數(shù)目，N為抽樣中出現(xiàn)的總的序列數(shù)目。

香農(nóng)指數(shù)：用來(lái)估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。

H=-∑PilnPi

式中，H為香農(nóng)指數(shù)，Pi為樣品中屬于第i種的個(gè)體的比例。

利用QIIME軟件(版本號(hào)1.8)估計(jì)樣本多樣性并制作韋恩圖。

使用R語(yǔ)言vegan包、vegdist和hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類分析，構(gòu)建基于未加權(quán)距離矩陣，UPGMA方法聚類建樹(shù)，并將聚類結(jié)果與各樣品在門(mén)、綱、目、科、屬水平上的物種相對(duì)豐度整合展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果和基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過(guò)Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序，在去除接頭序列和引物并拼接后，經(jīng)進(jìn)一步去除嵌合體、短序列后，6份樣品共得到優(yōu)質(zhì)序列99 500條，平均序列條數(shù)為16 583條，其中優(yōu)質(zhì)序列最多為27 781條，優(yōu)質(zhì)序列最少為7182條，對(duì)優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)序列多集中在400～420 bp和420～440 bp，然后將優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行97%相似度的運(yùn)算分類單元聚類分析。

由圖1～2可見(jiàn)，當(dāng)測(cè)序量在2000以下時(shí)，運(yùn)算分類單元的數(shù)目在迅速增加，香農(nóng)指數(shù)趨于平緩，當(dāng)測(cè)序量在6000多時(shí)，所有樣品的稀釋曲線仍在上升而香農(nóng)指數(shù)已經(jīng)達(dá)到飽和，盡管增加更多的數(shù)據(jù)量會(huì)產(chǎn)生新的運(yùn)算分類單元，但目前的測(cè)序量已經(jīng)能夠反映樣品中細(xì)菌的多樣性。

圖1 樣品稀釋曲線

2.2 群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)樣品中的微生物群落進(jìn)行分析，由于序列長(zhǎng)度以及數(shù)據(jù)庫(kù)的原因，運(yùn)算分類單元注釋只獲得了門(mén)、綱、目、科、屬幾個(gè)水平，微生物種類和相對(duì)豐富度無(wú)法具體到種水平的分類。

圖2 細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)

2.2.1 細(xì)菌在門(mén)水平上進(jìn)行分類及比較

測(cè)得序列經(jīng)過(guò)鑒定，在門(mén)水平主要為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、螺旋菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)，從門(mén)水平的分析可以看出：變形菌門(mén)在野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀中都占有很大的比例，為優(yōu)勢(shì)菌，梭桿菌門(mén)在野生雙斑東方鲀中占的比例相對(duì)較大，分別為13.13%、7.65%和0.09%，而梭桿菌門(mén)在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中占的比例相對(duì)較少，分別為0.02%、0.02%和0.03%。螺旋菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中明顯比在野生雙斑東方鲀中所占比例高(圖3)。

圖3 細(xì)菌門(mén)水平的菌群分布

2.2.2 細(xì)菌在屬水平上進(jìn)行分類及比較

從屬的水平進(jìn)行分析得知，養(yǎng)殖雙斑東方鲀中相對(duì)豐度大于1%的共有8個(gè)屬，分別為弓形桿菌屬(Arcobacter,39.63%)、短螺旋體屬(Brevinema，10.44%)、理研菌屬(Rikenella，8.25%)、弧菌屬(Vibrio,1.14%)、硝化螺菌屬(Nitrospira,5.26%)、乳桿菌屬(Lactobacillus,1.31%)、反硝化細(xì)菌(Denitratisoma，1.1%)、擬桿菌屬(Bacteroides,1.07%)，未鑒定的細(xì)菌屬占總細(xì)菌屬的16.5%。野生雙斑東方鲀中相對(duì)豐度超過(guò)1%的有弓形桿菌屬(35.97%)、內(nèi)皮單胞菌屬(Endozoicomonas，17.56%)、弧菌屬(7.21%)、硝化螺菌屬(2.6%)、希瓦氏菌屬(Shewanella,4.2%)、纖毛菌屬(Propionigenium,3.52%)、鯨桿菌屬(Cetobacterium,3.44%)、Romboutsia(1.01%),未鑒定的細(xì)菌屬占總細(xì)菌屬的12.31%。希瓦氏菌屬、纖毛菌、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)是野生雙斑東方鲀特有的(圖4)。

