王金林，王且魯，王萬良，曾本和，潘瑛子，周建設(shè)

( 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850002 )

魚類腸道是消化吸收的重要器官，也是魚類與外界環(huán)境接觸面積最大的器官，而腸道菌群是腸道的重要組成部分，且對(duì)動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)、代謝吸收也有重要影響[1-3]。脊椎動(dòng)物腸道菌群以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門為主[4]。腸道菌群通過長期自然選擇，與宿主間形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，從而增強(qiáng)宿主對(duì)有害環(huán)境的自我調(diào)節(jié)能力。目前已有研究表明，魚類腸道菌群的定殖主要與養(yǎng)殖水環(huán)境、飼喂餌料及魚卵表面中的細(xì)菌有關(guān)，其中養(yǎng)殖水環(huán)境和飼喂的餌料為主要因素[5]。腸道菌群分泌的酶可以幫助宿主分解食物增強(qiáng)營養(yǎng)的消化吸收，其分泌的抗生素類物質(zhì)則可阻止病原微生物的侵入。通過對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的研究，可為減少魚類病害的發(fā)生提供一定的理論參考數(shù)據(jù)。

傳統(tǒng)腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析研究方法包括傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、隨機(jī)擴(kuò)增引物多態(tài)性分析(RAPD)[6]，這些方法的局限性在于無法鑒定豐度極小的微生物，從而導(dǎo)致研究結(jié)果與樣品中真正的菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大偏差。近年來，MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)基于細(xì)菌16S rRNA基因在功能上的高度保守型及對(duì)應(yīng)序列不同位點(diǎn)的高變性，在保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物PCR擴(kuò)增然后對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定[7-8]。這種方法克服了傳統(tǒng)方法的局限性，對(duì)生物物種之間的親緣關(guān)系和差異有了較為準(zhǔn)確的分析。該測(cè)序技術(shù)可同時(shí)定量分析多個(gè)樣本中的群落結(jié)構(gòu)，從而真實(shí)全面地反映微生物群落結(jié)構(gòu)的基本特征[9]。

異齒裂腹魚(Schizothoraxo′connori)隸屬鯉形目、鯉科、裂腹魚亞科、裂腹魚屬，別名異齒弓魚。其腹部肛門附近具有特化形成裂隙的成排鱗片，即“裂腹”由來[10]。異齒裂腹魚分布于雅魯藏布江上、中游的干支流及附屬水體，營底棲生活，在干支流水質(zhì)清澈、礫石底質(zhì)的河道處活動(dòng)，為產(chǎn)區(qū)主要經(jīng)濟(jì)魚類之一。異齒裂腹魚生長緩慢、性成熟晚且繁殖力低，因此對(duì)過度捕撈和環(huán)境破壞較為敏感[10]。筆者以野生和人工養(yǎng)殖的異齒裂腹魚為試驗(yàn)對(duì)象，研究兩種異齒裂腹魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的異同，以期為減少異齒裂腹魚養(yǎng)殖過程中病害的發(fā)生提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

試驗(yàn)用異齒裂腹魚野生組采自雅魯藏布江日喀則江段，體質(zhì)量(1.00±0.13) kg。人工養(yǎng)殖組為水泥池馴化養(yǎng)殖3年的異齒裂腹魚，體質(zhì)量(1.00±0.20) kg。兩組魚體質(zhì)健壯、體表完好，可用于試驗(yàn)。

1.2 樣品采集方法

野生組和人工養(yǎng)殖組各取5尾異齒裂腹魚，于無菌環(huán)境下，用解剖剪剪開異齒裂腹魚體腔，取出腸道，用無菌的生理鹽水沖洗腸道外壁及內(nèi)容物。樣品采集后進(jìn)行分類編號(hào)保存，寄至上海美吉生物公司進(jìn)行DNA提取和MiSeq高通量測(cè)序分析。兩組樣品DNA提取完成后，分別將兩組DNA樣品進(jìn)行混合，然后分類編號(hào)，其中野生組異齒裂腹魚為Y1、Y2、Y3，人工養(yǎng)殖組異齒裂腹魚為C1、C2、C3。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析以每個(gè)樣品中的運(yùn)算分類單元作為分類和計(jì)算的依據(jù)。根據(jù)不同的相似度水平，對(duì)所有的序列進(jìn)行運(yùn)算分類單元?jiǎng)澐?，?7%的相似水平下的運(yùn)算分類單元進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。16S細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫使用Silva數(shù)據(jù)庫(Release128 http：∥www.arb-silva.de)。設(shè)置差異顯著水平為0.05，當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異顯著，P≥0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 樣品序列數(shù)目

人工養(yǎng)殖組C1、C2、C3和野生組Y1、Y2、Y3測(cè)得的序列條數(shù)分別為47 068、46 869、40 417、43 194、39 942和46 791(表1)，序列平均長度約為435 bp，符合高通量測(cè)序要求。

表1 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)表

2.2 菌群多樣性分析

2.2.1 稀釋性曲線

以97%相似性水平為標(biāo)準(zhǔn)劃分可操作分類單元運(yùn)算分類單元，其中人工養(yǎng)殖組C1、 C2、C3和野生組Y1、Y2、Y3樣品運(yùn)算分類單元數(shù)據(jù)分別可劃分為302、259、263、751、469、313?；陔S機(jī)選取一定數(shù)量的測(cè)序序列及其對(duì)應(yīng)的運(yùn)算分類單元種類得到的稀釋性曲線，當(dāng)序列數(shù)達(dá)到10 000～40 000時(shí)曲線趨于平坦(圖1)，通過對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平分析，6組樣品的取樣條數(shù)為44 046，表明C1、C2、C3和Y1、Y2、Y3 6組樣品數(shù)據(jù)可靠，測(cè)序數(shù)量接近飽和，能夠真實(shí)有效地反映樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的數(shù)量關(guān)系。

圖1 稀釋性曲線

2.2.2 菌群結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)分析

通過測(cè)序序列計(jì)算出6個(gè)異齒裂腹魚中細(xì)菌多樣性指數(shù)(表2)，6組樣品的覆蓋率均超99%，表明數(shù)據(jù)測(cè)序完整；其中Y1樣品的香農(nóng)指數(shù)最大為5.46，辛普森指數(shù)最小為0.01，說明在野生組異齒裂腹魚Y1樣品魚中腸道的細(xì)菌多樣性最高。對(duì)野生組和人工養(yǎng)殖組組間多樣性指數(shù)差異進(jìn)行t檢驗(yàn)(表3)，得到豐富度指數(shù)Chao(用來估計(jì)樣品中所含運(yùn)算分類單元數(shù)目)和Ace(用來估計(jì)群落中運(yùn)算分類單元數(shù)目)，多樣性指數(shù)香農(nóng)指數(shù)(用來估算樣品中微生物多樣性)和辛普森指數(shù)(用來定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性)的P>0.05，即野生和人工養(yǎng)殖兩種模式下異齒裂腹魚腸道菌群的豐富度和多樣性差異不顯著。

表3 野生組和人工養(yǎng)殖組組間差異檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

表2 基于16S rRNA基因序列的細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.3 菌群結(jié)構(gòu)組成

根據(jù)分類結(jié)果，在6個(gè)異齒裂腹魚腸道樣品中檢測(cè)到的細(xì)菌歸屬于25個(gè)門、54個(gè)綱、111個(gè)目、219個(gè)科、393個(gè)屬，主要門類有變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、藍(lán)細(xì)菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門、衣原體門和軟壁菌門。異齒裂腹魚野生組中Y1樣品中含有10個(gè)門類細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌群為放線菌門(53.89%)，次優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(14.87%)；Y2樣品中含有8個(gè)門類細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(70%)，次優(yōu)勢(shì)菌群為梭桿菌門(15.61%)，未發(fā)現(xiàn)擬桿菌門和軟壁菌門；Y3樣品中含有6個(gè)門類細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(94.82%)，次優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(1.93%)，未發(fā)現(xiàn)綠彎菌門、疣微菌門、衣原體門和軟壁菌門；C1樣品中含有9個(gè)門類細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)細(xì)菌門(61.19%)，次優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(28.57%)；C2樣品中含有9個(gè)門類細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(52.78%)，次優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)細(xì)菌門(37.26%)；C3樣品中含有9個(gè)門類細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)細(xì)菌門(69.97%)，次優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(24.31%)(表4)，在人工養(yǎng)殖組的3個(gè)樣品中均未發(fā)現(xiàn)軟壁菌門。