圖4 細(xì)菌屬水平的菌群分布

2.3 雙斑東方鲀腸道細(xì)菌Alpha多樣性分析

從Chao1、observed-species、PD_whole_ tree、香農(nóng)指數(shù)4個(gè)方面使用Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由圖5可見(jiàn)，Chao1、observed-species、PD_whole_ tree、香農(nóng)指數(shù)均為養(yǎng)殖型雙斑東方鲀大于野生型雙斑東方鲀，表明養(yǎng)殖型雙斑東方鲀腸道細(xì)菌多樣性和豐富度高于野生型雙斑東方鲀。

圖5 Alpha多樣性指數(shù)box圖

韋恩圖(圖6)可以直觀地反映樣品共有和各自特有的運(yùn)算分類單元數(shù)目，對(duì)樣品進(jìn)行相似度97%的聚類，野生雙斑東方鲀運(yùn)算分類單元數(shù)目為524，獨(dú)有的運(yùn)算分類單元數(shù)目為68, 其中OTU-18占3.415%，OTU-61占0.955%，OTU-33占0.945%，OTU-48占0.570%、OTU-81占0.37%，養(yǎng)殖雙斑東方鲀運(yùn)算分類單元數(shù)目為576，獨(dú)有的運(yùn)算分類單元數(shù)目為120，OTU-274占0.075%、OTU-565占0.040%。養(yǎng)殖雙斑東方鲀的運(yùn)算分類單元數(shù)目比野生雙斑東方鲀的運(yùn)算分類單元數(shù)目多，說(shuō)明養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道細(xì)菌的種類比野生雙斑東方鲀腸道細(xì)菌的種類更豐富。

圖6 樣品中細(xì)菌群落共享和獨(dú)有運(yùn)算分類單元的韋恩圖

2.4 Beta多樣性分析

主成分分析，一種可以對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單化分析的技術(shù)。通過(guò)分析不同樣本運(yùn)算分類單元(97%相似性)組成可以反映樣本間的差異和距離，將數(shù)據(jù)進(jìn)行R語(yǔ)言主成分作圖和分析(圖7)?；赨niFrac的非加權(quán)分析，第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為60.19%和20.80%。養(yǎng)殖雙斑東方鲀生活范圍相對(duì)有限，生活環(huán)境相似，因此3個(gè)樣品比較集中，野生雙斑東方鲀由于生活范圍廣泛，生活環(huán)境多變，3個(gè)樣品相對(duì)比較分散。

圖7 基于運(yùn)算分類單元水平的主成分分析

聚類分析的熱圖見(jiàn)圖8。圖中橫坐標(biāo)代表樣本的名稱，縱坐標(biāo)代表聚類情況，圖中不同顏色的方塊代表每個(gè)樣品屬的豐度，顏色的深淺變化的差異性和相似性代表不同樣品群落組成的相似程度。弓形桿菌屬在兩種雙斑東方鲀中占的比值最大，在養(yǎng)殖雙斑東方鲀占比39.6%，在野生雙斑東方鲀占比35.97%，希瓦氏菌屬、纖毛菌、發(fā)光桿菌屬在野生雙斑東方鲀腸道有發(fā)現(xiàn)，而在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，Brevinema在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中占10.4%，在野生雙斑東方鲀中只占0.26%，表明不同生活環(huán)境的魚(yú)腸道微生物群落的組成不同且差異性較大。

圖8 聚類分析的熱圖(屬水平)