表4 樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類及相對(duì)豐度 %

通過對(duì)不同樣品中所含菌群豐度最高的10個(gè)運(yùn)算分類單元進(jìn)行分析，有助于了解樣品中所含的主要細(xì)菌類型，因此依據(jù)每個(gè)樣品中相對(duì)豐度最高的前10種運(yùn)算分類單元在屬水平上對(duì)每個(gè)樣品的菌群結(jié)構(gòu)及分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2)。其中，Y1中可分類的細(xì)菌主要是微球菌屬(Micrococcaceae)(4.9%)、暗黃類諾卡氏菌(Nocardioidesfulvus)(3.7%)、微桿菌屬(Microbacterium)(3.7%)、藍(lán)細(xì)菌(2.1%)、鯨桿菌屬(Cetobacterum)(1.3%)、氣單胞菌屬(Aeromonas)(1.1%)、紅桿菌科(0.6%)和希瓦氏菌屬(Shewatiella)(0.6%)；Y2中可分類的細(xì)菌主要是氣單胞菌屬(49%)、鯨桿菌屬(14.8%)、希瓦氏菌屬(9%)、紅桿菌科(0.8%)、FukuN57(0.8%)、α-變形細(xì)菌綱(0.15%)、微球菌屬(0.6%)和暗黃類諾卡氏菌(0.3%)；Y3中可分類的細(xì)菌主要是氣單胞菌屬(92%)、希瓦氏菌屬(0.3%)和微球菌屬(0.1%)；C1中可分類的細(xì)菌主要是藍(lán)細(xì)菌(59%)、紅桿菌科(12.2%)、FukuN57(8%)、瘦鞘絲藻屬(Leptolyngbya)(1.2%)、α-變形細(xì)菌綱(1.2%)、鯨桿菌屬(0.7%)、玫瑰球菌屬(Roseococcus)(0.7%)和Subsection Ⅲ(0.5%)；C2中可分類的細(xì)菌主要是FukuN57(19%)、藍(lán)細(xì)菌(16%)、瘦鞘絲藻屬(15%)、紅桿菌科(12.1%)、Subsection Ⅲ(5.2%)、玫瑰球菌屬(4.2%)、α-變形細(xì)菌綱(4.2%)和希瓦氏菌屬(0.8%)；C3中可分類的細(xì)菌主要是藍(lán)細(xì)菌(70%)、紅桿菌科(10%)、FukuN57(5.9%)、玫瑰球菌屬(1.1%)、α-變形細(xì)菌綱(1%)、單胞菌屬(0.8%)、瘦鞘絲藻屬(0.5%)、鯨桿菌屬(0.4%)和Subsection Ⅲ(0.1%)。

圖2 樣品種屬水平細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分布

2.4 基于運(yùn)算分類單元數(shù)量的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成和系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過在門、屬的分類水平上對(duì)異齒裂腹魚腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在野生和人工養(yǎng)殖條件下，異齒裂腹魚的優(yōu)勢(shì)菌種有所不同?；谝吧M和人工養(yǎng)殖組中全部運(yùn)算分類單元作韋恩圖(圖3)，比較兩種養(yǎng)殖條件下樣品間的差異。異齒裂腹魚腸道樣品有效運(yùn)算分類單元總數(shù)為930，兩種養(yǎng)殖模式下異齒裂腹魚腸道共有運(yùn)算分類單元數(shù)為258個(gè)，人工養(yǎng)殖組特有的運(yùn)算分類單元數(shù)為98個(gè)，野生組特有的運(yùn)算分類單元數(shù)為574個(gè)?？梢娫谝吧腿斯ゐB(yǎng)殖兩種條件下，異齒裂腹魚的腸道內(nèi)均具有一定比例的特有菌群。

圖3 兩種養(yǎng)殖模式下異齒裂腹魚腸道共有運(yùn)算分類單元分析

由樣品聚類樹(圖4)可以看出，野生組和人工養(yǎng)殖組的異齒裂腹魚的腸道菌群進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，說明野生和人工養(yǎng)殖條件下異齒裂腹魚腸道菌群結(jié)構(gòu)相似度較低，存在一定的差異。