3 討 論

3.1 野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀魚(yú)腸道微生物多樣性分析

腸道是動(dòng)物體物質(zhì)代謝與吸收的主要場(chǎng)所，而腸道的重要組成部分是腸道微生物，腸道微生物在動(dòng)物的發(fā)育、進(jìn)化、機(jī)體代謝方面有重要的作用[5-6]。對(duì)于在脊椎動(dòng)物中占比最大的魚(yú)類腸道中的微生物也備受人們的關(guān)注。本試驗(yàn)采集野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀樣品規(guī)格相似，由于生境不同，兩者腸道細(xì)菌菌群的多樣性有明顯的差異，野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀的總運(yùn)算分類單元數(shù)目并無(wú)明顯差異，但野生雙斑東方鲀獨(dú)有的運(yùn)算分類單元數(shù)目為68，其中OTU-18占比最大，為3.415%，養(yǎng)殖雙斑東方鲀獨(dú)有的運(yùn)算分類單元數(shù)目為120，占比最大的為OTU-274，僅占0.075%。Alpha多樣性分析結(jié)果顯示，養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道細(xì)菌多樣性和豐富度高于野生雙斑東方鲀，這是因?yàn)樗拗鞯娘嬍?、生活環(huán)境、年齡等因素都會(huì)影響腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)與組成[7]。在門(mén)水平上的分析結(jié)果顯示，變形菌門(mén)為野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌。梭桿菌門(mén)在野生雙斑東方鲀腸道中占有很大比例，在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中所占比例相對(duì)較少。文獻(xiàn)報(bào)道，變形菌門(mén)和梭桿菌門(mén)是大多數(shù)魚(yú)類腸道微生物的主要菌群，蘇月華等[8]對(duì)33只白甲魚(yú)(Onychostomasima)腸道內(nèi)容物進(jìn)行高通量測(cè)序結(jié)果顯示，白甲魚(yú)腸道菌群主要是梭桿菌門(mén)、變形菌、螺旋菌門(mén)、厚壁菌門(mén)，其中梭桿菌門(mén)和變形菌門(mén)占比高達(dá)82%。Wu等[9]用高通量測(cè)序方法對(duì)草魚(yú)腸道菌群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其主要為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)。屬水平上的分析結(jié)果顯示，弓形桿菌屬、弧菌屬、硝化螺菌屬在兩者中均占有較大比例。弧菌屬為養(yǎng)殖和野生雙斑東方鲀腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌之一，這一結(jié)果符合弧菌為海水魚(yú)腸道的主要菌群的說(shuō)法[10]。據(jù)報(bào)道，紅鰭東方鲀(T.rubripes)[11]腸道常見(jiàn)的細(xì)菌為弧菌屬、希瓦氏菌屬、假交替單胞菌屬和芽孢桿菌屬(Bacillus)?；【鷮?、希瓦氏菌屬、芽孢桿菌屬在星點(diǎn)東方鲀(T.niphobles)[12]腸道內(nèi)容物中也有發(fā)現(xiàn)。邢磊[4]自橫紋東方鲀腸道內(nèi)容物篩到49株菌，其中弧菌屬有28株，發(fā)光桿菌屬有1株，假交替單胞菌屬3株，希瓦氏菌屬有4株，這些細(xì)菌在雙斑東方鲀腸道中均有發(fā)現(xiàn)。

3.2 野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀魚(yú)腸道微生物多樣性與河鲀毒素的相關(guān)性

由于紅鰭東方鲀得病率高，死亡率高，而水域?qū)Π导y東方鲀具有限制性，福建地區(qū)近幾年主要以養(yǎng)殖菊黃東方鲀(T.flavidus)和雙斑東方鲀?yōu)橹鳎p斑東方鲀的抗病能力較菊黃東方鲀強(qiáng)，因此雙斑東方鲀投苗量越來(lái)越多[13]。野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀最大區(qū)別在于河鲀毒素含量的差異性，前者比后者含量高37.5倍。關(guān)于河鲀毒性產(chǎn)生有微生物起源的學(xué)說(shuō)，近幾年，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種能產(chǎn)生河鲀毒素的細(xì)菌，主要有弧菌、假單胞菌、芽孢桿菌、交替單胞菌(Alteromonas)、發(fā)光桿菌、放線菌等。岳田芳[14]在海藻希瓦氏菌(S.algae)發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到了河鲀毒素。王少蓉等[3]在黃鰭東方鲀中篩選出產(chǎn)河鲀毒素能力較強(qiáng)的EL10菌株，經(jīng)鑒定也屬于希瓦氏菌屬。王冠男等[15]指出，海膽中存在的假交替單胞菌可以產(chǎn)河鲀毒素，而從紅鰭東方鲀體內(nèi)分離出的達(dá)松維爾擬諾卡氏放線菌(Nocardiopsisdassonvillei)和梭形芽孢桿菌(B.fusiformis)可以產(chǎn)河鲀毒素。希瓦氏菌屬、纖毛菌屬、發(fā)光桿菌屬、假交替單胞菌屬存在于野生雙斑東方鲀腸道中，而在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中未發(fā)現(xiàn)，因此腸道產(chǎn)毒菌群的差異性與野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀毒性的差異可能具有某種聯(lián)系，這為探究河鲀毒素微生物源提供一定的科學(xué)依據(jù)。