圖4 樣品聚類樹

3 討 論

3.1 野生與養(yǎng)殖異齒裂腹魚腸道菌群的豐富度和多樣性差異

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的場(chǎng)所，魚類不同的生理狀態(tài)會(huì)形成不同的菌群結(jié)構(gòu)，而不同的菌群結(jié)構(gòu)會(huì)影響異齒裂腹魚的生理狀態(tài)。本次研究的6個(gè)樣品基于Illumina MiSeq平臺(tái)高通量測(cè)序分析，比較了異齒裂腹魚在野生和人工養(yǎng)殖兩種模式下的腸道菌群結(jié)構(gòu)。通過對(duì)樣品序列數(shù)目分析，可得6個(gè)樣品的有效序列數(shù)為39 942～47 068，可歸為259～751個(gè)運(yùn)算分類單元；通過對(duì)樣品菌群多樣性分析，可知本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，能夠真實(shí)有效地反映出樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的數(shù)量關(guān)系，野生和人工養(yǎng)殖異齒裂腹魚腸道菌群的豐富度和多樣性差異不顯著。關(guān)于淡水魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)已有諸多報(bào)道[11-13]，李學(xué)梅等[14]發(fā)現(xiàn)，在相同飼料和水環(huán)境條件下，銀鯽(Carassiusauratusgibelio)和異育銀鯽的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著差異，二者腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctaus)差別較大；王琴等[15]發(fā)現(xiàn)，鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙魚(Aristichthysnobilis)腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，匙吻鱘(Polyodonspathala)與鰱魚、鳙魚的腸道菌群相似性低。

3.2 野生與養(yǎng)殖異齒裂腹魚腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)分析

本研究結(jié)果顯示，MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)準(zhǔn)確分析了異齒裂腹魚在兩種養(yǎng)殖模式下腸道菌群結(jié)構(gòu)的不同，克服了常規(guī)分離細(xì)菌培養(yǎng)的限制。對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，本研究結(jié)果顯示，野生組異齒裂腹魚腸道的優(yōu)勢(shì)菌群是氣單胞菌屬、微球菌屬和微桿菌屬；人工養(yǎng)殖組腸道優(yōu)勢(shì)菌群是藍(lán)細(xì)菌和紅桿菌。有研究表明魚類腸道細(xì)菌群落的形成受水中細(xì)菌、餌料等影響[16]，而有關(guān)魚類腸道細(xì)菌與養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌之間的關(guān)系尚未明確。Cahill[17]認(rèn)為，腸道菌群是環(huán)境或餌料中存在并且能在腸道內(nèi)繁殖的細(xì)菌群落。Munro等[18]認(rèn)為，魚類腸道菌群的主要來源是所攝取的活餌料而不是養(yǎng)殖水體。相反，部分研究結(jié)果表明，魚類腸道菌群與飼料和水中的細(xì)菌并不相同[19]。異齒裂腹魚為雜食性偏植食性魚類[20]，人工馴化后異齒裂腹魚能夠形成一定的攝食習(xí)性。陳孝煊等[21]指出，水體的鹽度、水溫、微生物種類、魚類攝食的餌料及魚類不同的生理狀態(tài)和不同發(fā)育階段都會(huì)影響魚類消化道菌群結(jié)構(gòu)的形成，水體中的菌群也會(huì)對(duì)魚類的消化道菌群結(jié)構(gòu)造成直接影響[22-23]；王建建等[24]在對(duì)野生和養(yǎng)殖銀鯧(Pampusargenteus)消化道菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，兩者菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異；Holben等[25]也發(fā)現(xiàn)，由于不同的生長環(huán)境，養(yǎng)殖型和野生型鮭魚腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異；李可俊等[26]對(duì)長江河口8種野生魚類的腸道內(nèi)菌群多樣性分析比較后發(fā)現(xiàn)，生活在不同水層及同水層但食性不同的魚類其腸道菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。由此可推測(cè)，異齒裂腹魚的腸道菌群結(jié)構(gòu)隨養(yǎng)殖環(huán)境的差異而發(fā)生改變。

本研究通過對(duì)兩種養(yǎng)殖模式下異齒裂腹魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的深入分析，對(duì)異齒裂腹魚腸道菌群的結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)菌群及多樣性有了一定認(rèn)識(shí)，研究結(jié)果可為異齒裂腹魚的健康養(yǎng)殖及人工養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)調(diào)控技術(shù)構(gòu)建提供理論依據(jù)。